Rotavirus is one of the leading etiological agents of gastroenteritis in young of many species including humans worldwide and is responsible for about 600,000 infant deaths per annum. Rotavirus belongs to the Reoviridae family, and its genome is composed of 11 double-stranded RNA segments that encode six structural proteins and six nonstructural proteins. Rotavirus replication is fully cytoplasmic and occurs within highly specialized regions called viroplasms. NSP2 and NSP5 have been shown to be essential for viroplasm formation and, when co-expressed in uninfected cells, to form viroplasm¬like structures. A recent study suggest a key role for NSP5 in architectural assembly of viroplasms and in recruitment of viroplasmic proteins, containing four structural (VP1, VP2, VP3 and VP6) and two nonstructural (NSP2 and NSP5) proteins. NSP5, the translation product of gene segment 11 has a predicted molecular eight of 21 kDa. NSP5 has been reported to exist in multiple isoforms ranging in size from 28-and 32-35 kDa from a 26-kDa precursor has been attributed to O-glycosylation and hyperphosphorylation. To study different properties of the protein, recombinant NSP5 containing an N-terminal hisidine tag was expressed in bacteria and purified by affinity chromatography. A significant observation was the similarity in phosphorylation property of the bacterially expressed and that expressed in mammalian cells. While the untagged recombinant protein failed to undergo phosphorylation in vitro, addition of His tag or deletions at the N-terminus promoted phosphorylation of the protein in vitro, which is very similar to the reported properties exhibited by the corresponding proteins expressed in mammalian cells. Phosphorylation of NSP5 in vitro is independent of the cell type from which the extract is derived suggesting that the kinases that phosphorylate NSP5 are distributed in all cell types. Among the C-terminal deletion mutants studied, NH-∆C5 and NH-∆C10 were phosphorylated better than full-length NSP5, but NH-∆C25 and NH¬∆C35 showed substantial reduction in the level of phosphorylation compared to full-length NSP5. These results indicate that the C-terminal 30 residues spanning the predicted α-helical domain of NSP5 are critical for its phosphorylation in vitro which is in correspondence with previous findings that C-terminal 21 amino acids of NSP5 direct its insolubility, hyperphosphorylation, and VLS formation. The results revealed that though the tagged full-length and some of the mutants could be phosphorylated in vitro, they are not suitable substrates for hyperphosphorylation unlike the similar proteins expressed in mammalian cells or infected cells. Analysis by western blot and mass spectrometry revealed that the bacterially expressed NH-NSP5 is indeed phosphorylated. It appears that prior phosphorylation in bacteria renders the protein conformationally not amendable for hyperphosphorylation by cellular kinases in vitro. Mutation of the highly conserved proline marginally enhanced its phosphorylation in vitro but the stability of protein is affected. Notably, mutation of S67A, identified as a critical residue for the putative caesin kinase-I and-II pathways of NSP5 phosphorylation, affected neither the phosphorylation nor the ATPase activity of NSP5. These results suggest that bacterially expressed NSP5 by itself has undectable auto-kinase activity and it is hypophosphorylated. Purified recombinant NSP5 has been reported to possess an Mg¬ 2+-dependent ATP-specific triphosphatase activity. The results indicated that deletion of either C-terminal 48 amino acids or N-terminal 33 residues severely affected the ATPase activity of recombinant NSP5, underlying the importance of both N-and C-terminal domains for NSP5 ATP hydrolysis function. NSP5 expressed in rotavirus infected cells exists as inter-molecular disulfide-linked dimeric forms and it appears that the 46 kDa isoforms, that are phosphorylated, corresponds to dimer as revealed by western blotting. Analytical gel filtration analysis of NH-NSP5, NH-ΔN43 and NH-ΔN33-ΔC25 showed most of the proteins in void volume, but an additional peak corresponding to the mass of dimeric species further supports that NSP5 is basically a dimer that undergoes oligomerization. Analysis by sucrose-gradient fractionation revealed that NH-NSP5 and NH-ΔN43 proteins were mainly distributed in the lower fraction of the gradient suggesting the existence of high molecular weight complexes or higher oligomers. The multimeric nature of NSP5 and its mutants was further confirmed by dynamic light scattering which suggests that high molecular weight complexes are of homogenous species. The correlation curves showed a low polydispersity distribution and a globular nature of recombinant NH-NSP5 proteins. The present results clearly demonstrate that dimer is the basic structural unit of NSP5 which undergoes oligomerization to form a complex consisting of about 20-21 dimers. The nonstructural protein 5 is hyperphosphorylated in infected cells and cellular kinases have been implicated to be involved in its phosphorylation. NSP5 contains multiple consensus sites for phosphorylation by several kinases, but the cellular kinases that specifically phosphorylate NSP5 in infected cells are yet to be identified. Previous studies from our laboratory using signaling pathway inhibitors revealed that recombinant NH¬NSP5 and its deletion mutants can be phosphorylated in vitro by purified cellular kinases and by mammalian cell extracts. These studies also showed the involvement of PI3K-Akt and MAPK signaling pathways in NSP5 phosphorylation and a negative role for GSK3β in the phosphorylation of bacterially expressed recombinant NSP5 in vitro. In the present work, using phospho-specific anti-Ser9 GSK3β antibody, we observed that GSK3β is inactivated in a rotavirus infected MA104 cells in a strain-independent manner. GSK3β¬specific small interfering RNA (siRNA-GSK3β) reduced GSK3β levels leading to increased level of synthesis of the structural rotavirus protein VP6 and NSP5 hyperphosphorylation compared to control siRNA. The pharmacological kinase inhibitors (LY294002, Genistein, PD98059, and Rapamycin) studies at the concentrations tested did not significantly affect rotavirus infection as seen from the number foci, while U0126 severely affected rotavirus replication. The results clearly demonstrated the importance of the MEK1/2 signaling pathway in the successful replication of rotavirus and NSP5 hyperphosphorylation in rotavirus-infected cells. In contrast inhibition of GSK3β activity by LiCl, increased in general, the number of foci by greater than 2-fold for all viral strains studied. These results suggest that MEK1/2 pathway majorly contributes to GSK3β inactivation in rotavirus infected cells. Thus, our results reveal that rotavirus activates both the PI3K/Akt and FAK/ERK1/2 MAPK pathways and appears to utilize them as a strategy to activate mTOR, and inhibit GSK3β through phosphorylation on serine 9, the negative regulator of rotavirus NSP5 phosphorylation, and thus facilitate translational competence of rotaviral mRNAs during virus replication cycle. It was shown previously in the laboratory by co-immunoprecipitation assay that Hsp70 interacts with rotaviral proteins VP1 and VP4 in rotavirus-infected mammalian cells. In this study, the interactions between Hsp70 with VP1 and VP4 were further evaluated in vitro by GST-pull down assay. It was observed that the N-terminal ATPase and C-terminal peptide-binding domain of Hsp70 is necessary for its direct interaction with VP1 and VP4. The presence of Hsp70 in purified double-and triple-layered virus particles further supported the observed interactions of rotaviral proteins VP1 and VP4 with Hsp70. However, the specific interaction observed between Hsp70 and rotaviral capsid proteins, VP1 and VP4 in viral particles suggests that Hsp70 has an important role during rotavirus assembly which requires further investigation.

Le parvovirus humain Adeno-Associé (AAV) est un Dependoparvovirus qui ne peut accomplir son cycle réplicatif qu’en présence d’un virus auxiliaire tel que l’Adénovirus (AdV) ou le virus de l’Herpès Simplex de type 1 (HSV-1). En absence de virus auxiliaire, l’AAV va persister sous forme épisomale ou intégrée. Cette intégration survient de façon préférentielle dans un locus spécifique, au site AAVS1, présent sur le chromosome 19 du génome humain.Des travaux précédents ont porté sur l’étude du contrôle de la réplication de l’AAV par les facteurs cellulaires de réparation des cassures d’ADN. En particulier, le complexe MRN (Mre11/Rad50/Nbs1), un senseur majeur des cassures de l’ADN double brin (CDB), a été montré comme pouvant inhiber les réplications virales de l’AAV et de l’AdV lors d’une co-Infection. L’AdV est capable de contrer cet effet en induisant la délocalisation et la dégradation de MRN. A l’opposé, MRN participe de façon positive à la réplication de l’HSV-1 et se retrouve localisé dans les centres de réplication viraux (CR) de l’AAV induits par HSV-1. Ceci nous a conduits à explorer plus en détail le rôle de ce complexe sur la réplication de l’AAV en présence d’HSV-1. Les résultats obtenus indiquent, qu’en absence de MRN, la réplication du génome de l’AAV est réduite de façon significative dans des cellules co-Infectées avec le virus HSV-1, sauvage ou muté pour son activité polymérase. Cette diminution est spécifique à l’AAV sauvage car aucune perturbation n’est observée sur la réplication des vecteurs AAV recombinants lorsque MRN est absent. La régulation positive de la réplication de l’AAV par MRN est dépendante de l’activité de pontage de l’ADN exercée par Rad50. De façon intéressante, l’absence de MRN inhibe également de façon significative l’intégration préférentielle de l’AAV au site AAVS1, que ce soit en absence ou en présence d’HSV-1.Ce travail de thèse suggère que le complexe MRN régulerait de façon différentielle la réplication de l’AAV en fonction du virus auxiliaire qui l’accompagne et identifie, pour la première fois, MRN comme un facteur clé pour l’intégration du génome de l’AAV au site AAVS1. / Adeno-Associated Virus (AAV) is a helper dependent Dependoparvovirus that requires co-Infection with adenovirus (AdV) or herpes simplex virus type 1 (HSV-1) to productively replicate. In the absence of the helper virus, AAV can persist in an episomal or integrated form. Integration occcurs preferentially at a specific locus called AAVS1 and based on human chromosome 19.Previous studies have analyzed the DNA damage response induced upon AAV replication to understand how it controls AAV replication. In particular, it was shown that the Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) complex, a major player of the DNA damage response induced by double-Stranded DNA breaks and stalled replication forks, could negatively regulate AdV and AAV replication during co-Infection. AdV counteracts this effect by inducing the delocalization and degradation of MRN. In contrast, MRN favors HSV-1 replication and our previous studies showed that it was recruited to AAV replication compartments that were induced in the presence of HSV-1. In this study we examined the role of MRN during AAV replication induced by HSV-1. Our results indicated that knockdown of MRN significantly reduced AAV DNA replication after co-Infection with polymerase deleted or wild type HSV-1. This reduction was specific of wild type AAV since it did not occur with recombinant AAV vectors. Positive regulation of AAV replication by MRN was dependent on its DNA tethering and nuclease activities. Importantly, knockdown of MRN could also negatively regulate AAV site-Specific integration within the human AAVS1 site, an event which occurred at a significant level during AAV replication induced by co-Infection with HSV-1. Altogether, this work demonstrates that MRN can differentially regulate AAV replication depending on the helper virus which is present and identifies a new function of this DNA repair complex during site-Specific integration of the AAV genome.

Les virus des hépatites B et C (VHB et VHC) entretiennent des liens étroits avec le métabolisme lipidique des hépatocytes. Ainsi, la réplication du VHB est dépendante de certains récepteurs nucléaires hépatiques, tels que HNF4α et PPARα, impliqués dans ce métabolisme. L’assemblage des particules virales du VHC dépend lui de la voie de synthèse des lipoprotéines de très faible densité (VLDL) et le virus circule dans le sang sous forme de lipo-viro-particules associé notamment à l’apolipoprotéine B, un composant essentiel des VLDL. Dans ce travail, nous avons d’abord étudié le rôle de FXRα, le récepteur nucléaire des sels biliaires, sur la réplication du VHB. Nous avons montré, in vitro, que les sels biliaires, via FXRα, activaient le promoteur de Core du VHB qui contrôle le niveau de réplication virale. Puis dans l’étude des liens entre les lipoprotéines et le VHC, nous avons montré que l’apoB présente sur certaines particules virales jouaient un rôle important dans l’infectiosité du virus in vitro, et que la protéine Cideb, présente en surface des gouttelettes lipidiques et impliquée dans l’assemblage des VLDL, était impliquée dans l’association du VHC avec l’apoB et influençait l’infectiosité des virions sécrétés. De plus nous avons mis en évidence l’existence de particules sub-virales chez les patients infectés, de nature lipoprotéique mais ne portant que les protéines d’enveloppes du VHC. Tous ces résultats renforcent l’idée d’une adaptation du VHB et du VHC au métabolisme lipidique hépatique. Les bénéfices éventuels qu’en retirent ces deux virus, ainsi que l’existence de possibles thérapeutiques anti-virales ciblant le métabolisme lipidique, restent à explorer / Hepatitis B and C viruses (HBV and HCV) infections are tightly linked with hepatic lipid metabolism. HBV replication depends on specific nuclear receptors, such as HNF4α and PPARα, both implicated in this metabolism. HCV assembly depends on the synthesis of Very-Low-Density Lipoproteins (VLDL), and the virus circulates in the blood as lipo-viral-particles associated in particular with apoB, an essential component of VLDL. In this study, we first studied the influence of FXRα, the nuclear receptor for bile acids, on HBV replication. We showed that, in vitro, bile acids, via FXRα, were able to activate the HBV Core promoter which controls the level of viral replication. Then, in the study of the interactions between HCV and lipoproteins, we demonstrated that apoB, which is associated with a proportion of viral particles, played an important role in HCV infectivity in vitro, and that Cideb, a protein involved in VLDL assembly, was implicated in the association between HCV and apoB and influenced the infectivity of secreted viral particles. Finally, we showed that, besides HCV infectious particles, sub-particles bearing only viral envelope glycoproteins circulated in the blood of infected patients. Interactions of HBV with the metabolism of bile acids, and of HCV with the metabolism of lipoproteins, are two examples of adaptation of a parasite to its host. The potential benefits from these interactions are still to be determined, as well as the possibility to develop anti-viral strategies targeting lipid metabolism

Das Humane Cytomegalievirus (HCMV) ist ein ubiquitäres Pathogen, welches den Metabolismus der Wirtszelle auf vielfältige Weise manipuliert, um seine eigene Vermehrung zu begünstigen. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass auch das Ubiquitin-Proteasom-System in die HCMV-Replikation involviert ist. So konnte zunächst gezeigt werden, dass die Chymotrypsin-ähnliche (CT-L) Aktivität des konstitutiven Proteasoms in HCMV-infizierten Zellen signifikant erhöht ist. Wurde die CT-L Proteasomaktivität durch Proteasominhibitoren (PI) blockiert, so hatte dies die Hemmung der HCMV-Replikation zur Folge. Die Charakterisierung des Einflusses von PI auf die virale Proteinexpression ergab, dass bei niedriger MOI (MOI 0.1) deutlich verringerte Mengen der sehr frühen Proteine vorlagen, dieser Effekt jedoch bei hoher MOI (ab MOI 1) aufgehoben war. Die Expression früher Proteine war MOI-unabhängig reduziert. Hingegen war die Expression der späten Proteine MOI-unabhängig vollständig unterdrückt. Studien mit dem Nukleosidanalogon BrdU ergaben zudem, dass die de novo Synthese viraler DNA blockiert war. Um erste Hinweise auf den Wirkungsmechanismus von PI zu erhalten, wurde untersucht, ob der Transkriptionsfaktor NF-kappaB oder zelluläre Transkriptionsrepressoren wie z.B. hDaxx am anti-HCMV-Effekt beteiligt sind. Durch die Charakterisierung einer Virusmutante mit Deletion der NF-kappaB-Bindestellen im MIE-Enhancer/Promotor konnte gezeigt werden, dass der antivirale Effekt von PI nicht auf der Hemmung der Aktivierung von NF-kappaB beruht. Experimente mit hDaxx-knockdown Zellen ergaben hingegen, dass die Stabilisierung des Transkriptionsrepressors hDaxx partiell zum anti-HCMV-Effekt von PI beiträgt. Darüber hinaus müssen jedoch weitere virale oder zelluläre Zielproteine existieren, deren Beeinflussung durch PI kritisch für die Virusreplikation ist. Zusammenfassend stellt das Proteasom somit einen neu identifizierten potentiellen Angriffspunkt für die anti-HCMV-Therapie dar. / The Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous pathogen that manipulates many aspects of the host cell metabolism to enhance viral replication. This work demonstrates that the ubiquitin-proteasome system is also involved in HCMV replication. First of all, the chymotrypsin-like (CT-L) activity of the constitutive proteasome was significantly increased in HCMV infected cells. In the presence of proteasome inhibitors (PI) viral replication was efficiently blocked. Characterisation of the influence of PI on viral protein expression showed that immediate early protein expression was clearly reduced at low MOI (MOI 0.1); however, this effect was abolished at high MOI (starting from MOI 1). Expression of early proteins was significantly decreased independently of the MOI used for infection. In contrast, late protein expression was completely suppressed at both low and high MOI. Additionally, studies using the nucleoside analogue BrdU showed that PI block the de novo synthesis of viral DNA. In order to gain insight into the working mechanism of PI the involvement of the transcription factor NF-kappaB and cellular repressors of transcription (e.g. hDaxx) in the antiviral effect of PI was examined. Studies using a mutant virus carrying deletions of the NF-kappaB binding sites in the MIE-enhancer/promoter revealed that the anti-HCMV effect of PI is not due to inhibition of NF-kappaB activation. Analyses using hDaxx-knockdown cells showed that stabilisation of the transcriptional repressor hDaxx partially contributes to the antiviral effect of PI. However, the existence of additional viral or cellular target proteins of PI is very likely. In summary, the proteasome thus represents a newly identified and promising target for anti-HCMV therapy.

Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infectés par plus d’un microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathogènes qui peuvent infecter de manière simultanée les porcs. L’objectif du présent projet est d’étudier l’interaction entre ces pathogènes. Les deux lignées cellulaires permissives au VSRRP utilisées sont les cellules « St-Jude porcine lung » (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont été pré-infectées avec le VSRRP, puis infectées avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate déshydrogénase a montré qu’une co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae comparée à une infection simple augmente significativement la cytotoxicité. Dans les mêmes conditions expérimentales, une pré-infection virale ne semble pas affecter l’adhérence d’A. pleuropneumoniae aux cellules. À l’aide de tests ELISA, il a été possible de démontrer la production d’IL-8 et d’INF-γ lorsqu’il y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-α, d’IL-6 et d’IL-10, ces cytokines ne sont pas détectées en présence des pathogènes étudiés. Des expériences de pré-infection bactérienne suivie d’infection virale ont également été réalisées. Il a été démontré que la pré-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la réplication du VSRRP chez la lignée cellulaire SJPL, mais cela n’est pas observé avec la lignée cellulaire MARC-145. Les résultats préliminaires ont démontré que cette diminution de la réplication serait causée par une molécule de faible poids moléculaire sécrétée dans le surnageant bactérien et celle-ci serait résistante à la chaleur. Les lignées cellulaires SJPL et MARC-145 représentent de bons modèles pour l’étude des infections mixtes des voies respiratoires du porc. / The respiratory tract of pigs is often colonized by more than one pathogen during an infection. Actinobacillus pleuropneumoniae and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are pathogens that can be associated with co-infection. The objective of this project was to study interactions between A. pleuropneumoniae and PRRSV during mixed infection. The PRRSV-permissive cell lines, St-Jude porcine lung (SJPL) and MARC-145 were used. In the first part, cells were pre-infected with PPRSV followed by an infection with A. pleuropneumoniae. Results obtained with a lactate dehydrogenase test showed that a co-infection resulted in a greater cytotoxicity then the single infections. The adherence of A. pleuropneumoniae to non-infected or PRRSV-infected cells was similar. Based on ELISAs tests, it was found that the cells produced IL-8 and IFN-γ when they were infected, but TNF-α, IL-6 and IL-10 were not detected. In the second part, cells were pre-infected with A. pleuropneumoniae followed by viral infection. The results showed that a pre-infection with A. pleuropneumoniae decreased PRRSV replication in SJPL cells, whereas A. pleuropneumoniae did not impair PRRSV replication in MARC-145 cells. Preliminary results indicate that a molecule secreted by A. pleuropneumoniae is the factor impairing PRRSV replication in SJPL cells. The factor is probably a small molecular weight molecule that is heat-resistant. In conclusion, both cell lines allowed the study of A. pleuropneumoniae and PRSSV interactions during a mixed-infection and these models could be adapted to study interactions of other swine pathogens.

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral. / Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infectés par plus d’un microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathogènes qui peuvent infecter de manière simultanée les porcs. L’objectif du présent projet est d’étudier l’interaction entre ces pathogènes. Les deux lignées cellulaires permissives au VSRRP utilisées sont les cellules « St-Jude porcine lung » (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont été pré-infectées avec le VSRRP, puis infectées avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate déshydrogénase a montré qu’une co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae comparée à une infection simple augmente significativement la cytotoxicité. Dans les mêmes conditions expérimentales, une pré-infection virale ne semble pas affecter l’adhérence d’A. pleuropneumoniae aux cellules. À l’aide de tests ELISA, il a été possible de démontrer la production d’IL-8 et d’INF-γ lorsqu’il y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-α, d’IL-6 et d’IL-10, ces cytokines ne sont pas détectées en présence des pathogènes étudiés. Des expériences de pré-infection bactérienne suivie d’infection virale ont également été réalisées. Il a été démontré que la pré-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la réplication du VSRRP chez la lignée cellulaire SJPL, mais cela n’est pas observé avec la lignée cellulaire MARC-145. Les résultats préliminaires ont démontré que cette diminution de la réplication serait causée par une molécule de faible poids moléculaire sécrétée dans le surnageant bactérien et celle-ci serait résistante à la chaleur. Les lignées cellulaires SJPL et MARC-145 représentent de bons modèles pour l’étude des infections mixtes des voies respiratoires du porc. / The respiratory tract of pigs is often colonized by more than one pathogen during an infection. Actinobacillus pleuropneumoniae and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are pathogens that can be associated with co-infection. The objective of this project was to study interactions between A. pleuropneumoniae and PRRSV during mixed infection. The PRRSV-permissive cell lines, St-Jude porcine lung (SJPL) and MARC-145 were used. In the first part, cells were pre-infected with PPRSV followed by an infection with A. pleuropneumoniae. Results obtained with a lactate dehydrogenase test showed that a co-infection resulted in a greater cytotoxicity then the single infections. The adherence of A. pleuropneumoniae to non-infected or PRRSV-infected cells was similar. Based on ELISAs tests, it was found that the cells produced IL-8 and IFN-γ when they were infected, but TNF-α, IL-6 and IL-10 were not detected. In the second part, cells were pre-infected with A. pleuropneumoniae followed by viral infection. The results showed that a pre-infection with A. pleuropneumoniae decreased PRRSV replication in SJPL cells, whereas A. pleuropneumoniae did not impair PRRSV replication in MARC-145 cells. Preliminary results indicate that a molecule secreted by A. pleuropneumoniae is the factor impairing PRRSV replication in SJPL cells. The factor is probably a small molecular weight molecule that is heat-resistant. In conclusion, both cell lines allowed the study of A. pleuropneumoniae and PRSSV interactions during a mixed-infection and these models could be adapted to study interactions of other swine pathogens.

L'infection au virus de l'hépatite B (VHB) est étroitement liée au métabolisme énergétique hépatique. La réplication du virus est contrôlée en principal par des facteurs de transcription et récepteurs nucléaires tels que PPARa, HNF4a et Foxül, impliqués dans ce métabolisme. Ainsi, la réplication du virus est augmentée par la privation de nutriments et le stress énergétique en modèles cellulaires, et par le jeûne, en modèles murins. PGC-la, un régulateur majeur de la réponse métabolique adaptative au jeûne, est impliqué dans l'augmentation de la transcription du VHB par son interaction avec plusieurs facteurs de transcription. Il est connu que le récepteur des acides biliaires, FXRa, qui est capable d'activer le promoteur de Core du VHB, est co-activaté par PGC-la. Un autre acteur important dans l'adaptation métabolique à la privation d'énergie est la protéine déacétylase SIRTl. Lorsqu'il est activé, SIRTl hépatique est capable de désacétyler et activer autant PGC-la que FXRa. Ces données nous ont amenés à émettre l'hypothèse que SIRTl pourrait coopérer avec FXRa et PGC-la pour augmenter la transcription du VHB. Dans un premier travail, nous avons donc étudié le rôle de la coopération de ces trois facteurs métaboliques dans la réplication du virus. Ça nous a permis de décrire un nouveau réseau métabolique, composé de FXRa, PGC-la et SIRTl, qui régule l'activité transcriptionnelle du VHB. Nous avons montré que SIRTl augmente l'activité du promoteur de Core par l'intermède d'autre facteurs, parmi lesquels, FXRa. Nous avons en outre observé que la fonction de déacétylase de SIRTl était nécessaire pour l'amplification de l'effet de FXRa sur VHB promoteur de Core. Une autre cible de SIRTl, connue pour son activité co-activatrice sur FXRa, est PGC-la. Grâce à une série d'expériences de surexpression et suppression, nous avons montré que non seulement la co-activation de FXRa par PGC-la est potentialisée par SIRTl, mais la présence de PGC-la est nécessaire pour l'effet de SIRTl sur l'activation du promoteur de Core VHB induite par FXRa. Ces données suggèrent que FXRa, PGC-la et SIRTl coopèrent dans la modulation de l'activité transcriptionnelle du promoteur de Core. Nous avons ensuite confirmé nos observations initiales et avons montré que l'activation de l'axe SIRTl/PGC-la/FXRa induit la transcription de l'ARN de VHB dans des lignées cellulaires d'origine hépatique et non-hépatique. Ces résultats renforcent l'idée que la réplication du VHB peut être modulée en fonction de l'état nutritionnel. Les rapports des études précédentes menées in vitro et sur des modèles animaux suggèrent que la transcription du VHB est contrôlée de la même manière que les gènes de la néoglucogenèse. Notre hypothèse a été que chez l'homme, la réplication du VHB montrerait des fluctuations diurnes, selon les périodes de la journée de jeûne et de réalimentation. Le but de la deuxième étude a été donc de déterminer si la charge viral du VHB plasmatique montre des variations importantes tout au long du nichthemeron chez les patients chroniquement infectés par VHB, avec une réplication virale active [etc...] / Hepatitis B virus (HBV) infection is tightly linked with hepatic fuel metabolism. HBV replication depends on the activity of several liver-enriched nuclear receptors and transcription factors, such as PPARa, HNF4a, and Fox01, involved in the metabolic adaptive response to fasting. In the first part of our work, we identified a metabolic subnetwork that enhances the activity of HBV core promoter. FXRa (NR1H4), PPAR gamma coactivator 1a and SIRT1, the members of this regulatory axis, cooperate to increase HBV transcription. The three molecules are themselves key factors of liver metabolism, linking HBV replication to complex metabolic cues, such as energy status and nutrient availability during the fasting-refeeding cycles. We then observed the existence of a circadian cycle of HBV replication in humans, underlining the role of nutrient availability in the modulation of HBV replication, previously predicted by experimental models. The second part of the work focused on the plasma cell-free nucleic acids as potential biomarkers in chronic viral hepatitis. Due to the multiple links between HBV replication and cellular factors involved in fuel metabolism, we hypothesized that plasma mRNAs corresponding to these factors may constitute potential biomarkers for chronic hepatitis B. We successfully detected more than 30 plasma mRNA sequences corresponding to enzymes, transporters, nuclear receptors and transcription factors involved in fatty acids synthesis and oxidation, cholesterol synthesis, transport and excretion, and energy sensing and expenditure. The circadian variation and the multiple correlations in the expression patterns of these plasma transcripts are similar to those previously described in cells both in vitro and in vivo. This suggests that cell- free mRNAs may provide a "virtual biopsy" of the transcriptional status of the organism. Moreover, we found significant differences in the plasma mRNA profiles of HBV carriers compared with healthy controls, similar to those found in experimental models of infection, suggesting that these transcripts may also serve as biomarkers of liver disease. Further research is warranted to shed new light on the complex relationship between HBV life cycle and host lipid-carbohydrate-fuel metabolism and may lead to the identification of both actionable targets in antiviral therapy, and putative biomarkers in chronic hepatitis B