O objetivo deste experimento foi determinar a sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificado em palhetas na presença de uma haste metálica .Blastocistos Mus domesticus domesticus coletados no quarto dia após a fecundação, foram avaliados morfologicamente e divididos aleatoriamente em três grupos. Os embriões do grupo controle foram transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro por 48 horas. Os embriões selecionados para criopreservação foram expostos a uma solução crioprotetora constituída por PBSm + de 10% etileno-glicol + 10% propileno-glicol, para promover uma desidratação das células embrionárias. Após foram transferidos para a solução de vitrificação que continha 20% etilenoglicol + 20% propilenoglicol diluídos em PBSm, e mantidos durante 25 segundos, sendo imediatamente imersos em nitrogênio submetido à vácuo. As taxas de sobrevivência embrionária revelaram uma maior eficiência da técnica com a inserção da peça metálica (56,21% - 86/153) em relação ao método convencional (18,84% - 26/138). Concluímos assim que a presença da peça metálica em contato com a amostra propiciou maior taxa de sobrevivência dos embriões submetidos à vitrificação envasados em palhetas de 0,25 mL. / The aim of this experiment was determine the Mus domesticus domesticus blastocysts survival rates after vitrification in straws containing a metallic stick, that allows to increase the temperature changes among the nitrogen and the embryo sample. Day 4 Mus domesticus domesticus blastocysts were collected from superovulated donnors and after morphologically evaluation were randomly divided in three groups. The embryos select as control group were transferred to KSOM medium drops and in vitro cultured during 48 hours. The crioperservation selected embryos were first exposed to a cryoprotective solution (modified PBS + 10% ethylene-glycol and 10% propylene-glycol) to promote embryo cell dehydration and after exposed during 25 seconds to the vitrification solution composed by modified PBS + 20% ethylene-glycol and 20% propylene-glycol, and immediately plunged into slush liquid nitrogen. The embryo survival rate in group vitrified in the straws containing the metallic stick (56,21% - 86/153) was significantly different from the observed in the group loaded in original straws (18,84% - 26/138). In conclusion, the presence of the metallic stick in contact with the sample was efficient to enhance more suitable survival rates after vitrification of Mus domesticus domesticus blastocysts loaded in 0,25 mL straws.

O desenvolvimento de protocolos eficientes para a vitrificação de embriões mamíferos ainda é um desafio para os especialistas em reprodução. Soluções crioprotetoras de baixa toxicidade associadas a técnicas seguras de envase são fatores fundamentais, para proporcionarem uma eficiente identificação e controle sanitário das amostras. Dois experimentos foram realizados para determinar a taxa de sobrevivência de embriões Mus domesticus domesticus envasados em palhetas convencionais (0,25 mL), na presença de uma haste metálica de ouro, empregando soluções crioprotetoras descritas para a vitrificação em microvolume. No experimento 1, avaliou-se a toxicidade da solução de desidratação (SD: PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0,5 M sacarose), expondo-se os embriões por diferentes tempos: 1 (T1), 3 (T2) ou 10 min (T3). A toxicidade da solução de vitrificação (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) foi determinada pela exposição dos embriões durante 25, 60 ou 180 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. No experimento 2, avaliou-se a utilização do macrovolume (palhetas com a haste de ouro) e microvolume (micropipetas de vidro - GMP) na vitrificação dos blastocistos expostos à SV por 25 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. Os dados foram analisados pelo teste Qui-Quadrado (P<0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de eclosão dos embriões desidratados: T1=68,0% (38/56), T2=72,0% (36/50), T3=71,0% (39/55) e o grupo controle, (74,0% - 48/65). No entanto, houve diferença significativa (P<0,05) na taxa de eclosão em relação ao tempo de exposição dos embriões à SV. Os embriões desidratados por 1 ou 3 min e expostos à SV por 25 seg proporcionaram maiores taxas de re-expansão (79,0% vs 84,0%) e de eclosão (58,0% vs 72,0%), em relação aos tempos de exposição de 60 e 180 seg. No experimento 2, após a vitrificação dos embriões envasados nas palhetas com a haste de ouro, a taxa de eclosão dos blastocistos previamente desidratados por 1 min foi de 16,0% (10/64) e de 4,0% (2/57) quando previamente desidratados por 3 min. Por outro lado, os embriões envasados nas GMP, e previamente desidratados por 3 min, foram os que apresentaram maior taxa de eclosão (60,0% - 52/86). A vitrificação de embriões utilizando soluções crioprototetoras descritas para microvolume não foi eficiente na crioproteção dos blastocistos envasados em palhetas convencionais com a haste de ouro. / The development of efficient vitrification protocols for mammalian embryos still is a challenge for reproductive biologists. Low toxicity cryoprotectant solutions and safe vitrifications procedures that allow sample identification and sanitary control are fundamental factors. Two experiments were conducted to determine the survival rate of vitrified Mus domesticus domesticus embryos loaded into straws containing a metallic piece (manufactured in gold), using cryoprotectant solutions described for microvolume vitrification procedures. In Experiment 1, the toxicity of the dehydratation solution (SD: PBSm +10% EG + 10% PROH + 0,5 M sucrose) was evaluated using three different embryo exposure times: 1 (T1), 3 (T2) or 10 min (T3), in addition as well as the toxicity of the vitrification solution (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) was also tested upon embryo exposure for 25, 60 or 180 sec, previously dehydration for 1 or 3 min. In Experiment 2, the use of macrovolume (straw with a stem of gold) or microvolume (glass micropipettes – GMP) was evaluated for the vitrification of blastocysts after exposure to SV for 25 sec and previous dehydration for 1 or 3 min. Data were analized by the Chi-square test (P<0,05). In Experiment 1, statistical differences were not observed between hatching rates of dehydrated embryos: T1=68.0% (38/56), T2=72.0% (36/50), T3=71.0% (39/55) and control group embryos, (74.0% - 48/65). However, a significant difference (P <0,05) was observed between hatching rates after embryos exposure to the SV. Embryos dehydrated for 1 or 3 min and exposed for 25 sec to the SV showed higher re-expansion (79.0% vs. 84.0%) and hatching rates (58.0% vs. 72.0%) than embryos exposed to SV for 60 or 180 sec. In Experiment 2, after vitrification of the embryos loaded into straws containing a metallic piece showed a hatching rate of 16.0% (10/64) when previouslly dehydrated for 1 min, and 4.0% (2/57) when for 3 min. On the other hand, embryos loaded into GMP, previouslly dehydrated for 3 min, showed a higher hatching rate, (60.0% - 52/60). Embryo vitrification using a cryoprotectant solution described as suitable for microvolume was not efficient to cryoprotect blastocysts loaded into macrovolume straws containing a metallic piece.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro testar a presença da dimetilformamida (DF) nas soluções crioprotetoras e segundo avaliar a viabilidade in vitro pós aquecimento de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em microcapilares manufaturados industrialmente. O primeiro experimento testou a capacidade de vitrificação das diferentes soluções de vitrificação, compostas pelas combinações de etileno glicol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) com as diferentes porcentagens de DF. No segundo experimento se testou a toxicidade de 3 soluções de equilíbrio: ES1 (PBSm + 10% PROH + 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+ 10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA), através da exposição dos embriões durante 3 períodos de tempo (1, 3 e 10 min). O cultivo in vitro após a exposição às soluções de equilíbrio foi realizado em meio de KSOM durante 72 h. Os resultados de re-expansão foram semelhantes entre as três soluções, quando os embriões foram expostos por 1 ou 3 min. Por outro lado, a exposição à ES3 por 10 min, revelou uma maior taxa de sobrevivência dos embriões, em relação às outras soluções testadas. No terceiro experimento, após expor-se os embriões às soluções de equilíbrio, ES1, ES2 e ES3 por 1 min, a vitrificação foi realizada utilizando-se as seguintes soluções: VS1 (PBSm + 20% PROH + 20% DF + 0.5% PVA); VS2 (PBSm + 20% EG + 20% DF+ 0.5%PVA) and VS3 (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA). Imediatamente após a exposição por 30 s às soluções de vitrificação os embriões foram envasados em micropipetas de vidro (GMPs) e mergulhados em nitrogênio líquido superresfriado. As GMPs foram aquecidas no ar durante 10 s e após os embriões foram expostos durante 5 min ao PBSm + 0,25 M sacarose a 37 °C, finalmente transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro durante 72 horas. As taxas de re-expansão dos embriões após o cultivo in vitro foram as seguintes: ES1/VS1 = 12% (13/108); ES2/VS2 = 38% (46/111) e ES3/VS3 = 84% (89/105). A eclosão dos embriões observada após o cultivo in vitro foi de: ES1/VS1 = 3% (3/108); ES2/VS2 = 17% (19/111) e ES3/VS3 = 70% (73/105). As taxas de sobrevivência revelaram que a presença da dimetilformamida na solução crioprotetora reduz a viabilidade embrionária e que a associação de EG + PROH é eficiente na manutenção da viabilidade embrionária após a vitrificação. O segundo artigo descreve os experimentos de vitrificação, utilizando-se para o envase dos embriões um microcapilar de vidro (GMC), produzido industrialmente (Brand®). Blastocistos murinos após a coleta foram divididos em três grupos: Controle, embriões cultivados in vitro em KSOM por 72 horas; Grupo 1, vitrificados envasados em micropipetas de vidro (GMPs) esticadas manualmente; Grupo 2, vitrificados envasados nas GMCs (Brand® - 5 µL). O procedimento de vitrificação foi o seguinte: primeiro os embriões foram expostos à solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min e após transferidos para a solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por 30 s, envasados nas GMPS ou GMCs e imediatamente mergulhados em nitrogênio superresfriado. As taxas de sobrevivência dos embriões após o aquecimento e cultivo in vitro, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. O envase dos embriões nas GMCs proporcionou sobreviênvia embrionária similar à observada nos embriões envasados nas GMPs. / The aims of these experiments were first, determine the effect of dimethylformamide (DF) into cryoprotectant solutions and sencondly, evaluated the in vitro viability of blastocyst Mus domesticus domesticus vitrified into glass microcapillaries (Brand®). The first article described the efficiency of DF in association with ethylene glycol (EG) and 1-2 propanediol (PROH) on in vitro viability of vitrified mouse blastocysts. Initially, the differents cryoprotectant solutions were tested on its capacities to induce virification. In the second experiment to determine the cryoprotectant toxicity the embryos were exposed during 1, 3 and 10 min to three different equilibrium solutions ES1 (PBSm + 10% PROH+ 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA). After 72 hours of in vitro culture in KSOM medium, re-expansion and hatching rates showed no differences among the tested cryoprotectant solutions for 1 or 3 min exposition interval time. However, for the 10 min exposition interval time, ES3 was more effective to promote embryo survival than the others tested cryoprotectant solutions. In the third experiment, blastocysts were vitrified after been exposed to one of the equilibrium solutions (ES1, ES2 or ES3) during 1 min. After that the embryos were transferred to one of the vitrification solutions (VS1 = PBSm + 20% PROH + 20% DF+ 0.5% PVA; VS2 = PBSm + 20% EG+ 20% DF+ 0.5% PVA and VS3 = PBSm + 20% EG+ 20% PROH+ 0.5% PVA) during 30 s, loaded into glass micro pipettes (GMPs) to be plungged into super-cooled liquid nitrogen. The GMPs were thawed in air during 10 s, transferred into drops of PBSm + 0,25 M sucrose at 37 °C for 5 min, and finally transferred to KSOM medium for in vitro culture. After 72 hours the expansion and hatched rates were evaluated. Results demonstrated a significantly difference between the vitrification solutions, showing better hatching rates the embryos vitrified into the ES3/EV3 solution. Therefore, these data shows that the cryoprotectants solutions containning dimethylformamide have deleterious effects on the developmental competence of vitrified mouse blastocysts, and the highest expansion and hatching rates were obtained when the cryoprotectant solution containning an EG and PROH association. The purpose of the second study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into commercially available glass micro-capillaries (GMC - Brand® 5µL). In the early morning at day 4 of the pregnancy, collected blastocysts were divided in three groups: Control: embryos were in vitro culture during 72 hours into KSOM medium; Group 1, blastocyst vitrified into glass micropipettes (GMP); Group 2, blastocyst vitrified into GMC. The embryos were first exposed to the equilibrium solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0.5% PVA) for 1 min and then transferred into the vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. Blastocysts were loaded into GMP or GMC and plunged into super-cooled liquid nitrogen. Embryo warming was carried out by plunging the narrowest end of the capillaries into droplets of 0.25 M sucrose mantained at 37°C. After 5 min, embryos in vitro culture into KSOM medium for 72 hours. Blastocyst survival rates did not show significant differences between the groups. The tested manufacturated GMC (Brand®) showed the same efficiency as the GMP to load mouse blastocysts for vitrification.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O apelo pela conservação ambiental e o significativo aumento no número de organismos cultivados de alto valor genético demandam tecnologias que permitam conservar sua genética, mesmo após a morte do animal. A criopreservação de gametas possibilita a preservação da genética de espécies ameaçadas e de interesse comercial, prolongando sua vida reprodutiva evitando assim a perda de material genético por doenças, catástrofes, transferência de animais ou perda do habitat natural. A criopreservação tem sido aplicada à conservação de ovários e tecido ovariano, no entanto, há muitas controvérsias acerca de qual seria o melhor protocolo a ser utilizado. Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia do tecido ovariano de zebrafish criopreservado em cápsula de metal com o uso de diferentes soluções crioprotetoras. As soluções crioprotetoras utilizadas foram: 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol (SC1); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO (SC2); 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol + 0,5 M sacarose (SC3); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose (SC4). Após o descongelamento a integridade de cinco estágios de desenvolvimento folicular foi avaliada em cada grupo. A morfologia celular foi observada através de análise histológica. A análise dos dados mostrou que os folículos em estágio I e II foram os melhores criopreservados em todos os grupos experimentais. Sendo que, os grupos SC4 e SC2 foram os que apresentaram os melhores resultados, respectivamente com 88,26% e 84,2% de folículos sem alterações morfológicas. Já os estágios foliculares mais avançados de desenvolvimento (estágios IV e V) apresentaram-se com alterações em todos os grupos. Portanto, apesar do sucesso na criopreservação dos estágios foliculares mais iniciais (I e II) foi possível identificar alterações morfológicas em todos os grupos avaliados. Dentre as principais alterações identificadas estão a aglutinação do citoplasma e enrugamento e ruptura da membrana do envelope celular. Ao avaliar os resultados pode-se concluir que apesar do uso da capsula de metal em associação com as soluções SC4 e SC2 apresentarem os melhores resultados, as soluções SC1 e SC3 também foram eficientes na manutenção da integridade morfológica de folículos imaturos, e portanto essa metodologia pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de folículos imaturos. / The appeal for environmental conservation and the significant increase in the number of farmed organisms with high genetic value demand technologies to allow preserving their genetics, even after the death. Cryopreservation of gametes allows the preservation of genetics of the endangered and commercial species, prolonging their reproductive life. Furthermore, this technology prevents the loss of genetic material caused by diseases, disasters, transfer of animals or loss of natural habitat. Cryopreservation has been applied to the conservation of ovaries and ovarian tissue, however, there are many controversies regarding what would be the best protocol to use. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphology of cryopreserved zebrafish ovarian tissue using a metal capsule with four different cryoprotectant solutions. The cryoprotectant solutions used were: 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol (CS1); 1.5M methanol + 5.5 M Me2SO (CS2); 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose (CS3); Methanol + 1.5 M 5.5 M 0.5 M sucrose + Me2SO (CS4). After heating the integrity of the five stages of follicular development was assessed in each group. Cell morphology was observed by histological analysis. The thermal gradient inside the capsule and the sample was verified by a thermistor Pt500, model Keithley 2001A. The data analysis shows that the follicles at stage I and II were better cryopreserved among all experimental groups. The treatments CS4 and CS2 showed the best results, respectively with 88.26% and 84.2% of follicles without morphological changes in stage I. The most advanced follicular development stages (stages IV and V) showed changes in all treatments. Therefore, despite the successful cryopreservation of earlier follicular stages (I and II), it was possible to identify morphological changes in all the groups. Among the main changes identified, agglutination of cytoplasm and rupture of cell and wrinkling of the egg envelope could be observed. Despite the use of the metal capsule in association with the CS4 and CS2 solutions showed the best results, CS1 and CS3 solutions were also effective in maintaining the morphological integrity of immature follicles, therefore this method can be successfully used in the cryopreservation of immature follicles.

O zebrafish (Danio rerio) tem se destacado na pesquisa biomédica por sua homologia fisiológica e genética aos humanos. No entanto, há poucos relatos sobre a criopreservação ovariana desta espécie. Assim, pesquisamos a utilização de um recipiente de metal na vitrificação de tecido ovariano de zebrafish. O objetivo foi avaliar a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos de zebrafish após a vitrificação de fragmentos ou ovários inteiros usando a cápsula de metal. Primeiro, testamos quatro soluções de vitrificação (VS1 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol; VS2 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO; VS3 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol + 0,5 M sacarose; VS4 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose) e cinco estágios de desenvolvimento folicular utilizando o teste de coloração supravital iodeto de propídio combinado com diacetato de fluoresceína. Estes resultados mostraram que os folículos em estágio I, imaturos, apresentaram as maiores taxas de sobrevivência celular e que VS1 foi a melhor solução em termos de viabiidade. No Experimento 2, utilizou-se VS1 para vitrificar o tecido ovariano em diferentes dimensões (fragmentos ou ovários inteiros) e em dois diferentes recipientes (palheta de plástico ou cápsula de metal). Para avaliar a sobrevivência e o crescimento folicular dos folículos em estádio I, o diâmetro dos folículos foi mensurado antes e depois de cultivo in vitro por 24 horas. A morfologia folicular foi analisada por microscopia de luz após vitrificação utilizando a cápsula de metal. Os dados mostraram que a morfologia de folículos imaturos foi bem preservada após a criopreservação. A taxa de sobrevivência folicular foi maior (P <0,05) em fragmentos vitrificados, quando comparados com a vitrificação de ovários inteiros. Não houve diferenças significativas na sobrevivência e crescimento folicular entre os dois recipientes de vitrificação, palheta de plástico ou cápsula de metal. No entanto, a cápsula de metal diminui os riscos de contaminação, pois é hermeticamente fechada evitando contato com nitrogênio líquido e poder ser esterilizada, em vista que é manufaturada em aço inoxidável. Por essas razões, acreditamos que a cápsula de metal tem um uso potencial em reprodução humana para a vitrificação em grau clínico de tecido ovariano. / Zebrafish (Danio rerio) has excelled in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. However, there are few reports on ovarian cryopreservation of this specie. Thus, we studied the use of a metal capsule to vitrify zebrafish ovarian tissue. The aim of this study was to assess the survival and in vitro development of zebrafish follicles after vitrification of fragmented or whole ovaries using the metal capsule. First, we tested four vitrification solutions (VS1 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol; VS2 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO; VS3 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose; VS4 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO + 0.5 M sucrose) and five follicular developmental stages using fluorescein diacetate and propidium iodide supravital staining test. These results showed that immature follicles, stage one, presented the highest survival rates and VS1 the best vitrification solution in terms of viability. In Experiment 2, we used VS1 to vitrify ovarian tissue in different dimensions (fragments or whole ovaries) and tested two different carriers (plastic straw or metal capsule). To evaluate follicular survival and growth of stage I, we measured follicle diameter before and after twenty-four-hour in vitro culture. The follicular morphology was analyzed by light microscopy after vitrification using the metal capsule. Data showed that the immature follicles morphology was well preserved after cryopreservation. Follicular survival rate was higher (P<0.05) on vitrified fragments, when compared to whole ovaries. There were no significant differences on follicular survival and growth between the two vitrification devices, plastic straw or metal capsule. However, the metal capsule being tightly sealed and manufactured in stainless steel avoids contact with liquid nitrogen and can be sterilized reducing contamination risk. These reasons lead us to believe that the metal capsule has a potential use in human reproduction for the clinical grade vitrification of ovarian tissue.

Os experimentos tiveram como objetivo determinar a taxa de eclosão dos embriões vitrificados em volumes diferentes de 9,0 M de etileno glicol. Simultaneamente, testou-se dois procedimentos de estocagem dos fios de teflon, denominados caixa de aço inoxidável e globete/raque. No experimento I, os 881 embriões coletados foram distribuídos em 4 tratamentos: tratamento 1 (T1= controle): 307 embriões foram cultivados in vitro em meio PBSm, acrescido de 0,4% de BSA; tratamento 2 (T2): 292 embriões foram expostos à solução de glicerol 10% acrescida de 0,4% de BSA, envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos ao congelamento pelo método rápido em Biocool; tratamento 3 (T3): 138 embriões foram expostos durante 2 minutos à solução de desidratação (10% de EG + 6% BSA em PBSm) e então transferidos para a solução de vitrificação (50% de EG + 6% de BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos e foram colocados em volume de 1 μL no interior de um fio de teflon, medindo 0,4 mm de diâmetro, 2,0 cm de comprimento e 0,05 mm de espessura. Os fios foram acondicionados em uma caixa de aço inoxidável para serem armazenados em nitrogênio líquido; tratamento 4 (T4): 144 embriões foram expostos à solução de desidratação (10% de EG + 6% BSA em PBSm) e após 2 minutos, foram transferidos para a solução de vitrificação (50% de EG + 6% BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos, sendo após transferidos para um volume de 1 μL no interior do fio de teflon. Os fios de teflon foram estocados em globetes unidos às raques e mantidos em nitrogênio líquido. Após o aquecimento, os embriões foram cultivados em PBSm suplementado com 0,4% de BSA. As taxas de eclosão embrionária observadas foram: T1=76,29% (245/307); T2=41,05% (117/292); T3=37,98% (54/138) e T4=26,78% (37/144). No segundo experimento, 747 embriões foram distribuídos em 3 tratamentos: tratamento 1 (T1= controle): 80 embriões foram cultivados in vitro em meio KSOM acrescido de 0,4% de BSA; tratamento 2 (T2): 334 embriões expostos em solução de glicerol 10% acrescida de 0,4% de BSA, foram envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos ao congelamento pelo método rápido em Biocool; tratamento 3 (T3): 333 blastocistos foram expostos durante 2 minutos à solução de desidratação (10% de EG + 0,4% BSA em PBSm) e então transferidos para tubos eppendorf de 2,0 mL em contato com a solução de vitrificação (50% de EG + 0,4% BSA em PBSm). Após o cultivo in vitro, as taxas de eclosão embrionária observadas nos 3 tratamentos foram respectivamente: 88,75% (71/80), 40,44% (141/334) e 19,70% (66/333). Baseado nesses resultados conclui-se que embriões Mus domesticus domesticus submetidos à técnica de vitrificação após exposição à solução de 9,0 M de etileno glicol e envase em fios de teflon assegurou índices satisfatórios de sobrevivência embrionária. As taxas de sobrevivência dos embriões Mus domesticus domesticus foi independente do procedimento de estocagem em botijão de nitrogênio líquido. A vitrificação em solução de 9,0 M de etileno glicol com envase em tubos eppendorf não foi eficiente para promover altas taxas de sobrevivência embrionária, mas proporcionou segurança biológica aos embriões, durante o armazenamento. / This work was performed with Mus domesticus domesticus embryos to verify the in vitro viability of vitrified embryos using differents volumes of ethylene glycol–based solution. The experiment I consisted of four treatments. The 881 collected embryos were arranged as follows: treatment 1(control): 307 fresh embryos were cultured in vitro in PBSm + 0.4% BSA without being exposed to either dehydration or cryoprotectants agents; treatment 2: 292 embryos were loaded into 0.25 mL french straws containing 10% glycerol + 0.4% BSA in PBSm and after 10 minutes the straws were submitted to the rapid-freezing procedure (Biocool®, controlled freezer); treatment 3:138 embryos were exposed during 2 minutes to a dehydration solution (10% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm) and then transferred to the vitrification solution (50% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm) in teflon wire with 0.4 mm diameter, 2 cm length and 0.05 mm thickness containing the drop of 1μL volume, and placed into stainless steel box for the storage in LN2; treatment 4:144 embryos were exposed to a dehydration solution (10% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm) and after 2 minutes were transferred to the teflon wire, that was previousily loaded with 1μL of the vitrification solution (50% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm). Finally, the teflon wires were placed into plastic globets attached to aluminum canes and maintained in LN2. After thawing, the embryos were serially washed in PBSm, and then cultured in PBSm supplemented with 0.4% BSA. The hatched blastocyst rates observed in the treatments were: T1=76.29% (245/307); T2=41.05% (117/292); T3=37.98% (54/138) and T4=26.78% (37/144). In the second experiment, 747 embryos were arranged as follows: treatment 1(control): consisted of 80 fresh embryos cultured in vitro in KSOM medium + 0.4% BSA without being exposed to either dehydration or cryoprotectants agents; treatment 2: 334 embryos were loaded into 0.25 mL french straws containing 10% glycerol + 0.4% BSA in PBSm and after 10 minutes the straws were submitted to the rapid-freezing procedure (Biocool®, controlled freezer); treatment 3: 333 embryos were exposed during 2 minutes to a dehydration solution (10% ethylene glycol + 0.4% BSA in PBSm) and then transferred to the eppendorf tubes loaded with the vitrification solution (50% ethylene glycol + 0.4% BSA in PBSm). After in vitro culture, the hatched blastocysts rates observed were: T1=88.75% (71/80); T2=40.44% (141/334) and T3=19.70% (66/333). Based on these results it is concluded that the embryos of Mus domesticus domesticus submitted to vitrification procedure after being exposed to 9.0 M of ethylene glycol – based solution and loaded in teflon wires were efficient to promote satisfactory embryo survival rates. The survival rate of Mus domesticus domesticus embryos was independent of the LN2 storage procedure. The vitrification procedure after being exposed to 9.0 M of ethylene glycol – based solution and loaded in eppendorf tubes were not efficient to promote high embryo survival rate, but to warrant the embryo’s biologically security during storage in liquid nitrogen.

O objetivo deste experimento foi determinar a sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificado em palhetas na presença de uma haste metálica .Blastocistos Mus domesticus domesticus coletados no quarto dia após a fecundação, foram avaliados morfologicamente e divididos aleatoriamente em três grupos. Os embriões do grupo controle foram transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro por 48 horas. Os embriões selecionados para criopreservação foram expostos a uma solução crioprotetora constituída por PBSm + de 10% etileno-glicol + 10% propileno-glicol, para promover uma desidratação das células embrionárias. Após foram transferidos para a solução de vitrificação que continha 20% etilenoglicol + 20% propilenoglicol diluídos em PBSm, e mantidos durante 25 segundos, sendo imediatamente imersos em nitrogênio submetido à vácuo. As taxas de sobrevivência embrionária revelaram uma maior eficiência da técnica com a inserção da peça metálica (56,21% - 86/153) em relação ao método convencional (18,84% - 26/138). Concluímos assim que a presença da peça metálica em contato com a amostra propiciou maior taxa de sobrevivência dos embriões submetidos à vitrificação envasados em palhetas de 0,25 mL. / The aim of this experiment was determine the Mus domesticus domesticus blastocysts survival rates after vitrification in straws containing a metallic stick, that allows to increase the temperature changes among the nitrogen and the embryo sample. Day 4 Mus domesticus domesticus blastocysts were collected from superovulated donnors and after morphologically evaluation were randomly divided in three groups. The embryos select as control group were transferred to KSOM medium drops and in vitro cultured during 48 hours. The crioperservation selected embryos were first exposed to a cryoprotective solution (modified PBS + 10% ethylene-glycol and 10% propylene-glycol) to promote embryo cell dehydration and after exposed during 25 seconds to the vitrification solution composed by modified PBS + 20% ethylene-glycol and 20% propylene-glycol, and immediately plunged into slush liquid nitrogen. The embryo survival rate in group vitrified in the straws containing the metallic stick (56,21% - 86/153) was significantly different from the observed in the group loaded in original straws (18,84% - 26/138). In conclusion, the presence of the metallic stick in contact with the sample was efficient to enhance more suitable survival rates after vitrification of Mus domesticus domesticus blastocysts loaded in 0,25 mL straws.

O desenvolvimento de protocolos eficientes para a vitrificação de embriões mamíferos ainda é um desafio para os especialistas em reprodução. Soluções crioprotetoras de baixa toxicidade associadas a técnicas seguras de envase são fatores fundamentais, para proporcionarem uma eficiente identificação e controle sanitário das amostras. Dois experimentos foram realizados para determinar a taxa de sobrevivência de embriões Mus domesticus domesticus envasados em palhetas convencionais (0,25 mL), na presença de uma haste metálica de ouro, empregando soluções crioprotetoras descritas para a vitrificação em microvolume. No experimento 1, avaliou-se a toxicidade da solução de desidratação (SD: PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0,5 M sacarose), expondo-se os embriões por diferentes tempos: 1 (T1), 3 (T2) ou 10 min (T3). A toxicidade da solução de vitrificação (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) foi determinada pela exposição dos embriões durante 25, 60 ou 180 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. No experimento 2, avaliou-se a utilização do macrovolume (palhetas com a haste de ouro) e microvolume (micropipetas de vidro - GMP) na vitrificação dos blastocistos expostos à SV por 25 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. Os dados foram analisados pelo teste Qui-Quadrado (P<0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de eclosão dos embriões desidratados: T1=68,0% (38/56), T2=72,0% (36/50), T3=71,0% (39/55) e o grupo controle, (74,0% - 48/65). No entanto, houve diferença significativa (P<0,05) na taxa de eclosão em relação ao tempo de exposição dos embriões à SV. Os embriões desidratados por 1 ou 3 min e expostos à SV por 25 seg proporcionaram maiores taxas de re-expansão (79,0% vs 84,0%) e de eclosão (58,0% vs 72,0%), em relação aos tempos de exposição de 60 e 180 seg. No experimento 2, após a vitrificação dos embriões envasados nas palhetas com a haste de ouro, a taxa de eclosão dos blastocistos previamente desidratados por 1 min foi de 16,0% (10/64) e de 4,0% (2/57) quando previamente desidratados por 3 min. Por outro lado, os embriões envasados nas GMP, e previamente desidratados por 3 min, foram os que apresentaram maior taxa de eclosão (60,0% - 52/86). A vitrificação de embriões utilizando soluções crioprototetoras descritas para microvolume não foi eficiente na crioproteção dos blastocistos envasados em palhetas convencionais com a haste de ouro. / The development of efficient vitrification protocols for mammalian embryos still is a challenge for reproductive biologists. Low toxicity cryoprotectant solutions and safe vitrifications procedures that allow sample identification and sanitary control are fundamental factors. Two experiments were conducted to determine the survival rate of vitrified Mus domesticus domesticus embryos loaded into straws containing a metallic piece (manufactured in gold), using cryoprotectant solutions described for microvolume vitrification procedures. In Experiment 1, the toxicity of the dehydratation solution (SD: PBSm +10% EG + 10% PROH + 0,5 M sucrose) was evaluated using three different embryo exposure times: 1 (T1), 3 (T2) or 10 min (T3), in addition as well as the toxicity of the vitrification solution (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) was also tested upon embryo exposure for 25, 60 or 180 sec, previously dehydration for 1 or 3 min. In Experiment 2, the use of macrovolume (straw with a stem of gold) or microvolume (glass micropipettes – GMP) was evaluated for the vitrification of blastocysts after exposure to SV for 25 sec and previous dehydration for 1 or 3 min. Data were analized by the Chi-square test (P<0,05). In Experiment 1, statistical differences were not observed between hatching rates of dehydrated embryos: T1=68.0% (38/56), T2=72.0% (36/50), T3=71.0% (39/55) and control group embryos, (74.0% - 48/65). However, a significant difference (P <0,05) was observed between hatching rates after embryos exposure to the SV. Embryos dehydrated for 1 or 3 min and exposed for 25 sec to the SV showed higher re-expansion (79.0% vs. 84.0%) and hatching rates (58.0% vs. 72.0%) than embryos exposed to SV for 60 or 180 sec. In Experiment 2, after vitrification of the embryos loaded into straws containing a metallic piece showed a hatching rate of 16.0% (10/64) when previouslly dehydrated for 1 min, and 4.0% (2/57) when for 3 min. On the other hand, embryos loaded into GMP, previouslly dehydrated for 3 min, showed a higher hatching rate, (60.0% - 52/60). Embryo vitrification using a cryoprotectant solution described as suitable for microvolume was not efficient to cryoprotect blastocysts loaded into macrovolume straws containing a metallic piece.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro testar a presença da dimetilformamida (DF) nas soluções crioprotetoras e segundo avaliar a viabilidade in vitro pós aquecimento de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em microcapilares manufaturados industrialmente. O primeiro experimento testou a capacidade de vitrificação das diferentes soluções de vitrificação, compostas pelas combinações de etileno glicol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) com as diferentes porcentagens de DF. No segundo experimento se testou a toxicidade de 3 soluções de equilíbrio: ES1 (PBSm + 10% PROH + 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+ 10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA), através da exposição dos embriões durante 3 períodos de tempo (1, 3 e 10 min). O cultivo in vitro após a exposição às soluções de equilíbrio foi realizado em meio de KSOM durante 72 h. Os resultados de re-expansão foram semelhantes entre as três soluções, quando os embriões foram expostos por 1 ou 3 min. Por outro lado, a exposição à ES3 por 10 min, revelou uma maior taxa de sobrevivência dos embriões, em relação às outras soluções testadas. No terceiro experimento, após expor-se os embriões às soluções de equilíbrio, ES1, ES2 e ES3 por 1 min, a vitrificação foi realizada utilizando-se as seguintes soluções: VS1 (PBSm + 20% PROH + 20% DF + 0.5% PVA); VS2 (PBSm + 20% EG + 20% DF+ 0.5%PVA) and VS3 (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA). Imediatamente após a exposição por 30 s às soluções de vitrificação os embriões foram envasados em micropipetas de vidro (GMPs) e mergulhados em nitrogênio líquido superresfriado. As GMPs foram aquecidas no ar durante 10 s e após os embriões foram expostos durante 5 min ao PBSm + 0,25 M sacarose a 37 °C, finalmente transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro durante 72 horas. As taxas de re-expansão dos embriões após o cultivo in vitro foram as seguintes: ES1/VS1 = 12% (13/108); ES2/VS2 = 38% (46/111) e ES3/VS3 = 84% (89/105). A eclosão dos embriões observada após o cultivo in vitro foi de: ES1/VS1 = 3% (3/108); ES2/VS2 = 17% (19/111) e ES3/VS3 = 70% (73/105). As taxas de sobrevivência revelaram que a presença da dimetilformamida na solução crioprotetora reduz a viabilidade embrionária e que a associação de EG + PROH é eficiente na manutenção da viabilidade embrionária após a vitrificação. O segundo artigo descreve os experimentos de vitrificação, utilizando-se para o envase dos embriões um microcapilar de vidro (GMC), produzido industrialmente (Brand®). Blastocistos murinos após a coleta foram divididos em três grupos: Controle, embriões cultivados in vitro em KSOM por 72 horas; Grupo 1, vitrificados envasados em micropipetas de vidro (GMPs) esticadas manualmente; Grupo 2, vitrificados envasados nas GMCs (Brand® - 5 µL). O procedimento de vitrificação foi o seguinte: primeiro os embriões foram expostos à solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min e após transferidos para a solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por 30 s, envasados nas GMPS ou GMCs e imediatamente mergulhados em nitrogênio superresfriado. As taxas de sobrevivência dos embriões após o aquecimento e cultivo in vitro, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. O envase dos embriões nas GMCs proporcionou sobreviênvia embrionária similar à observada nos embriões envasados nas GMPs. / The aims of these experiments were first, determine the effect of dimethylformamide (DF) into cryoprotectant solutions and sencondly, evaluated the in vitro viability of blastocyst Mus domesticus domesticus vitrified into glass microcapillaries (Brand®). The first article described the efficiency of DF in association with ethylene glycol (EG) and 1-2 propanediol (PROH) on in vitro viability of vitrified mouse blastocysts. Initially, the differents cryoprotectant solutions were tested on its capacities to induce virification. In the second experiment to determine the cryoprotectant toxicity the embryos were exposed during 1, 3 and 10 min to three different equilibrium solutions ES1 (PBSm + 10% PROH+ 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA). After 72 hours of in vitro culture in KSOM medium, re-expansion and hatching rates showed no differences among the tested cryoprotectant solutions for 1 or 3 min exposition interval time. However, for the 10 min exposition interval time, ES3 was more effective to promote embryo survival than the others tested cryoprotectant solutions. In the third experiment, blastocysts were vitrified after been exposed to one of the equilibrium solutions (ES1, ES2 or ES3) during 1 min. After that the embryos were transferred to one of the vitrification solutions (VS1 = PBSm + 20% PROH + 20% DF+ 0.5% PVA; VS2 = PBSm + 20% EG+ 20% DF+ 0.5% PVA and VS3 = PBSm + 20% EG+ 20% PROH+ 0.5% PVA) during 30 s, loaded into glass micro pipettes (GMPs) to be plungged into super-cooled liquid nitrogen. The GMPs were thawed in air during 10 s, transferred into drops of PBSm + 0,25 M sucrose at 37 °C for 5 min, and finally transferred to KSOM medium for in vitro culture. After 72 hours the expansion and hatched rates were evaluated. Results demonstrated a significantly difference between the vitrification solutions, showing better hatching rates the embryos vitrified into the ES3/EV3 solution. Therefore, these data shows that the cryoprotectants solutions containning dimethylformamide have deleterious effects on the developmental competence of vitrified mouse blastocysts, and the highest expansion and hatching rates were obtained when the cryoprotectant solution containning an EG and PROH association. The purpose of the second study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into commercially available glass micro-capillaries (GMC - Brand® 5µL). In the early morning at day 4 of the pregnancy, collected blastocysts were divided in three groups: Control: embryos were in vitro culture during 72 hours into KSOM medium; Group 1, blastocyst vitrified into glass micropipettes (GMP); Group 2, blastocyst vitrified into GMC. The embryos were first exposed to the equilibrium solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0.5% PVA) for 1 min and then transferred into the vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. Blastocysts were loaded into GMP or GMC and plunged into super-cooled liquid nitrogen. Embryo warming was carried out by plunging the narrowest end of the capillaries into droplets of 0.25 M sucrose mantained at 37°C. After 5 min, embryos in vitro culture into KSOM medium for 72 hours. Blastocyst survival rates did not show significant differences between the groups. The tested manufacturated GMC (Brand®) showed the same efficiency as the GMP to load mouse blastocysts for vitrification.