Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad altamente prevalente, de distribución mundial y que presenta una variada pero alta morbilidad y mortalidad. El agente causal es el Virus Distemper Canino (VDC), el cual posee un amplio rango de hospederos donde es patogénico, entre ellos algunos primates, cetáceos y numerosas familias del orden de los carnívoros. Presenta un alto tropismo por tejido linfoide, neurológico y epitelial, conduciendo a una infección de casi todos los sistemas orgánicos, por lo que los signos clínicos observados son muy variados. El diagnóstico se realiza en base a la sospecha clínica, la que debe ser confirmada por un método diagnóstico de laboratorio, como la técnica molecular denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa previa Transcripción Reversa (RT-PCR), la cual ha sido utilizada además para caracterizar las cepas virales en base al análisis del gen H. Este análisis ha determinado la presencia de 14 linajes circulantes en el mundo, dos de los cuales se han descrito en Chile, correspondientes a los linajes América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. El objetivo de este trabajo fue implementar un protocolo de RT-PCR múltiple, diseñando partidores in silico en base a las secuencias nucleotídicas almacenadas en la base de datos Genbank®, el cual fuera capaz de detectar los dos linajes descritos en Chile de manera diferencial, con el fin de aportar una herramienta diagnóstica de apoyo para estudios epidemiológicos y en un futuro cercano conocer la prevalencia de estos linajes en el país. Los resultados obtenidos sugieren que los partidores diseñados para cada linaje son específicos. Además de indicar que el protocolo establecido fue exitoso, las muestras analizadas corresponderían en su totalidad al linaje América-1, permitiendo en un futuro, seguir analizando muestras positivas al VDC, para conocer la prevalencia real de ambos linajes en el país. / The Canine Distemper is a highly prevalent disease, of worldwide distribution and has a variable but high morbidity and mortality. The causative agent is the Canine Distemper Virus (CDV), which has a wide host range where it is pathogenic, among them some primates, cetaceans and numerous families of the order of carnivores. It presents a high tropism for lymphoid, neurological and epithelial tissue, leading to an infection of almost all organic systems, so the clinical signs observed are very varied. The diagnosis is made based on clinical suspicion, which must be confirmed by a laboratory diagnostic method, where the molecular technique called Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), which has also been used to characterize viral strains based on the analysis of the H gene, which has determined the presence of 14 circulating lineages in the world, two of them have been described in Chile, corresponding to the America-1 and Europe-1/South America-1 lineages. The objective of this work was to implement a multiple RT-PCR protocol, designing in silico primers based on the nucleotide sequences stored in the Genbank® database, which was capable of detecting the two lineages described in Chile in a differential way, to provide a support diagnostic tool for epidemiological studies and in near future to know the prevalence of these lineages in the country. The results obtained suggest that the primers designed for each lineage are selective against these. In addition to indicating that the established protocol was successful, observing that all the samples analyzed corresponded to the America-1 lineage, allowing in the future to keep analyzing positive samples to CDV, in order to know the prevalence of both lineages in Chile.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La importancia que reviste el Distemper Canino -una de las principales enfermedades infecciosas que afectan tanto a los caninos domésticos y silvestres como también a varios otros mamíferos terrestres y marinos- junto a la dificultad de su diagnóstico -basado en los signos clínicos- ha motivado que a la fecha se hayan realizado diversos estudios en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile para la detección óptima del agente etiológico: el Virus Distemper Canino. La técnica molecular utilizada es la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a transcripción reversa, utilizando como blanco de detección los diferentes genes que componen su genoma: N, P, F, M, H y L, con el fin de encontrar el método que permita el diagnóstico de la enfermedad ante-mortem de manera precoz. Así, en esta Memoria de Título, se utiliza el gen M que codifica la proteína de la Matriz viral y se implementó un protocolo de detección molecular que completa la información respecto a cuál sería el gen óptimo a utilizar en el diagnóstico de la enfermedad. Para ello se utilizaron 20 muestras de RNA total, obtenido desde sangre periférica de perros de distintas razas, edades y estado de vacunación contra Virus Distemper Canino, que presentaron signos clínicos y que ya eran positivos a la RT-PCR que detecta el gen N del virus. La técnica detectó el genoma viral en el 70% de aquellas analizadas, observándose una banda cercana a los 500 pb, cuyos productos amplificados presentaron intensidad y nitidez evidentes a la visualización. El porcentaje de identidad nucleotídica (PIN) respecto de las dos secuencias consenso obtenidas del total de muestras (mediante el programa online Clustal Omega), arrojó un 99% para ambas secuencias, comparadas con las secuencias de Virus Distemper Canino que entrega el programa informático de alineamiento de secuencias online de libre acceso BLAST. Los resultados permiten concluir que, si bien la elección del gen M como blanco de detección permite detectar VDC, no resulta de elección para la detección certera del virus, y por ende, para ser utilizada en el diagnóstico de la enfermedad causada por este / The importance of the Canine Distemper -one of the main infectious diseases affecting domestic and wild canines as well as several other mammals both terrestrial and marine- and the difficulty of its diagnosis -based on clinical signs- has motivated to the date several studies that have been carried out in the Faculty of Veterinary and Animal Sciences of the University of Chile to detect the etiological agent: the Canine Distemper Virus. The molecular technique used is the Polymerase Chain Reaction associated with reverse transcription and the different genes that make up its genome have been used as a detection target: N, P, F, M, H and L, in order to find an method that allows the early diagnosis of ante-mortem disease. Thus, in this Title Memory, the M gene that encodes the protein of the virus Matrix is used and a molecular detection protocol was implemented that completes the information regarding which would be the optimal gene to be used in the diagnosis of the disease. For this, 20 samples of total RNA were used, obtained from peripheral blood of dogs of different breeds, ages and vaccination status against Canine Distemper Virus, which showed clinical signs and which were already positive to the RT-PCR that detects the N gene of virus. The technique detected the viral genome in 70% of those analyzed, generating a band close to 500 bp, whose amplified products presented clear intensity and sharpness to the visualization. The percentage of nucleotide identity (PIN) with respect to the two consensus sequences obtained from the total samples (using the Clustal Omega online program) yielded 99% for both sequences compared to the Canine Distemper Virus sequences delivered by the alignment software of free access online sequences BLAST. The results allow us to conclude that although the choice of the M gene as a detection target allows to detect VDC, it is not of choice for the accurate detection of the virus, and therefore, to be used in the diagnosis of the disease caused by it

Determina la presencia de anticuerpos contra virus de distemper canino (VDC) en jaguares (Panthera onca) y pumas (Puma concolor) de vida libre de dos áreas: Concesión de Conservación Rio Los Amigos (n=2) y la Reserva Nacional Tambopata/Parque Nacional Bahuaja Sonene (n=17) en el departamento de Madre de Dios. La detección de anticuerpos contra el VDC es realizada mediante la prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI) en las 19 muestras de felinos silvestres de vida libre, obtenidas como parte del trabajo realizado por la World Wildlife Fund (WWF) durante los años 2006 - 2008. Todos los felinos silvestres de vida libre resultan negativos a anticuerpos contra VDC mediante la prueba de IFI. Se concluye que los felinos silvestres trabajados en este estudio durante los años 2006 - 2008 no están expuestos al VDC. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Distemper Canino (VDC) es un agente infeccioso de amplia distribución, responsable de la enfermedad denominada Distemper Canino (DC) que afecta a una amplia diversidad de carnívoros terrestres (reportándose incluso en primates) y marinos. Afecta agresivamente a perros domésticos (con una tasa de mortalidad aproximada del 50%). Por tanto, el impacto clínico del VDC es importante. El VDC es codificado por 6 genes, N, P/V/C, M, F, H y L. Casi todos ellos se han usado para identificación de linajes y diagnóstico de la enfermedad. En este trabajo y utilizando Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a Retrotranscripción (RT-PCR) se analizaron 22 fragmentos de Ácido Ribonucleico (RNA) obtenidos de sangre periférica de 22 perros diagnosticados con VDC clínicamente y positivos a VDC mediante RT-PCR (gen N) con el objetivo de lograr implementar la detección del gen de la proteína grande (L) como alternativa diagnóstica. En este sentido, se diseñó un par de partidores que generaron un fragmento de ácido desoxirribonucleico (DNA) de alrededor de 450 pares de bases (pb), el cual mediante análisis bioinformático confirmó su identidad (PIN>94%). Así, esta implementación abre la discusión sobre el mejor método alternativo, en conocimiento de que la detección del gen P mediante RT-PCR anidado lo es actualmente. Un análisis de sensibilidad pondría dilucidar esta incógnita prontamente. Se concluye por tanto que esta técnica molecular ofrece un efectivo método diagnóstico para la presencia de VDC en perros domésticos. / The Canine Distemper Virus (CDV) is a widespread responsible for the Canine Distemper Disease that affects a broad diversity of carnivore mammals (and some cases in primates have been reported) globally. Domestic dogs are extensively and aggressively (with a ~50% mortality rate) infected by the CDV. Therefore, the clinical impact of the CDV is remarkable. The CDV is encoded by six genes, N, P/V/C, M, F, H and L. Almost all of which have been previously studied for lineage identification and disease diagnosis. In this study we used Reverse Polymerase Chain Reaction tests (RT-PCR) to analyseobtain 22 fragments of Ribonucleic acid (RNA) from peripheral blood of 22 subject dogs clinically diagnosed with CDV and positive to CDV by RT-PCR (N gene). The aim of this study was to implement a protocol of detection of the Large Protein Gene (L) to be employed as an alternative diagnostic. To achieve this, a pair of primers that generated a fragment of deoxyribonucleic acid (DNA) of ~450 base pairs (bp) was designed, which, using a bioinformatic analysis, confirmed its identity (PIN > 94%). Therefore, the implementation of this protocol opens the discussion about the best alternative method, within the context that the detection of the P gene through Nested RT-PCR is currently the best available protocol. A sensitivity analysis may potentially elucidate this question. Consequently, the main conclusion is that the molecular technique implemented in this study offers an effective diagnostic method to optimize the detection of VDC in domestic dogs. / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus distemper canino (VDC) es el agente causal de una de las enfermedades infecciosas más relevantes en carnívoros a nivel mundial. En las últimas décadas se han reportado diversos brotes con alta mortalidad en especies silvestres, los que provocaron una gran disminución en las poblaciones afectadas, poniendo en riesgo la conservación de especies amenazadas. Con el objetivo de determinar la presencia de VDC en diferentes especies silvestres en Chile, se realizó un estudio longitudinal de detección del gen de la Fosfoproteína (gen P) mediante n-RT-PCR. Se analizaron 136 muestras de sangre entera de carnívoros clínicamente sanos provenientes de un zoológico de la Región Metropolitana y de zorros chilotes (Lycalopex fulvipes) de vida libre. Como resultado, no se detectó el gen P en ninguna de las muestras analizadas, siendo todas clasificadas como negativas. La evidencia encontrada, en conjunto con estudios previos, sugiere que el contacto de los zorros chilotes con perros infectados con VDC podría tener graves consecuencias en cuanto a su salud y conservación, causando disminución poblacional o extinciones locales a lo largo de su distribución. Se recomienda realizar estudios serológicos y moleculares de carnívoros silvestres y domésticos en zonas habitadas por zorro chilote que permitan comprender la epidemiología del virus en ambientes naturales para diseñar medidas preventivas adecuadas para proteger ésta especie. Finalmente, se recomienda continuar la vigilancia del virus mediante pruebas serológicas que confirmen la utilidad de la vacunación como medida preventiva en zoológicos y mantener protocolos sistemáticos de vacunación. / Canine distemper virus (CDV) is the causal agent of one of the most relevant infectious diseases in carnivores worldwide. In the last decades, several outbreaks with high mortality in wildlife species have been reported, which caused a large decline of the affected populations, putting at risk the conservation of threatened species. In order to determine the presence of CDV in different wild species in Chile, a longitudinal study of detection of the Phosphoprotein gene (P gene) was carried out by n-RT-PCR. A total of 136 whole blood samples were analyzed, collected from different clinically healthy carnivores from a zoo in the Metropolitan Region and free-ranging Darwin’s foxes (Lycalopex fulvipes). As a result, the presence of P gene was not detected in any of the analyzed samples, so all were classified as negative. The evidence found, in conjunction with previous studies, suggests that the contact of Darwin’s foxes with CDV infected dogs could have severe consequences in their health and conservation status, causing population decline or local extinctions throughout its distribution. It is recommended to perform serological and molecular studies in wild and domestic carnivores in areas inhabited by Darwin’s foxes that allow understanding the epidemiology of the virus in natural environments, in order to design adequate preventive measures to protect this specie. Finally, it is recommended to continue monitoring the virus through serological tests that confirm the efficacy of vaccination as a preventive method in zoos and maintain systematic vaccination protocols. / Proyecto Buin Zoo para la conservación del zorro chilote

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino (DC) es una de las patologías que provoca mayor tasa de morbilidad y mortalidad en los caninos domésticos a nivel mundial y representa también una importante enfermedad en varias familias de mamíferos terrestres: Canidae, Procyonidae, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ursidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae y algunos mamíferos marinos, como la foca cáspica (pusa caspica). Esta enfermedad es causada por el Virus Distemper Canino (VDC), un virus ARN de hebra simple y polaridad negativa, cuyo genoma constituido por seis genes, codifica para seis proteínas estructurales. Entre ellas, la Hemaglutinina codificada por el gen H, presenta la mayor variabilidad aminoacídica, induce la producción de anticuerpos neutralizantes sintetizados por el sistema inmune del hospedero. Basado en la variabilidad del gen H, se ha descrito que a nivel mundial existirían al menos catorce linajes distintos del VDC y en nuestro país se ha descrito la presencia de al menos dos linajes circulando entre nuestros perros enfermos con la patología: América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. Así, el objetivo de esta memoria de título fue implementar la detección del linaje América-1 del Virus Distemper Canino mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a transcripción reversa (RT-PCR) mediante partidores diseñados in silico. Para esto, los partidores se diseñaron a partir de las secuencias nucleotídicas usadas en el árbol filogenético del gen H de VDC realizado por (Ke et al., 2015, las que se encuentran en la base de datos Genbank®, Los partidores diseñados resultaron ser eficaces para la detección del VDC y la RT-PCR fue capaz de detectar un fragmento específico del gen H de las muestras positivas, por lo tanto se podría sugerir que estos partidores diseñados in silico efectivamente se pueden ocupar para detectar el linaje América-1 del VDC. / The Canine Distemper is one of the pathologies that causes the highest rate of morbidity and mortality in domestic dogs worldwide and represents an important disease in several families of terrestrial mammals: Canidae, Procyonidae, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ursidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae and some marine mammals, like the cape seal (pusa caspica). This disease is caused by Canine Distemper Virus (CDV), a single-stranded RNA virus with negative polarity, whose genome consists of six genes codifying for six structural proteins. Among them, the Hemagglutinin encoded by the H gene, has the highest amino acid variability, inducing the production of neutralizing antibodies synthesized by the host's immune system. Based on the variability of the H gene, it has been described that worldwide there would be at least fourteen different VDC lineages and in our country the presence of at least two lineages circulating among our sick dogs has been described with the pathology: America-1 and Europe-1/South America-1. The objective of this title report was to implement the detection of the America-1 lineage of the Canine Distemper Virus through the Polymerase Chain Reaction associated with reverse transcription (RT-PCR) by means of in silico designed primers. For this, the primers were designed using the nucleotide sequences used in the phylogenetic tree constructed using the VDC H gene performed by Ke et al., 2015, and stored in the Genbank® database. The designed primers were found to be effective for the detection of VDC and the RT-PCR was able to detect a specific fragment of the H gene from the positive samples, therefore it could be suggested that these in silico designed primers can effectively be used to detect the VDC lineage America-1.

En el Perú como en muchos países del mundo la incursión del hombre a nuevas áreas o zonas para desarrollar ganadería o agricultura pone en riesgo la vida de animales silvestres como el zorro de Sechura (Lycalopex sechurae) que habita en la región costa del Perú, desde el sur de Ecuador, hasta las cercanías de Lima. El zorro de Sechura es considerado una especie “casi amenazado” por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN). El contacto del zorro con los perros debido al crecimiento de la actividad humana, podría representar un alto riesgo de contraer enfermedades como el Distemper canino. Por lo que el objetivo del presente estudio fue determinar la infección natural de los perros de la Comunidad Campesina José Ignacio Távara Pasapera, en el departamento de Piura, con el virus del distemper canino (VDC). Se colectaron muestras de suero de 81 perros de diferentes edades, sin vacunación contra el VDC en cinco localidades de la comunidad para la detección de anticuerpos contra el VDC mediante la prueba de inmunofluorescencia indirecta. Además, se colectaron informaciones a través de una ficha de encuesta para análisis epidemiológicos. El 34.6 ± 0.1% (28/81) de los perros no vacunados tuvieron anticuerpos contra el VDC. Anticuerpos contra el VDC fue detectado en los perros desde < de 1 a > de 5 años de edad. El análisis de factores de riesgo realizado mediante regresión logística determinó una asociación de la seropositividad con la densidad de la población humana en las localidades de estudio y el proceso de la vacunación antirrábica canina.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El crecimiento y expansión de la población humana ha ocasionado un mayor contacto entre los humanos, sus animales domésticos y la fauna silvestre. La interacción física entre estas especies ha favorecido la diseminación de enfermedades infecciosas entre ellas y tienen consecuencias para la salud y la conservación. En asociación con lo anterior, la presencia del perro doméstico (Canis familiaris) en áreas protegidas, puede afectar la conservación de carnívoros silvestres debido, principalmente, a la transmisión de enfermedades mediante “salto taxonómico”, como del virus distemper canino (VDC), que ha sido reportado en todas las familias de carnívoros terrestres y algunos marinos. Esta enfermedad representa una amenaza para estos depredadores y los perros pueden actuar como reservorio del agente infeccioso, manteniendo el virus en sus poblaciones y diseminándolo hacia otros hospederos. El objetivo presente estudio es determinar los factores de riesgo asociados a la presencia de VDC en perros y carnívoros silvestres de la Reserva de la Biósfera de Janos. Se realizó el diagnóstico de VDC mediante serología y se corroboró que el agente se encuentra circulando tanto en poblaciones de perros como de carnívoros silvestres. Los resultados muestran que existe una interacción física entre especies domésticas y silvestres, sin embargo, no sugieren la existencia de un riesgo de infección interespecífico entre los individuos seropositivos. / Human population growth and expansion have caused a habitat overlap between humans, their domestic animals and wildlife population. Physical interactions between these species has enabled the spread of infectious diseases and has had implications for public health and conservation. In addition, the presence of domestic dogs (Canis familiaris) in protected areas may impact wild carnivore’s conservation due to, mainly, disease transmission caused by spillover infection. A good example of this is canine distemper virus (CDV), that has been reported in every family of terrestrial and some marine carnivores. The disease poses a threat for these predators and dogs are the principal reservoir of the infectious agent, keeping the virus among their population and spreading it towards other hosts. The objective of the present study is to determine the risk factors related to the presence of CDV in dogs and wild carnivores of the Janos Biosphere Reserve. The virus diagnosis was made by serological testing and it was found that the virus is circulating in both dogs and wild carnivore population. The results show that there is a physical interaction between domestic and wild species, however, they suggest that there is no risk of interspecies infection between positive individuals. / Financiamiento: Proyecto Conacyt CB-179482 (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México)

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En los últimos años, la aparición de una gran cantidad de casos de distemper canino en animales adultos con su plan de vacunación al día ha alarmado a los médicos veterinarios. Así, los casos de distemper canino se han vuelto una preocupación importante dentro del quehacer clínico veterinario. El propósito de este trabajo realizado en los laboratorios de Virología y Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, fue detectar el gen de la hemoaglutinina del virus distemper canino, mediante el uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociado a transcripción inversa (RT-PCR), como confirmación del diagnóstico clínico de la enfermedad. Para esto se utilizaron muestras de sangre periférica de animales clínicamente enfermos y fueron agrupadas según su fecha de extracción y utilizando vacunas comerciales como control. Los resultados permiten demostrar una alta sensibilidad de la técnica, además de permitir el uso de las muestras hasta siete días de almacenadas a 4°C, pese a la fragilidad del ARN viral. La detección del gen de la hemaglutinina del virus distemper canino en muestras de campo y su alta sensibilidad, sugiere estudiar su uso como una herramienta de diagnóstico complementaria al diagnóstico clínico del distemper canino en nuestro país / Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades infecciosas emergentes constituyen uno de los mayores desafíos que enfrenta tanto la salud humana como animal, así como la conservación de la biodiversidad. El virus distemper canino ha llamado fuertemente la atención en este aspecto, ya que posee una alta prevalencia en la población canina mundial. El distemper canino es una enfermedad viral sistémica y altamente contagiosa, siendo una de las principales causas de muerte en caninos domésticos y otros carnívoros. En los últimos años, la incidencia de distemper canino parece haber aumentado, documentándose la aparición de nuevas e inusuales cepas; las razones que explicarían estos cambios y sus efectos en su epidemiología aún son desconocidas. El virus distemper canino posee un alto grado de heterogeneidad genética, principalmente dado por la proteína hemaglutinina, la que demuestra patrones geográficos de diversificación que se utilizan para monitorear la epidemiología molecular del virus. En esta memoria de título se detectó el gen de la hemaglutinina (gen H) del virus distemper canino mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa previa transcripción reversa, se secuenció el fragmento de ADN amplificado y esta secuencia nucleotídica se incluyó en el análisis filogenético para el gen H utilizando secuencias oficiales y conocidas de virus distemper canino, incluyendo a las cepas vacunales utilizadas para la prevención de la enfermedad (Genbank®). Los resultados evidencian que en Chile al menos existirían dos de los linajes conocidos para VDC: Europa y América 1 / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010