Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Distemper Canino (VDC) es el agente causal de una grave enfermedad multisistémica de perros y otras especies del orden Carnívora. Distemper Canino (DC) se presenta como una enfermedad altamente contagiosa, que puede alcanzar una elevada morbilidad y mortalidad. El amplio espectro de signos clínicos dificulta el diagnóstico clínico de la enfermedad y hace necesario la confirmación a través de exámenes de laboratorio. La detección molecular de VDC presenta ventajas en el diagnóstico de la enfermedad. En el presente trabajo se implementó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa –versión anidada- previa trascripción inversa (n-RT-PCR) para la detección del gen de la fosfoproteína viral (gen P). Como controles positivos se utilizaron RNA proveniente de cepas vacunales y de muestras positivas a otros genes de VDC mediante RT-PCR. Como controles negativos se utilizó RNA de muestras de perros sin signos clínicos de la enfermedad y como control de reactivos agua libre de nucleasas. Posteriormente, se utilizó la técnica en 10 muestras de campo de perros con sospecha clínica de la enfermedad, detectándose el genoma viral en el 100% de las muestras analizadas, generando una banda cercana a los 430 pb, correspondiente a la secuencia blanco buscada del gen de la fosfoproteína de VDC. Los productos de amplificación se caracterizaron por su gran intensidad y nitidez, no observándose bandas de amplificación inespecíficas. Finalmente, se realizó la secuenciación de los productos obtenidos del n-RT-PCR, obteniendo un elevado porcentaje de identidad nucleotídica respecto a las secuencias nucleotídicas del gen P almacenadas en el GenBank®. Esto permitió establecer que el n-RT-PCR implementado en esta Memoria de Título permite la detección de VDC. La implementación de esta técnica permitirá realizar la detección antemortem del virus y, por lo tanto, facilitar el diagnóstico y tratamiento temprano de la enfermedad / Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad altamente prevalente, de distribución mundial y que presenta una variada pero alta morbilidad y mortalidad. El agente causal es el Virus Distemper Canino (VDC), el cual posee un amplio rango de hospederos donde es patogénico, entre ellos algunos primates, cetáceos y numerosas familias del orden de los carnívoros. Presenta un alto tropismo por tejido linfoide, neurológico y epitelial, conduciendo a una infección de casi todos los sistemas orgánicos, por lo que los signos clínicos observados son muy variados. El diagnóstico se realiza en base a la sospecha clínica, la que debe ser confirmada por un método diagnóstico de laboratorio, como la técnica molecular denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa previa Transcripción Reversa (RT-PCR), la cual ha sido utilizada además para caracterizar las cepas virales en base al análisis del gen H. Este análisis ha determinado la presencia de 14 linajes circulantes en el mundo, dos de los cuales se han descrito en Chile, correspondientes a los linajes América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. El objetivo de este trabajo fue implementar un protocolo de RT-PCR múltiple, diseñando partidores in silico en base a las secuencias nucleotídicas almacenadas en la base de datos Genbank®, el cual fuera capaz de detectar los dos linajes descritos en Chile de manera diferencial, con el fin de aportar una herramienta diagnóstica de apoyo para estudios epidemiológicos y en un futuro cercano conocer la prevalencia de estos linajes en el país. Los resultados obtenidos sugieren que los partidores diseñados para cada linaje son específicos. Además de indicar que el protocolo establecido fue exitoso, las muestras analizadas corresponderían en su totalidad al linaje América-1, permitiendo en un futuro, seguir analizando muestras positivas al VDC, para conocer la prevalencia real de ambos linajes en el país. / The Canine Distemper is a highly prevalent disease, of worldwide distribution and has a variable but high morbidity and mortality. The causative agent is the Canine Distemper Virus (CDV), which has a wide host range where it is pathogenic, among them some primates, cetaceans and numerous families of the order of carnivores. It presents a high tropism for lymphoid, neurological and epithelial tissue, leading to an infection of almost all organic systems, so the clinical signs observed are very varied. The diagnosis is made based on clinical suspicion, which must be confirmed by a laboratory diagnostic method, where the molecular technique called Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), which has also been used to characterize viral strains based on the analysis of the H gene, which has determined the presence of 14 circulating lineages in the world, two of them have been described in Chile, corresponding to the America-1 and Europe-1/South America-1 lineages. The objective of this work was to implement a multiple RT-PCR protocol, designing in silico primers based on the nucleotide sequences stored in the Genbank® database, which was capable of detecting the two lineages described in Chile in a differential way, to provide a support diagnostic tool for epidemiological studies and in near future to know the prevalence of these lineages in the country. The results obtained suggest that the primers designed for each lineage are selective against these. In addition to indicating that the established protocol was successful, observing that all the samples analyzed corresponded to the America-1 lineage, allowing in the future to keep analyzing positive samples to CDV, in order to know the prevalence of both lineages in Chile.

En el Perú como en muchos países del mundo la incursión del hombre a nuevas áreas o zonas para desarrollar ganadería o agricultura pone en riesgo la vida de animales silvestres como el zorro de Sechura (Lycalopex sechurae) que habita en la región costa del Perú, desde el sur de Ecuador, hasta las cercanías de Lima. El zorro de Sechura es considerado una especie “casi amenazado” por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN). El contacto del zorro con los perros debido al crecimiento de la actividad humana, podría representar un alto riesgo de contraer enfermedades como el Distemper canino. Por lo que el objetivo del presente estudio fue determinar la infección natural de los perros de la Comunidad Campesina José Ignacio Távara Pasapera, en el departamento de Piura, con el virus del distemper canino (VDC). Se colectaron muestras de suero de 81 perros de diferentes edades, sin vacunación contra el VDC en cinco localidades de la comunidad para la detección de anticuerpos contra el VDC mediante la prueba de inmunofluorescencia indirecta. Además, se colectaron informaciones a través de una ficha de encuesta para análisis epidemiológicos. El 34.6 ± 0.1% (28/81) de los perros no vacunados tuvieron anticuerpos contra el VDC. Anticuerpos contra el VDC fue detectado en los perros desde < de 1 a > de 5 años de edad. El análisis de factores de riesgo realizado mediante regresión logística determinó una asociación de la seropositividad con la densidad de la población humana en las localidades de estudio y el proceso de la vacunación antirrábica canina.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En los últimos años, la aparición de una gran cantidad de casos de distemper canino en animales adultos con su plan de vacunación al día ha alarmado a los médicos veterinarios. Así, los casos de distemper canino se han vuelto una preocupación importante dentro del quehacer clínico veterinario. El propósito de este trabajo realizado en los laboratorios de Virología y Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, fue detectar el gen de la hemoaglutinina del virus distemper canino, mediante el uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociado a transcripción inversa (RT-PCR), como confirmación del diagnóstico clínico de la enfermedad. Para esto se utilizaron muestras de sangre periférica de animales clínicamente enfermos y fueron agrupadas según su fecha de extracción y utilizando vacunas comerciales como control. Los resultados permiten demostrar una alta sensibilidad de la técnica, además de permitir el uso de las muestras hasta siete días de almacenadas a 4°C, pese a la fragilidad del ARN viral. La detección del gen de la hemaglutinina del virus distemper canino en muestras de campo y su alta sensibilidad, sugiere estudiar su uso como una herramienta de diagnóstico complementaria al diagnóstico clínico del distemper canino en nuestro país / Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades infecciosas emergentes constituyen uno de los mayores desafíos que enfrenta tanto la salud humana como animal, así como la conservación de la biodiversidad. El virus distemper canino ha llamado fuertemente la atención en este aspecto, ya que posee una alta prevalencia en la población canina mundial. El distemper canino es una enfermedad viral sistémica y altamente contagiosa, siendo una de las principales causas de muerte en caninos domésticos y otros carnívoros. En los últimos años, la incidencia de distemper canino parece haber aumentado, documentándose la aparición de nuevas e inusuales cepas; las razones que explicarían estos cambios y sus efectos en su epidemiología aún son desconocidas. El virus distemper canino posee un alto grado de heterogeneidad genética, principalmente dado por la proteína hemaglutinina, la que demuestra patrones geográficos de diversificación que se utilizan para monitorear la epidemiología molecular del virus. En esta memoria de título se detectó el gen de la hemaglutinina (gen H) del virus distemper canino mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa previa transcripción reversa, se secuenció el fragmento de ADN amplificado y esta secuencia nucleotídica se incluyó en el análisis filogenético para el gen H utilizando secuencias oficiales y conocidas de virus distemper canino, incluyendo a las cepas vacunales utilizadas para la prevención de la enfermedad (Genbank®). Los resultados evidencian que en Chile al menos existirían dos de los linajes conocidos para VDC: Europa y América 1 / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino (DC) es una de las principales enfermedades infecciosas en canes domésticos. La introducción de vacunas de virus vivos modificados ha ayudado a mantener controlada la enfermedad. No obstante, en las últimas décadas se ha observado un aumento de la incidencia de esta patología en poblaciones de canes de todo el mundo, desarrollándose inclusive en animales vacunados. Los linajes de virus distemper canino (VDC) circulantes en el mundo se han descrito en base al análisis de la hemaglutinina (H) debido a que posee un alto grado de variabilidad genética. Sin embargo, nuevos estudios han detectado mayores variaciones en la secuencia aminoacídica de una región de la proteína de fusión (F). Para determinar la variabilidad de las cepas de campo en comparación con las vacunas y las cepas de otros linajes, en esta memoria de título se analizó la variabilidad genómica de la región Fsp del gen de la proteína de fusión de VDC. Para esto se implementó una técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) capaz de amplificar esta región variable, la cual fue identificada mediante su secuencia nucleotídica. Estas secuencias se compararon con cepas vacunales y con cepas de campo de los linajes conocidos. Además, se construyó un árbol filogenético para esta región variable. Los resultados de la comparación de nucleótidos arrojaron que las secuencias de las cepas de campo tienen mayor homología a la cepa vacunal Onderstepoort y según la filogenia pertenecerían al linaje América 1. PALABRAS / FIV 121014019102010

Busca detectar el virus del DC a través de la técnica de RT-PCR y realizar el análisis de los datos recolectados para tener una visión actual del comportamiento de este virus en nuestro medio. Es así que a partir de muestras de sangre entera de 52 caninos no vacunados con signos clínicos compatibles con distemper canino, recolectados entre junio del 2012 y enero del 2015, se logró amplificar la Nucleoproteína de 287pb en el 32.7% (17/52) de las muestras analizadas, encontrando además diferencia estadística en la detección del virus principalmente en individuos que manifestaban signos clínicos sistémicos (signos respiratorios y digestivos vs nerviosos), que estaban dentro del rango etario de 1.5 – 4 meses y de raza mestiza. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad viral de distribución mundial, letal y altamente contagiosa, producida por el Virus Distemper Canino, el cual afecta a un amplio rango de hospederos, como perros domésticos y representantes silvestres de distintas familias de carnívoros, comprometiendo drásticamente la conservación de especies amenazadas. Para el diagnóstico definitivo ante-mortem de la enfermedad, se han sugerido una gran variedad de parámetros clínicos y diferentes tipos de ensayos, sin embargo, debido al curso imprevisible y variable de ésta, el diagnóstico final para algunos animales continúa siendo incierto. En consideración a lo anterior y a que el desarrollo de técnicas moleculares ofrece diversos procedimientos para pruebas diagnósticas, el objetivo de esta memoria de título postuló la detección del gen de la proteína de la nucleocápside del Virus Distemper Canino mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a transcripción inversa, como una forma de diagnóstico rápido y específico para la detección del virus. La especificidad del método se evidenció por la amplificación del fragmento esperado en el 100% de los controles positivos a Virus Distemper Canino, tanto los tres controles vacunales (cepa Onderstepoort, Lederle y Snyder Hill), como los diez controles de RNA viral provenientes desde aislados nacionales, y en la no amplificación del fragmento esperado en los controles negativos (perros no infectados con y sin vacunación). Sumado a esto, los fragmentos de DNA amplificados fueron enviados a secuenciar y mediante el programa BLAST, se confirmó que éstos correspondían a Virus Distemper Canino. Además, se propone que el método podría tener una alta sensibilidad, debido a la amplificación del fragmento esperado en el 91% de las muestras de campo provenientes de perros sospechosos de Distemper Canino. En base a lo anterior, el método implementado puede colaborar con la prevención y el control del aumento de Distemper Canino, tanto en la población canina, como en otros animales susceptibles a la enfermedad / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La importancia que reviste el Distemper Canino -una de las principales enfermedades infecciosas que afectan tanto a los caninos domésticos y silvestres como también a varios otros mamíferos terrestres y marinos- junto a la dificultad de su diagnóstico -basado en los signos clínicos- ha motivado que a la fecha se hayan realizado diversos estudios en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile para la detección óptima del agente etiológico: el Virus Distemper Canino. La técnica molecular utilizada es la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a transcripción reversa, utilizando como blanco de detección los diferentes genes que componen su genoma: N, P, F, M, H y L, con el fin de encontrar el método que permita el diagnóstico de la enfermedad ante-mortem de manera precoz. Así, en esta Memoria de Título, se utiliza el gen M que codifica la proteína de la Matriz viral y se implementó un protocolo de detección molecular que completa la información respecto a cuál sería el gen óptimo a utilizar en el diagnóstico de la enfermedad. Para ello se utilizaron 20 muestras de RNA total, obtenido desde sangre periférica de perros de distintas razas, edades y estado de vacunación contra Virus Distemper Canino, que presentaron signos clínicos y que ya eran positivos a la RT-PCR que detecta el gen N del virus. La técnica detectó el genoma viral en el 70% de aquellas analizadas, observándose una banda cercana a los 500 pb, cuyos productos amplificados presentaron intensidad y nitidez evidentes a la visualización. El porcentaje de identidad nucleotídica (PIN) respecto de las dos secuencias consenso obtenidas del total de muestras (mediante el programa online Clustal Omega), arrojó un 99% para ambas secuencias, comparadas con las secuencias de Virus Distemper Canino que entrega el programa informático de alineamiento de secuencias online de libre acceso BLAST. Los resultados permiten concluir que, si bien la elección del gen M como blanco de detección permite detectar VDC, no resulta de elección para la detección certera del virus, y por ende, para ser utilizada en el diagnóstico de la enfermedad causada por este / The importance of the Canine Distemper -one of the main infectious diseases affecting domestic and wild canines as well as several other mammals both terrestrial and marine- and the difficulty of its diagnosis -based on clinical signs- has motivated to the date several studies that have been carried out in the Faculty of Veterinary and Animal Sciences of the University of Chile to detect the etiological agent: the Canine Distemper Virus. The molecular technique used is the Polymerase Chain Reaction associated with reverse transcription and the different genes that make up its genome have been used as a detection target: N, P, F, M, H and L, in order to find an method that allows the early diagnosis of ante-mortem disease. Thus, in this Title Memory, the M gene that encodes the protein of the virus Matrix is used and a molecular detection protocol was implemented that completes the information regarding which would be the optimal gene to be used in the diagnosis of the disease. For this, 20 samples of total RNA were used, obtained from peripheral blood of dogs of different breeds, ages and vaccination status against Canine Distemper Virus, which showed clinical signs and which were already positive to the RT-PCR that detects the N gene of virus. The technique detected the viral genome in 70% of those analyzed, generating a band close to 500 bp, whose amplified products presented clear intensity and sharpness to the visualization. The percentage of nucleotide identity (PIN) with respect to the two consensus sequences obtained from the total samples (using the Clustal Omega online program) yielded 99% for both sequences compared to the Canine Distemper Virus sequences delivered by the alignment software of free access online sequences BLAST. The results allow us to conclude that although the choice of the M gene as a detection target allows to detect VDC, it is not of choice for the accurate detection of the virus, and therefore, to be used in the diagnosis of the disease caused by it

El virus del distemper canino o CDV es un patógeno que afecta a los miembros de la familia Canidae, causando una enfermedad aguda, sistémica y frecuentemente mortal. Predispone al hospedador a las infecciones bacterianas secundarias y a posibles secuelas de tipo neurológico. La protección contra el CDV se logra a través de la vacunación. La mayoría de las vacunas se elaboran a partir de virus atenuado por pasaje en huevos embrionados o cultivos celulares. Sin embargo, estas vacunas han demostrado no proteger completamente contra la enfermedad y en muchos casos, han generado reacciones adversas que sugieren la necesidad del desarrollo de nuevas metodologías para su producción. Teniendo en consideración los avances en biología molecular en relación con la producción de proteínas obtenidas de forma recombinante, se propuso como objetivo expresar y evaluar algunas de las proteínas virales utilizando un sistema heterólogo. Con esta metodología se eliminarían las desventajas de los métodos tradicionales. Además, ayudaría a disminuir notablemente los costos de producción. Se trabajó sobre dos proteínas virales descriptas como el blanco principal de los anticuerpos neutralizantes producidos luego de la infección: la hemaglutinina y la proteína de fusión. Ambas proteínas se expresaron en la levadura metilotrófica Pichia pastoris, obteniéndose las mismas de forma recombinante y en un alto grado de pureza. Luego, estas proteínas se emplearon para inocular ratones con el fin de comprobar su capacidad de estimular la respuesta inmune y analizar su capacidad neutralizante. Los resultados obtenidos sugieren que ambos polipétidos han conservado los determinantes antigénicos presentes en la partícula viral y generaron una buena respuesta inmune. Por lo tanto podrían ser utilizados para el desarrollo de una vacuna a subunidades.