Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. 2006. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Faculdade de Ciências da Saúde. Universidade Fernando Pessoa

Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Los vectores virales son un sistema de transferencia génica muy efectivo. Es por esto su amplio uso para terapia génica. Dentro del desarrollo de una terapia génica un punto muy importante a considerar es la producción y purificación de los vectores virales que transportarán dicha terapia. Su producción y purificación debe ser escalable para lograr su uso en las distintas fases de los ensayos clínicos y su posterior comercialización. El presente estudio aborda distintas etapas de la producción y purificación de vectores virales adenovirus y adenoasociados, centrándose en su uso para una terapia génica contra el alcoholismo. Se realizó la purificación de los vectores adenovirales rAd5V que contenían la secuencia de ARN antisentido de la enzima ALDH2, y se desarrolló un pre-diseño de la purificación como base para la producción de estos vectores a mayor escala para ensayos pre-clínicos. Se pudo concluir que la columna CIM QA1 tiene rendimientos tan buenos como la columna Q-Sepharose, la que ha sido muy usada para esta aplicación. Sin embargo, la columna CIM QA1 puede usar flujos hasta 10 veces mayores que la columna Q-Sepharose XL, manteniendo su rendimiento. Esto implica en una reducción del tiempo de la purificación en forma considerable. Además, se desarrolló la producción y purificación de un vector alternativo para la terapia contra el alcoholismo, el vector usado fue el vector viral Adenoasociado AAV para sus serotipos 2 y 8. Se realizó la producción de los vectores AAV2 y AAV8 y su purificación se realizó usando la columna monolítica CIM QA-1.Se pudo determinar la capacidad de la columna para cada uno de los serotipos de AAV, con una capacidad de 5,2x108 vg/ml para AAV2 y 1,8x1010vg/ml para AAV8. También se desarrolló un método simplificado para la producción de vectores AAV. El nuevo método simplificado utiliza una doble transfección en una línea celular recombinante de HEK293F, la que puede ser específica para cada terapia génica. Para este estudio, se desarrolló un prototipo del nuevo método utilizando el gen de la proteína GFP como gen de interés. Se logró desarrollar una línea celular HEK293F recombinante. Se logró producir vectores AAV2 y AAV8 con el nuevo método de doble transfección. Sin embargo, la producción fue 40 y 24 veces menor para AAV2 y AAV8 que el método convencional. A pesar que la visualización con TEM no entregó señales claras de problemas en la cápside, los vectores producidos con el nuevo método no fueron infectivos. Esto puede ser por una mala encapsidación de los vectores virales en el momento de la producción. Además, es necesario optimizar el método de producción con la proporción correcta de los tres elementos esenciales para la producción de AAV (ITR-Gen, Rep/Cap y genes ayudantes).

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / El alcoholismo es un grave problema socio-económico. El costo asociado al abuso del alcohol se ha estimado en 1.300 millones de dólares para la economía chilena y en 185 billones para Estados Unidos, costo que se debe principalmente a la perdida de la productividad, tratamientos médicos y costos sociales. El etanol es metabolizado en el hígado en dos pasos. El primero depende de la enzima Alcohol deshidrogenasa (ADH) y el segundo de la enzima Aldehído deshidrogenasa (ALDH2). En individuos de la población asiática existe una alta prevalencia de una mutación en el gen de la ALDH2, por lo que tienen una capacidad reducida para metabolizar el acetaldehído, produciendo fuertes efectos como mareos, hipotensión, palpitaciones, etc. Esto resulta en un rechazo al consumo de etanol y protección frente al alcoholismo. Este fenómeno sugiere que la modulación de la expresión de la ALDH2 mediante tecnologías genéticas puede resultar en un fenotipo similar. Por lo tanto, la terapia génica se presenta como una alternativa atractiva para el tratamiento del alcoholismo, simulando el fenotipo asiático, mediante la inhibición específica de la enzima ALDH2, utilizando vectores virales codificantes de un shRNA como herramienta silenciadora. Los virus adeno-asociados (AAV) han sido utilizados como poderosas herramientas para la transferencia de genes en estudios in vivo, en modelos animales y en ensayos clínicos en humanos, con resultados prometedores. La única terapia génica aprobada en el mundo occidental para comercialización es Glybera y está formulada con vectores AAV. En este trabajo se utilizaron vectores scAAV2 que codifican un ALDH2 shRNA, para silenciar la expresión del gen de ALDH2 en líneas celulares humanas. Las líneas celulares HEK-293 y HepG2 se infectaron con el virus scAAV2/shRNA resultando en una reducción de la expresión de ALDH2 a nivel de RNA y proteínas en las dos concentraciones virales probadas (1x104 y 1x105 vg/cel) cada una probada en dos periodos de tiempos. En ambas líneas celulares los niveles de RNA de ALDH2 se redujeron en un 90% y la expresión a nivel proteico se inhibió en un 90% y 52% respectivamente, cinco días después de la infección. Las células HepG2 VL17A (ADH+) tratadas y expuestas a etanol mostraron un aumento de hasta el 50% en los niveles de acetaldehído. Estos resultados sugieren que la terapia génica puede ser una herramienta útil para el tratamiento del alcoholismo, a través del silenciamiento de la expresión de ALDH2 utilizando tecnología shRNA entregada las células por vectores AAV.

La diabetes de tipo 1 resulta de la destrucción autoinmune de las células ß pancreáticas, que conduce a una falta en la producción de insulina y la consiguiente hiperglucemia. La terapia sustitutiva con inyecciones subcutáneas de insulina permite a los pacientes llevar un vida activa, sin embargo esta terapia es imperfecta y no evita la aparición de graves complicaciones secundarias. El transplante de páncreas o islotes pancreáticos se ha realizado con éxito en algunos pacientes, sin embargo la escasez de donantes impide que esta terapia se pueda aplicar a todos los individuos diabéticos. Por ello, una gran cantidad de esfuerzos se han centrado en la diferenciación de células madre, embrionarias o adultas, en células ß. Las células de la médula ósea (BMC) poseen propiedades de célula madre adulta y además son fáciles de obtener, por ello se han propuesto como una fuente alternativa para la formación de nuevas células ß. El factor de crecimiento a la insulina de tipo I (IGF-I) participa en la regeneración muscular e incrementa la atracción y diferenciación de BMC en el músculo dañado. Además, la expresión de IGF-I específicamente en células ß de ratones diabéticos es capaz de regenerar la masa de células ß. Así, el primer objetivo de este trabajo fue estudiar la capacidad de la expresión de IGF-I en las células ß para atraer y diferenciar las BMC en nuevas células ß, tanto en ratones sanos como en ratones diabéticos. Con esta finalidad se transplantó la médula ósea de ratones transgénicos que expresaban la proteína verde fluorescente (GFP) constitutivamente, en los ratones transgénicos para IGF-I. Los resultados obtenidos demostraron que ni la sobreexpresión de IGF-I en células ß, ni la inducción de diabetes mediante estreptozotocina fueron causa suficiente para atraer y diferenciar las BMC en células ß pancreáticas in vivo. Estos datos sugerían que la regeneración del páncreas endocrino observada en los ratones transgénicos para IGF-I no era mediada por las BMC, indicando que la replicación de células ß preexistentes o bien la diferenciación a partir de precursores no hematopoyéticos son los mecanismos que actuarían en la regeneración de las células ß mediada por IGF-I.La diabetes se ha intentando curar mediante estrategias de terapia génica, sin embargo hasta el momento no se ha conseguido ninguna terapia efectiva. La recuperación completa del paciente diabético de tipo 1 requeriría la regeneración de las células ß. Una aproximación para conseguir este objetivo es la manipulación genética del páncreas endocrino in vivo, con la finalidad de expresar factores que induzcan replicación o neogénesis de las células ß y además contrarrestar la respuesta inmune. Sin embargo, el riesgo de inducir pancreatitis al manipular el páncreas es elevado, y por tanto se han realizado escasos intentos de modificar genéticamente este órgano hasta la fecha. Por ello, nuevas aproximaciones de transferencia génica in vivo son necesarias para avanzar en el desarrollo de nuevas aproximaciones de terapia génica para la diabetes. En este trabajo hemos estudiado la eficiencia de diferentes vectores virales y diferentes vías de administración para transducir el páncreas in vivo, tanto en ratones como en perros. En primer lugar, observamos que las células ß pancreáticas fueron transducidas eficientemente por adenovirus inyectados vía sistémica en ratones a los cuales se les había cerrado la circulación hepática. Este resultado obtenido con vectores adenovirales de primera generación también se obtuvo cuando usamos vectores adenovirales de última generación, también llamados gutless. Además de vectores adenovirales, también se estudio la capacidad de transducir el páncreas de los vectores adenoasociados de serotipo 8 (AAV8). Así, se demostró que la vía de administración de los vectores AAV8 por el conducto pancreático era más efectiva que la administración de estos vectores por vía endovenosa o intraperitoneal.El páncreas del perro presenta una estructura lobular y una vascularización similar al humano, por tanto constituye un buen modelo para ensayar estrategias de transferencia génica a páncreas. En este trabajo se estudió la capacidad de los vectores adenovirales para transferir genes a páncreas in vivo en animales sometidos a un clamp circulatorio de los vasos pancreáticos. Adenovirus con el gen marcador de la ß-galactosidasa se inyectaron en la vena pancreaticoduodenal y el clamp se mantuvo durante 10 minutos. Usando esta técnica se consiguió transducir células acinares, ductales y también islotes pancreáticos sin evidencias de daño pancreático. Esta técnica también se ensayó con éxito en un perro diabético.Por consiguiente, la metodología descrita en este trabajo puede ser usada para transducir el páncreas in vivo, ya sea en ratones o en perros, con la finalidad de estudiar la biología de las células ß o bien para desarrollar nuevas aproximaciones terapéuticas para la diabetes mellitus y otras enfermedades pancreáticas. / Type 1 diabetes is characterized by progressive destruction of pancreatic ?-cells, resulting in insulin deficiency and hyperglycemia. Insulin replacement therapy allows diabetic patients to lead active lives, but this therapy is imperfect and does not prevent development of severe secondary complications. Transplantation of pancreatic tissue or islets has been performed successfully in a limited numbers of patients. However, the shortage of donors is a primary obstacle that prevents this treatment from becoming more widespread. Therefore, many efforts have been focused on differentiating embryonic or adult stem cells into ß-cells. Bone marrow cells (BMCs) are an important source of easily procurable adult stem cells and have been proposed as an alternative source of ß-cells. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) participates in skeletal muscle regeneration and enhances the recruitment of BMCs at the sites of muscle injury. In addition, IGF-I expression in ß-cells of diabetic transgenic mice regenerates pancreatic ß-cell mass. Therefore one of the objectives of this study was to investigate whether IGF-I expression in ß-cells could increase BMC recruitment and differentiation into ß-cells under steady-state conditions or after STZ treatment. To this end, BMCs from ß-actin/GFP transgenic donor mice were transplanted into IGF-I transgenic mice. Our experiments have demonstrated that IGF-I overexpression or STZ-induced pancreatic damage were not sufficient to recruit and differentiate GFP-labelled BMCs into ß-cells in vivo, indicating that these cells did not contribute to the endocrine pancreas regeneration observed in IGF-I transgenic mice. These data suggest that replication of pre-existing ß-cells and/or differentiation from non-BMC precursors is the most likely mechanism for IGF-I-mediated regeneration.Diabetes mellitus has long been targeted, as yet unsuccessfully, as being curable with gene therapy. Recovery from type 1 diabetes requires ß-cell regeneration. One approach to do so is by genetically engineering the endocrine pancreas in vivo to express factors that induce ß-cell replication and neogenesis and counteract the immune response. However, the pancreas is difficult to manipulate and pancreatitis is a serious concern, which has made effective gene transfer to this organ elusive. Thus, new approaches for gene delivery to the pancreas in vivo are required. In this study we have examined different viral vectors and routes of administration in rodents and also in large animals, to determine the most efficient method to deliver exogenous genes to the pancreas. First, we observed that pancreatic ß-cells were efficiently transduced to express ß-galactosidase after systemic injection of adenoviral vectors in mice with clamped hepatic circulation. This was true both for first generation as well as for helper-dependent adenoviral vectors. In addition to adenoviruses, we have compared the ability of AAV vectors to transduce the pancreas in vivo after intravascular, intraperitoneal or intraductal delivery, being the last the most efficient route of administration. Like the human pancreas, the canine pancreas is compact, with similar vascularization and lobular structure. It is therefore a suitable model in which to assess gene transfer strategies. Here we examined the ability of adenoviral vectors to transfer genes into the pancreas of dogs in which pancreatic circulation has been clamped. Adenoviruses carrying the ß-galactosidase (ß-gal) gene were injected into the pancreatic-duodenal vein and the clamp was released 10 min later. These dogs showed ß-gal-positive cells throughout the pancreas, with no evidence of pancreatic damage. ß-gal was expressed mainly in acinar cells, but also in ducts and islets. ß-gal expression in the exocrine pancreas of a diabetic dog was also found to be similar to that observed in healthy dogs. Thus, the methodology described herein may be used to transfer genes of interest to murine and canine pancreas in vivo, both for the study of islet biology and to develop new gene therapy approaches for diabetes mellitus and other pancreatic disorders.

El Ad es el vector más utilizado en ensayos clínicos con humanos. Para evitar la respuesta inmune celular inducida por los Ad de 1ª y 2ª generación, se han generado los vectores de 3ª generación, también llamados gutless o helper dependientes. Para producir estos vectores se necesitan tres elementos fundamentales: un Ad gutless con un gen terapéutico o marcador de interés; un Ad helper que aporte las proteínas virales necesarias in trans y; una línea celular permisiva para la producción de Ad. Los Ad gutless, al no contener ninguna región viral codificante, no generan respuesta inmune celular y tienen una capacidad de hasta 36 Kpb. Se ha demostrado que la expresión de los genes que incorporan puede durar toda la vida del organismo. Sin embargo, si bien presentan grandes ventajas, su uso en ensayos clínicos con humanos todavía no ha sido viable debido a dos grandes inconvenientes: la contaminación por Ad helper y su producción a gran escala. Para solventar el problema de la contaminación por Ad helper, en este trabajo se propone un nuevo sistema de generación de Ad gutless basado en la recombinasa ?C31-attB/attP. Los Ad helper generados llevan flanqueada su señal ? por las secuencias attB/attP. ?C31 es una recombinasa unidireccional con lo que una vez realizada su función, al escindir la señal de empaquetamiento, evita la reacción inversa. Esta característica supone una ventaja frente a otras recombinasas como Cre ó FLPe. Sorprendentemente, al incorporar la secuencia attB entre el extremo ITR del Ad y su señal de empaquetamiento, los Ad helper generados alargan su ciclo viral hasta las 56-60 horas, sin embargo, ello no afecta la replicación eficiente del genoma viral y la producción de proteínas virales. Asimismo, se ha demostrado que tanto el proceso de empaquetamiento como el de la maduración de la partícula viral están afectados. Se ha observado que la clonación de una segunda señal de empaquetamiento en el extremo 3' normaliza los niveles de producción de los Ad controles, confirmando así que el genoma no queda retenido en ninguna región nuclear. Ensayos de EMSA han mostrado que diferentes proteínas celulares se unen a la secuencia attB y probablemente la unión de una de ellas impida el correcto empaquetamiento del genoma adenoviral. Por todo ello, el empaquetamiento diferencial por tiempo de los Ad helper-attB/attP generados ha sido aprovechado para la producción de Ad gutless acotando su producción a las 36 horas (tiempo en el que un Ad control completa su ciclo viral). Sin embargo, en las producciones de Ad gutless, los niveles de contaminación por Ad helper fueron elevados y éstos aumentaban significativamente en los sucesivos pasos de amplificación. El análisis del extremo 5' del Ad helper confirmó que éste recombinaba con el Ad gutless por la señal de empaquetamiento perdiendo las secuencias de recombinación y así su capacidad de empaquetarse más lentamente. Sin embargo, la inversión de la señal de empaquetamiento supuso la demostración de que este efecto es fácilmente evitable lo que convierte al Ad helper Ad5/FC31.Cre.?R en una buena herramienta para la producción de Ad gutless. / Adenovirus is the most used vector in human clinical trials. In order to overcome cellular inmune response evoked by first and second generation adenovirus, third generation, also called gutless or helper-dependent adenovirus have been generated. Gutless adenovirus production needs three basic elements: a gutless adenovirus with a therapeutic or marker gene; a helper adenovirus which provide all viral proteins in trans and; a permisive cell line to produce adenovirus. Gutless adenovirus, without any codificant viral region, don't evoke cellular inmune response and can incorporate DNA inserts up to 36 Kb. It has been reported that the expresion of incorporated genes can last the whole life of the organism. Nevertheless, its use in human clinial trials is not suitable due two important inconvenients: helper adenovirus contamination and up-scale processes. To solve helper adenovirus contamination problem, this present work propose a new adenovirus gutless generation system based on ?C31-attB/attP recombinase. Helper adenovirus generated have flanked its packaging signal (?) by attB/attP sequences. ?C31 is an unidirectional recombinase which avoid reverse reaction. This characteristic is an important advantage in front of other recombinases such as Cre or FLPe. Surprisingly, attB sequence incorporated between Ad-ITR and ? lengthens adenovirus cycle up to 56-60 hours, However, this effect don't affect efficient genome replication or protein shyntesis. Moreover, it has been shown that packaging and maturation processes are affected. It has been observed that the cloning of a second ? in the 3'-ITR normalize production levels in comparison to control adenvovirus, proving adenovirus genome is not trapped in any nuclear region. EMSA assays have shown different cellular proteins interact with attB sequence and likely the interaction of one of this cellular proteins impairs the correct packaging of adenovirus genome. For this reason, differential packaging in time of attB/attP-helper adenovirus generated have been used to produce gutless adenovirus limiting production times at 36 hours (time when control adenovirus finish its viral cycle) . However, in gutless adenovirus productions, helper adenovirus contamination levels were high and they increase significantly in the successive amplification steps. The 5' extreme analysis showed helper and gutless adenovirus recombine by their ? loosing recombination sequences and, in this way, helper adenovirus slow packaging capacity. Nevertheless, the inversion of ? showed this effect can be easily avoided which make Ad5/FC31.Cre.?R helper adenovirus a good tool for gutless adenovirus production.

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral. / Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

DYRK1A es uno de los principales genes candidatos que podrían explicar algunos de los defectos neurológicos asociados al fenotipo Síndrome de Down (SD); desde el retraso mental, rasgo común a todos los individuos con SD hasta los déficits motores, también muy frecuentes entre la población con SD. Con el fin de validar la implicación de DYRK1A en el fenotipo SD se ha desarrollado una estrategia de terapia génica basada en la reducción de la expresión del gen mediante interferencia del RNA, en el modelo transgénico TgDyrk1A, y se han evaluado los efectos en el fenotipo motor de estos animales. Además se ha estudiado la implicación de los receptores glutamatérgicos de tipo NMDA en las alteraciones motoras descritas en el modelo. Los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto la validez de la estrategia desarrollada y apuntan a una desregulación de los receptores de NMDA como uno de los mecanismos moleculares subyacentes de las disfunción motora presente en el modelo TgDyrk1A. / The are growing evidences to consider DYRK1A as a candidate gene for some of the neurological alterations present in DS phenotype such as mental retardation which is a common feature in the syndrome, or motor deficits which show a high prevalence among DS individuals. With the aim to validate the contribution of Dyrk1A to DS phenothype, we have developped a gene therapy strategy based on RNA interference to reduce gene expression in the transgenic model TgDyrk1A, and we have evaluated the effects in the motor phenotype of these animals. Moreover, we have studied the implication of the NMDA glutamate receptor in the motor alterations present in the model. The results obtained validate the strategy developped and suggest the deregulation of the NMDA receptor as one of the main causes underlying motor dysfunction in TgDyrk1A mice.