Die Inzidenz von neurodegenerativen Erkrankungen und Schlaganfällen steigt in Folge der Überalterung der westlichen Gesellschaft immer weiter an. Die Behand-lung von Schlaganfall-, Alzheimer und Parkinsonpatienten ist bisher aber meist unbefriedigend bzw. weitgehend erfolglos. Ein neues Modell in der Schlaganfallforschung wurde daher am Schaf entwickelt. In diesem wird auch der in den letzten zwei Jahrzehnten verstärkt verfolgte zelltherapeutische Ansatz untersucht (BOLTZE et al. 2011, DREYER et al. 2012). Neurale Vorläuferzellen gelten dabei, auf Grund ihrer wichtigen Rolle bei den endogenen Reparaturmechanismen nach einem Schlaganfall, als besonders vielversprechend. Die Gewinnung dieser Zellen für eine autologe Transplantation ist jedoch aufwendig und nur eingeschränkt möglich. Im Vergleich zu Nervengewebe stellt die Haut eine sowohl beim Tier als auch beim Menschen leicht zugängliche und in ausreichendem Maß verfügbare Quelle verschiedener Stamm- und Vorläuferzellen dar. Bei verschiedenen Spezies wurde die Isolation spezieller, dermaler Vorläuferzellen beschrieben, die als skin-derived precursor cells (SKPs) bezeichnet werden. SKPs wiesen dabei ein ähnliches Differenzierungspotential auf wie neurale Vorläuferzellen (TOMA et al. 2001, FERNANDES et al. 2006). Ein Einsatz der SKPs in der Schlaganfalltherapie wäre somit denkbar, muss aber zunächst im Schafmodell erforscht werden. SKPs wurden jedoch noch nicht bei der Spezies Schaf isoliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, ein Isolationsprotokoll für SKPs aus der ovinen Dermis zu etablieren und diese morphologisch und immunzytologisch zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene in der Literatur beschriebene Isolati-onsverfahren an ovinen Hautproben getestet und modifiziert. Es wurden verschiedene Körperregionen auf ihre Eignung zur Probenentnahme und zur anschließenden Isolierung untersucht. Des Weiteren wurde der Effekt einer Rasur eine Woche vor Exzision des Hautareals auf die Sphäroidbildung überprüft. Der Einsatz von Enzymen in Kombinationslösungen oder singulär wurde variiert und eine unterschiedlich intensive mechanische Aufbereitung der Proben durchgeführt. Der Erfolg der zwei vielversprechendsten Isolationsprotokolle wurde statistisch validiert. Außerdem wurde der Effekt einer initialen Fibronektinbeschichtung analysiert. Die von den isolierten Zellen gebildeten sphärenartigen Zellaggregate wurden unter morphologischen Gesichtspunkten sechs und neun Wochen nach Isolation ausgewertet. Dabei wurden die Anzahl der Sphäroide/cm², die Größe und die Form berücksichtigt. Des Weiteren erfolgte eine immunzytologische Analyse der Sphäroide mit Fokus auf das in der Literatur beschriebene Expressionsmuster von SKPs und neuralen Vorläuferzellen. Für die Isolation von ovinen SKPs erwies sich die Regio nasofrontalis als das geeignetste Hautareal. Dabei war die Isolation eine Woche nach Rasur des beprobten Areals zuverlässiger als ohne diese. Bei vergleichender Betrachtung der Methoden erwies sich ein enzymatisch orientiertes Isolationsverfahren modifiziert nach FERNANDES und MILLER (2009) als zielführend. Neben einer hohen Anzahl an isolierten Zellen erfolgte in jedem Versuchsdurchgang eine Zusammenlagerung der Zellen in frei flotierenden Aggregaten. Diese waren im Median 70,97 µm groß. Auf Grund ihrer Geometrie ist es korrekter sie als Sphäroide und nicht, wie bei anderen Spezies üblich, als Sphären zu bezeichnen. Eine anfängliche Beschichtung der Zellkulturplatten mit Fibronektin hatte keinen fördernden Effekt auf die Bildung und die Größe der Sphäroide. Lediglich eine anfänglich höhere Proliferationsrate war bemerkbar. Immunzytologisch konnte gezeigt werden, dass in den Sphäroiden eine heterogene Zellpopulation vorlag. Die Sphäroide wurden überwiegend von Zellen gebildet, in denen neben mesenchymalen Markern auch klassische Vorläuferantigene wie Nestin und Sox2 nachgewiesen wurden. Das immunzytologische Expressionsmuster ist damit vergleichbar mit dem von SKPs anderer Spezies. Außerdem wurden in unterschiedlicher Ausprägung Antigene detektiert, die typischerweise in neuralen Vorläuferzellen der ventrikulären und subventrikulären Zone vorkommen. Dies konnte auch in den Positivkontrollen für das ovine Gehirn bestätigt werden. Die Anzahl proliferierender Zellen in den Sphäroiden war relativ gering und die Anzahl an kokultivierter Keratinozyten minimal. Die Zusammenfassung der heterogenen Vorläuferzellpopulation unter dem Begriff skin-derived precursor cells ist auf Grund ihres dermalen Ursprungs und ihrer morphologischen und immunzytologischen Eigenschaften gerechtfertigt. Somit ist es in dieser Arbeit gelungen, zum ersten Mal SKPs aus der ovinen Dermis zu isolieren und über neun Wochen zu kultivieren. Es wurde ein Isolationsprotokoll entwickelt, das eine Sphäroidbildung reproduzierbar ermöglicht und an die Gegebenheiten beim Schaf angepasst ist. Bevor eine autologe Transplantation von diesen SKPs etwa im Schlaganfallmodell am Schaf vorgenommen werden kann, ist eine intensivere Untersuchung der isolierten Zellen etwa mittels PCR durchzuführen und eine fluoreszenzbasierte Zellsortierung der heterogenen Vorläuferzellen zu entwickeln. / In consequence of the demographic changes in modern western society, the inci-dence of neurodegenerative diseases and stroke is increasing. Unfortunately, there is still no successful or at least satisfactory treatment available for patients who suffer from stroke Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Therefore, a new animal model in stroke research has been established in sheep (BOLTZE et al. 2011, DREYER et al. 2012). First cell therapy studies have already been performed in this model. Especially neural precursor cells seem to be promising as they play an important role in endogenous repair processes in the brain after stroke. However, the extraction of these cells prior to an autologous transplantation is elaborate and of limited success. Compared to neural tissue, skin is an easily accessible and sufficiently available source of a variety of stem and precursor cells in animals as well as in humans. Thus, the isolation of a specific type of dermal precursor cells, called skin-derived precursor cells (SKPs), seems to be easier compared to neural precursor cells and in vitro SKPs are capable of neural differentiation as well (TOMA et al. 2001, FERNANDES et al. 2006). According to these findings, a therapeutic application of SKPs after stroke seems to be promising. Prior to that, however, intensive studies in the ovine stroke model are necessary. Thus, SKPs have to be isolated from the dermis of sheep for an autologous transplantation. Therefore, the aim of this dissertation has been the establishment of an optimal isolation protocol for SKPs from the ovine dermis as well as the morphological and by immunocytochemical characterisation of those cells. Within this study, several previously described isolation protocols were modified for ovine skin. Skin samples were taken from several body regions to assess the local suitability for excision and isolation. Additionally, the effect of shaving the areas one week before sampling on spheroid forming was tested. A variety of enzymes was used alone and in combination. Furthermore, the effectiveness of an isolation protocol using enhanced mechanical treatment was analysed. The two most promising protocols were evaluated statistically and compared to each other. In these experiments, the influence of an initial fibronectin coating was determined as well. The isolated cells formed spheroids, which were assessed after six and nine weeks of cultivation considering the amount of spheroids per cm², their size and form. Moreover, immunocytochemical tests were conducted, focusing on expression patterns described for SKPs and neural precursor cells. According to these experiments, it is advisable to take skin samples from the naso-frontal region one week after shaving. Comparing all tested protocols, a predominantly enzymatic isolation protocol modified according to FERNANDES and MILLER (2009) was most successful. A high cell yield was achieved and free-floating spheroids formed spontaneously in all test runs. The median diameter of these spheroids was 70.97 µm. Due to their three-dimensional shape, it is more correct to use the term “spheroid” instead of the commonly used term “sphere”. Growing the isolated cells initially on fibronectin coated culture plates does not support both formation and size of the spheroids. Only a higher cell proliferation at the beginning of cultivation can be noticed. Immunocytochemical assays demonstrated that the formed spheroids consisted of a heterologous cell population. Besides mesenchymal antigens the cells in the spheroids expressed characteristic antigens of precursor cells, like Nestin and Sox2. Thus, the immunocytochemical expression pattern is comparable to SKPs isolated from other species. Furthermore, common markers of neural precursor cells of the ventricular and subventricular zone, whose existence in the ovine brain was also proven in this study, were detected in the spheroid forming cells. There were only a few proliferating cells and a minimal amount of keratinocytes in the spheroids. Due to the dermal origin and the given morphological and immunocytochemical characteristics, the heterogeneous cell population can be addressed by the term “skin-derived precursor cells”. In conclusion, in this study ovine SKPs were isolated for the first time and cultured successfully over nine weeks. An isolation protocol was established, which guarantees reproducible formation of spheroids in cell isolates from ovine dermis. Further intensive examinations of the isolated cells, for example using PCR, have to be conducted before SKPs can be applied in autologous transplantation in the ovine stroke model. Additionally, the usage of fluorescence-activated cell sorting of the heterogeneous precursor cells should be considered.

Bones are essential vertebrate structures that arise during embryonic development from mesenchymal condensations. In the skull vault, bones arise from condensations above the eye, which later expand to cover the brain. Contrarily to most bones in the axial skeleton, which develop through an intermediate cartilage template, the skull vault develops from the direct differentiation of mesenchymal progenitors into bone cells, or osteoblasts. The molecular details of this process have however remained elusive, since systems allowing the dynamical observation of cells while they undergobone differentiation have been lacking. Recent data in the Tabler lab, acquired by imaging skull caps ex vivo, has uncovered that differentiation takes place during expansion stages, and that a progressive wave of differentiation underlies the presence of intermediate states between progenitors and osteoblasts. In this thesis, we focused on the cranial mesenchyme to study the differentiation trajectory of skull bone progenitors at single cell resolution. By harnessing single cell RNA-Sequencing, we elucidated the heterogeneity of cells in the cranial mesenchyme, describing in molecular terms meningeal, dermal, osteoblastic and progenitor populations. By modelling dynamics from single cell RNA-Seq data, we inferred that a population expressing intermediate levels of cartilage specific genes, such as Col2a1, underlies differentiation towards dermal, meningeal and bone fate. Using single cell resolution in situ RNA hybridisation, we mapped the anatomical location of progenitors in a layer between the meninges and the bone. To better understand the relationship between the phenotype of these progenitors and differentiated cartilage, we examined the presence of cartilage-like ECM in the tissue. Finally, we asked whether similar progenitors may be present in other intramembranous bones outside the skull by re-applying these tools on the clavicle. Taken together, our data lead us to hypothesise a mechanism for differentiation of the cranial mesenchyme, which can explain previous phenotypes reported in the literature and supports a role for cartilage-like cells in intramembranous ossification.

Das erwachsene Gehirn enthält neuronale, multipotente Stammzellen, aus denen in den beiden bekannten neurogenen Regionen des Gehirn, im Hippocampus und im olfaktorischen System, neue Nervenzellen hervorgehen. Aus Transplantationsstudien und anderen Untersuchungen weiß man, daß es die zelluläre Umgebung ist, die die neurogene Permissivität und damit die Entwicklung einer reifen neuen Nervenzelle aus einer Stamm- oder Vorläuferzelle, bestimmt. Die Schlüsselfrage lautet daher: Was macht eine neurogene Region neurogen? Neurogenität ist mehr als die Präsenz von neuralen Stammzellen. Die aktivitätsabhängige Regulation adulter hippocampaler Neurogenese stellt eine physiologische, positive Modulation von Neurogenität im erwachsenen Gehirn dar. Aktivitätsabhängige Regulation adulter hippocampaler Neurogenese ist vielstufig und kein An/Aus-Phänomen. Die unterschiedlichen Stufen der Regulation unterliegen unterschiedlicher genetischer Determination und unterschiedlicher Empfindlichkeit auf aktivitätsabhängige Stimuli. Die Steuerung des Überlebens neugeborener Zellen stellt möglicherweise den entscheidenden Schritt auf dem Weg zu einem neuen Neuron dar. Die aktivitätsabhängige Selektion durch eine überlebensfördernde Wirkung rekrutiert jedoch aus einem Pool proliferierender Vorläuferzellen, die das neurogene Potential darstellen. Die subtile Regulation adulter hippocampaler Neurogenese durch funktionsabhängige Stimuli legt eine Relevanz für hippocampale Funktion, insbesondere Lern- und Gedächtnisvorgänge nahe. Entsprechend muß aber auch eine Bedeutung für hippocampale Pathologie diskutiert werden. Das Verständnis darüber, wie Neurogenität funktions- und aktivitätsabhängig modulierbar ist, ist von größter Relevanz für die Frage, ob und wie sich Neurogenese aus ruhenden neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen auch außerhalb neurogener Regionen induzieren und in therapeutischer Absicht nutzen läßt. / The adult brain contains neuronal, multipotent stem cells. In two neurogenic regions of the adult brain, hippocampus and olfactory system, new neurons are generated from these stem cells. From transplantation studies and other investigations it is known that the cellular microenvironment provides the neurogenic permissiveness and determines the development of a mature new neuron from a stem or progenitor cell. Thus, the key question is, what defines a neurogenic region as neurogenic, if it is not the presence of neural stem cells alone. The activity-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis represents a physiologic and positive modulation of neurogenic permissiveness in the adult brain. Activity-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis occurs on multiple steps and is not an on/off phenomenon. The different levels of regulation are differentially influenced by genetic determination and different susceptibility to activity-dependent stimuli. The regulation of the survival of a newly generated cells might be the key step in the development of a new neuron. The activity-dependent recruitment of new neurons by means of a survival-promoting effect acts upon a pool of proliferating progenitor cells, which represent the neurogenic potential. The subtle regulation of adult neurogenesis by functional stimuli suggests a relevance of adult hippocampal neurogenesis for hippocampal function, in particular learning and memory. Accordingly, a potential relevance for hippocampal pathology has to be considered. Insights on how neurogenic permissiveness can be modulated in response to functional stimuli has important implications for the question, if and how neurogenesis from quiescent neuronal stem or progenitor cells can be induced inside and outside of neurogenic regions of the adult brain and can be used for therapeutic purposes.

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Hintergrund: Endothelzellen spielen sowohl in Homöostase als auch in Stresssituationen eine wesentliche Rolle bei der Regulation und der Erhaltung der hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Viele Zytokine und Wachstumsfaktoren werden für die natürliche HSC-Aktivität benötigt und von den Endothelzellen exprimiert. Neben der Unterstützung der hämatopoetischen Stammzellaktivität stellen Endothelzellen ein Gefäßversorgungsnetzwerk zur Verfügung, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Fragestellung: In der hier vorgestellten Arbeit habe ich die Hypothese verfolgt, dass eine Veränderung der Sauerstoffsensorik in Endothelzellen eine Modifizierung der Aktivität hämatopoetischer Stammzellen ermöglicht. Material und Methoden: Trotz des Wissens um die Bedeutung von Sauerstoff für die Endothelzellen fehlt uns das Verständnis dafür, wie die Sauerstoffsensorik der Endothelzellen die lokalen Knochenmark-Nischenzellen und die HSCs reguliert. Um einen Einblick in diesen Mechanismus zu erhalten, haben wir ein Mausmodell mit einem endothelzellenspezifischen Knockout des zentralen Sauerstoffsensors PHD2 entwickelt. Mit diesem in vivo-Ansatz habe ich versucht, den Einfluss von Veränderungen der Hypoxie-Signalwegproteine in Endothelzellen auf HSCs und ihre Nische zu untersuchen. Ergebnisse: Ich konnte in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Morphologie der sinusförmigen Endothelzellen des Knochenmarks nach Verlust von PHD2 verändert ist. Außerdem konnte ich eine ausgeprägte Gefäßvasodilatation, begleitet von reduzierten hypoxischen Bereichen im angrenzenden Knochenmark beobachten. Zudem stellte ich fest, dass die Inaktivierung von PHD2 in Endothelzellen zu einem Rückgang des Knochenvolumens und zu einer Verminderung der an das Endothel angrenzenden Perizyten führt. Auffallend ist, dass sich gravierende Unterschiede in den hämatopoetischen Zellen der Peripherie zeigten, insbesondere war ein deutlicher Anstieg der zirkulierenden Leukozyten bei den KO-Mäusen zu erkennen. Dieser Phänotyp ist mit einer Vermehrung der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in Knochenmark und Milz verbunden. Darüber hinaus konnte ich zeigen dass die B-Zelldifferenzierung in der Milz vollständig zum Erliegen kommt, was zu einem signifikanten Rückgang der B-Zellen in der Marginalzone führt. Um die Funktionalität von Endothelzellen mit deletiertem PHD2 zu beurteilen, habe ich die Mäuse mit einer nicht-tödlichen Dosis ionisierender Strahlung behandelt. Die Analyse der endothelialen Zellregeneration im KO-Knochenmark zeigte eine Verminderung der Gefäßneubildung ohne Einfluss auf das gesamte Gefäßlumen im Vergleich zu unbehandelten Wurfgeschwistern. Außerdem stellte ich fest, dass sich in den ersten 3 Wochen nach der Bestrahlung bei Mäusen mit fehlendem PHD2 auf der Endothelzellenoberfläche das RBC-Kompartiments schneller regeneriert. Ich konnte ausschließen, dass dieser Effekt auf eine erhöhte Produktion von RBCs zurückzuführen ist, was zu der Hypothese führte, dass eine Verminderung des endothelialen PHD2 entweder zu einem längerfristigen Überleben der RBCs oder zu einer beeinträchtigten RBC-Clearance führt. Zusätzlich habe ich einen Anstieg in der Anzahl der quieszenten hämatopoetischen Vorläuferzellen bei Mäusen mit endothelialer PHD2-Deletion beobachtet, was darauf hindeutet, dass das endotheliale PHD2 Downstream-Signaling den Zellzyklus von hämatopoetischen Vorläuferzellen bei myeloablativen Stress beeinflusst. Abschließend konnte ich zeigen, dass ein Großteil der beobachteten Phänotypen bei KO-Mäusen durch den nachgeschalteten Transkriptionsfaktor HIF-2α vermittelt wird. Die Verwendung meiner selbstgenerierten Doppel-Knockout-Mauslinie, bei der erstmalig gleichzeitig PHD2 und HIF-2 in den Endothelzellen deletiert sind, führte zu eine vollständige Umkehrung des hämatopoetischen Phänotyps der bei den PHD2-Knockout-Mäusen im Steady-State beobachtet wurde. Zusätzlich wird der zuvor beobachtete signifikante Anstieg der Lymphozyten und der Rückgang der Erythrozyten- und Thrombozytenzahl in den Doppel-Knockout-Mäusen genetisch wiederhergestellt. Gleichzeitig reduziert sich die Entwicklung der marginalen B-Zellen im stationären Zustand wieder auf das Wildtyp-Niveau. Des Weiteren habe ich nach der Bestrahlung von Mäusen mit ionisierender Strahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen WT und KO in ihrer hämatopoetischen Zellregeneration mehr feststellen können. Schlussfolgerungen: Zusammengenommen konnte ich in meiner Dissertation neue Eigenschaften von Hypoxie-Pathway-Proteinen in Endothelzellen mit Einfluss auf hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen sowie auf verschiedene Kompartimente ihrer Nische demonstrieren; sowohl im stationären Zustand als auch nach Belastung durch Bestrahlung. Abschließend unterstreicht meine Arbeit die entscheidende Bedeutung der Sauerstoffsensorik im Knochenmark und gibt neue Einblicke in das Zusammenspiel zwischen dem Knochenmark-Endothel und dem hämatopoetischen System.:1 Introduction 1.1 Oxygen is necessary for survival of multicellular organisms 1.2 Oxygen sensing is necessary for induction of rapid cellular response 1.3 Endothelial and hematopoietic tissues together deliver oxygen 1.4 Hematopoietic stem cells give rise to blood cells 1.5 Regulation of HSCs is dependent on cells of the hematopoietic niche 1.6 Types of HSC regulation 1.7 Cancer therapy affects all highly proliferating cells 1.8 Irradiation stress disrupts hematopoietic stem cell niche signaling 1.9 Hypoxia induced signaling during recovery after irradiation 2 Aims of the thesis Aim 1: Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche. 3 Materials and methods 3.1 Mice. 3.2 Histology, immunohistochemistry and immunofluorescence staining 3.2.1 Tissue processing prior to staining: 3.2.2 Staining: 3.3 Endothelial cell sorting 3.4 Mature hematopoietic cell isolation 3.5 Expression analysis 3.6 Hypoxyprobe 3.7 Quantitative image analysis 3.8 Bone structure analysis 3.9 Blood analysis 3.10 FACS analysis 3.11 Cell cycle analysis 3.12 RBC transfusion 3.13 Statistics. 4 Results 4.1 Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche 4.1.1 Validation of the Flk1:cre line endothelial cell targeting 4.1.2 Characterization of the endothelial cell morphology and vessel function upon PHD2 inactivation 4.1.3 Loss of endothelial PHD2 leads to a decrease in bone marrow niche 4.1.4 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to alterations of hematopoietic cells in the periphery 4.1.5 Significant increase of white blood cells in the periphery upon loss of endothelial PHD2 4.1.6 Loss of endothelial PHD2 does not impact the hematopoietic stem cells in the bone marrow. 4.1.7 Loss of PHD2 leads to increase in hematopoietic stem cells in the spleen 4.1.8 Loss of endothelial PHD2 impacts lineage-committed progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.9 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to an increase in frequency and activity of myeloid progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.10 Loss of endothelial PHD2 impacts lymphocyte progenitors in secondary lymphatic organs but not in the bone marrow 4.2 Defining the impact of radiation exposure on the recovery of PHD2-deficient endothelial cells and its hematopoietic compartment. 4.2.1 Characterization of the non-lethal ionizing radiation damage to bone marrow endothelial and hematopoietic recovery 4.2.2 Loss of PHD2 from endothelium impacts endothelial recovery after myeloablative assault 4.2.3 Loss of PHD2 in endothelial cells and its subsequent effect on hematopoietic recovery following ionizing radiation exposure 4.2.4 Mechanism of increased RBC numbers is not due to an increase in hematopoietic stem cell frequency or activity in bone marrow or the spleen, 2 weeks after irradiation 4.3 Characterization of the influence of the transcription factor HIF-2α in mice lacking EC PHD2 4.3.1 The molecular signal transduction upon PHD2 inactivation is mediated by the HIF-2 transcription factor. 4.3.2 Loss of PHD2 and HIF-2α from endothelial cells partially rescues alterations in bone marrow endothelial cell morphology 4.3.3 Simultaneous loss of PHD2 and HIF-2α in endothelial cells completely reverses the hematopoietic phenotype observed in KO mice. 4.3.4 HIF-2α transcription factor induce signaling on endothelial cells that leads to marginal zone B cell impairment 4.3.5 Loss of PHD2 and subsequent stabilization of the HIF-2αtranscription factor is responsible for the increased recovery of RBCs following ionizing radiation 5 Discussion 6 References 7 List of abbreviations 8 Abstract 9 Zussamenfassung 10 Acknowledgements 11 Deklarations / Background: Endothelial cells have an essential role in hematopoietic stem cell (HSC) regulation and maintenance during homeostasis and stress. Many cytokines and growth factors are required for normal HSC activity and are expressed by the endothelial cells. Along the support of hematopoietic stem cell activity, endothelial cells provide vessel delivery network to ensure proper oxygen delivery. Despite the importance of oxygen on endothelial cells, we lack the understanding of how oxygen sensing in endothelial cells regulates the local bone marrow niche cells and HSCs. Hypothesis: I have hypothesized that by modulating oxygen sensor in endothelial cells I will be able to modify the activity of hematopoietic stem cells Material and methods: To gain insight into this system, we developed a mouse model with an endothelial cell-specific knockout of the central oxygen sensor PHD2. Using this in vivo approach I sought to determine the impact of changes in hypoxia pathway proteins in endothelial cells on HSCs and their niche. Results: First, I revealed that the morphology of bone marrow sinusoidal endothelial cells is altered upon loss of PHD2. I observed prominent vessel vasodilation accompanied by reduced hypoxic areas in their adjacent marrow. Moreover, I determined that inactivation of PHD2 in endothelial cells led to a decrease in bone volume and pericytes adjacent to endothelium. Remarkably, I observed profound differences in the hematopoietic cells of the periphery. Specifically, I observed a profound increase in circulating leukocytes of KO mice. This phenotype was related to an increase in hematopoietic stem and progenitor cells in bone marrow and spleen. Moreover, I found a complete impairment of B cell differentiation in the spleen, which consequently led to a profound decrease in marginal zone B cells. To assess the functionality of endothelial cells lacking PHD2, I subjected the mice to a non-lethal dose of ionizing radiation. Analysis of endothelial cell recovery in KO bone marrow revealed a decrease in the formation of new vessels without an impact on the overall vascular lumen compared to WT littermates. Similarly, I found an enhanced recovery of the RBC compartment during the first 3 weeks after irradiation in mice lacking PHD2 on endothelial cells. I excluded the possibility that this effect was due to an increased RBC production, which led to hypothesis that inhibition of endothelial PHD2 results in prolonged RBC survival or impaired RBC clearance. Additionally, I observed an increase in quiescent hematopoietic progenitors cells in mice lacking PHD2 in endothelial cells that implies that endothelial PHD2 downstream signaling impact cycling of hematopoietic progenitors upon myeloablative stress. Finally, I demonstrated that a majority of the observed phenotypes in KO mice are mediated by the downstream HIF-2α transcription factor. Using my unique self-made double knockout mouse line simultaneously lacking PHD2 and HIF-2 in their endothelial cells, I was able to reveal a reversal of the hematopoietic phenotypes observed in the single PHD2 knockout mice during steady state. Additionally, the previously observed significant increase in lymphocyte and decrease in erythrocyte and thrombocyte numbers was genetically rescued in double knockout mice. Similarly, marginal zone B cell development returned to wild-type levels during steady state. Moreover, after subjecting mice to ionizing radiation I did not observe any significant differences between WT and KO in their hematopoietic cell recovery. Conclusions: Taken together, during my thesis I was able to demonstrate novel properties of hypoxia pathway proteins in endothelial cells having an impact on hematopoietic stem and progenitor cells as well as different compartments of their niche; both during steady state and radiation stress. In conclusion, my work underscores the critical importance of oxygen sensor signaling in the bone/bone marrow and provides new insight into the interplay between the bone marrow endothelium and the hematopoietic system.:1 Introduction 1.1 Oxygen is necessary for survival of multicellular organisms 1.2 Oxygen sensing is necessary for induction of rapid cellular response 1.3 Endothelial and hematopoietic tissues together deliver oxygen 1.4 Hematopoietic stem cells give rise to blood cells 1.5 Regulation of HSCs is dependent on cells of the hematopoietic niche 1.6 Types of HSC regulation 1.7 Cancer therapy affects all highly proliferating cells 1.8 Irradiation stress disrupts hematopoietic stem cell niche signaling 1.9 Hypoxia induced signaling during recovery after irradiation 2 Aims of the thesis Aim 1: Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche. 3 Materials and methods 3.1 Mice. 3.2 Histology, immunohistochemistry and immunofluorescence staining 3.2.1 Tissue processing prior to staining: 3.2.2 Staining: 3.3 Endothelial cell sorting 3.4 Mature hematopoietic cell isolation 3.5 Expression analysis 3.6 Hypoxyprobe 3.7 Quantitative image analysis 3.8 Bone structure analysis 3.9 Blood analysis 3.10 FACS analysis 3.11 Cell cycle analysis 3.12 RBC transfusion 3.13 Statistics. 4 Results 4.1 Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche 4.1.1 Validation of the Flk1:cre line endothelial cell targeting 4.1.2 Characterization of the endothelial cell morphology and vessel function upon PHD2 inactivation 4.1.3 Loss of endothelial PHD2 leads to a decrease in bone marrow niche 4.1.4 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to alterations of hematopoietic cells in the periphery 4.1.5 Significant increase of white blood cells in the periphery upon loss of endothelial PHD2 4.1.6 Loss of endothelial PHD2 does not impact the hematopoietic stem cells in the bone marrow. 4.1.7 Loss of PHD2 leads to increase in hematopoietic stem cells in the spleen 4.1.8 Loss of endothelial PHD2 impacts lineage-committed progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.9 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to an increase in frequency and activity of myeloid progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.10 Loss of endothelial PHD2 impacts lymphocyte progenitors in secondary lymphatic organs but not in the bone marrow 4.2 Defining the impact of radiation exposure on the recovery of PHD2-deficient endothelial cells and its hematopoietic compartment. 4.2.1 Characterization of the non-lethal ionizing radiation damage to bone marrow endothelial and hematopoietic recovery 4.2.2 Loss of PHD2 from endothelium impacts endothelial recovery after myeloablative assault 4.2.3 Loss of PHD2 in endothelial cells and its subsequent effect on hematopoietic recovery following ionizing radiation exposure 4.2.4 Mechanism of increased RBC numbers is not due to an increase in hematopoietic stem cell frequency or activity in bone marrow or the spleen, 2 weeks after irradiation 4.3 Characterization of the influence of the transcription factor HIF-2α in mice lacking EC PHD2 4.3.1 The molecular signal transduction upon PHD2 inactivation is mediated by the HIF-2 transcription factor. 4.3.2 Loss of PHD2 and HIF-2α from endothelial cells partially rescues alterations in bone marrow endothelial cell morphology 4.3.3 Simultaneous loss of PHD2 and HIF-2α in endothelial cells completely reverses the hematopoietic phenotype observed in KO mice. 4.3.4 HIF-2α transcription factor induce signaling on endothelial cells that leads to marginal zone B cell impairment 4.3.5 Loss of PHD2 and subsequent stabilization of the HIF-2αtranscription factor is responsible for the increased recovery of RBCs following ionizing radiation 5 Discussion 6 References 7 List of abbreviations 8 Abstract 9 Zussamenfassung 10 Acknowledgements 11 Deklarations

Atherosklerotische Arterien unterliegen strukturellem Umbau und chronischer Inflammation, die von einer dynamischen Entwicklung von Vasa vasorum (VV) begleitet wird. Die Beteiligung von Leukozyten und von vaskulären Vorläuferzellen an der Neovaskularisierung sowie die intimale Hyperplasie stehen im Zentrum der Atheroskleroseforschung. Damit verbundene Erkenntnisse könnten neue therapeutische Ansätze ermöglichen. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der morphologischen Verteilung von Leukozyten (CD45, CD68, Mastzellen) und von Zellen mit Vorläufermarkern (CD34, CD117, VEGFR-2) in menschlichen Coronararterien mit verschiedenen atherosklerotischen Schweregraden. Mittels immunhistologischer Technik wurden Intima und Adventitia untersucht und die Ergebnisse zu den atherosklerotischen Schweregraden und der Neovaskularisierung korreliert. In Intima, Adventitia und dem perivaskulären Fettgewebe hat die Dichte der CD45+ Lymphozyten ihr Maximum im atherosklerotischen Grad 3. Dabei konnte sowohl in der Intima als auch in der Adventitia gezeigt werden, daß eine lineare Korrelation der CD45+ Lymphozyteninfiltration und VV-Dichte vorliegt. Es wurden zwei unterschiedliche Entzündungsmuster festgestellt. Beide zeigen in Grad 3 eine Zunahme der Zelldichten. In Grad 4-5 fällt die Dichte des einen Musters (CD45+, VEGFR-2+, VV) jedoch ab, während die Dichte des anderen Musters (CD34+, CD68+, Tryptase+, CD117+) in Grad 4-5 keine Veränderung aufweist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Leukozyten und vaskuläre Vorläuferzellen im Verlauf der Atherogenese wechselnde Funktionen wahrnehmen können. Sie nehmen offensichtlich VV als Eintrittspforte in die Gefäßwand.

Pancreatic β-cells have a central function in the regulation of glucose homeostasis by releasing the blood sugar-lowering hormone insulin. Disruption of this process results in diabetes, which has a tremendous impact on the quality of life and requires lifelong treatment. Elucidating the mechanisms of pancreatic progenitor cell differentiation into fully functional β-cells will contribute to identifying the underlying reasons for β-cell dysfunction and to finding a cure for diabetes. Aldh1b1 was identified by our research group as a regulator of pancreas development and β-cell functionality. Aldh1b1 is a mitochondrial enzyme, expressed in all embryonic pancreas progenitors. Its expression is switched off during the process of differentiation and is undetectable in differentiated cells. Functional inactivation of Aldh1b1 in the mouse leads to premature differentiation of progenitor cells in the embryo and dysfunctional β-cells in the adult. However, the enzymatic function of Aldh1b1 in pancreas progenitors and how it ultimately affects β-cell functionality remained to be elucidated. In this study, I analyzed the role of Aldh1b1 in the metabolism of embryonic pancreas progenitor cells and its impact on chromatin structure and gene expression in both, progenitors and postnatal β-cells. Flow cytometry analysis of freshly isolated Aldh1b1 null embryonic pancreas progenitors showed a significant increase in ROS levels as well as a significant decrease in mitochondrial mass, whereas the mitochondrial membrane potential was not affected. To elucidate the impact of Aldh1b1 on cellular metabolism, I conducted metabolic flux experiments and untargeted metabolomics studies using FACS-isolated embryonic pancreas progenitors expanded in a 3D spheroid culture. Analyses following metabolic labeling with either 13C6-Glucose or 13C2-Glutamine showed that the absence of Aldh1b1 lead to an increase of the reductive glutamine metabolism towards citrate, a reaction that channels carbon units into the acetyl-CoA biosynthesis. However, the ACLy-dependent flux towards acetyl-coA synthesis was reduced and this was consistent with reduced expression of ACLy as well as the citrate transporter SLC25a1. A decrease in cellular acetyl-CoA would reduce histone acetylation. Untargeted metabolomics showed an increase in the concentration of S-adenosyl-methionine, suggesting increased DNA and histone methylation. Consistent with these findings, ATAC-Seq analyses on freshly isolated pancreatic progenitors showed reduced chromatin accessibility at genes implicated in chromatin organization, protein acetylation and histone modification. Transcription motif analysis showed that the affected genomic sites were mainly associated with the binding of Klf/Sp and Nrf1 transcription factors. Transcriptome analyses displayed that the expression of genes implicated in progenitor differentiation, ECM organization and transcriptional regulation was affected. Furthermore, transcriptome analyses of early postnatal β-cells uncovered early signs of oxidative stress and increased proliferation, thus providing the basis to explain the β-cell phenotype in Aldh1b1 null mice. I then used organotypic cultures of embryonic pancreata to investigate the connection between high ROS levels and aberrant differentiation in the Aldh1b1 null pancreata. Reducing ROS levels using NAC enabled the reversal of the aberrant transcription factor expression and increased viability of Aldh1b1 null explants, thus identifying high ROS levels as a driving force in this process. To investigate how persisting Aldh1b1 expression would affect progenitor differentiation, I generated ROSA26LSLAldh1b1, an inducible constitutive Aldh1b1 expression line. Progenitors with continuous Aldh1b1 expression avoided the endocrine cell fate, underscoring the importance of timely Aldh1b1 downregulation in the course of β-cell differentiation. Altogether, my work provides strong evidence for the role of Aldh1b1 as a metabolic regulator in the process of progenitor cell differentiation and identifies a link between metabolism and gene regulation through chromatin accessibility during development. Aldh1b1 inactivity causes defects in embryonic progenitor cells as well as postnatal β-cells and could therefore contribute, as genetic risk factor, to the development of hyperglycemia and diabetes later in life. Comprehending the mechanisms underlying the process of pancreas progenitor differentiation as well as the origins of β cell dysfunction should assist in the design of novel therapeutic interventions for diabetes.

Es wurde Zellneubildung im erwachsenen cerebralen Cortex der Maus in Abhängigkeit von Umweltbedingungen und Aktivitätsgrad untersucht. Es war bekannt, dass eine reizreiche Umgebung und körperliche Aktivität die Neubildung von Nervenzellen im erwachsenen Hippokampus steigern. Als Zellproliferationsmarker wurde BrdU appliziert und BrdU-inkorporierende Zellen 1 Tag und 4 Wochen nach BrdU-Gabe unter Verwendung immunhistochemischer Methoden zur Detektion BrdU-inkorporierender Zellen in verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten quantifiziert. Die phänotypische Charakterisierung BrdU+ Zellen wurde durch kombinierte Verwendung immunhistochemischer Methoden und konfokaler Mikroskopie vorgenommen. Die im adulten murinen cerebralen Cortex proliferierenden Zellen differenzierten weit überwiegend glial. Keine der kortikalen BrdU+ Zellen zeigte zweifelsfreie Zeichen einer neuronalen Differenzierung. Damit scheint die adulte Nervenzellneubildung unter physiologischen Bedingungen eine regionale Spezialität des Hippokampus und anderer Strukturen zu sein. Weder körperliche Aktivität (RUN) noch eine reizreiche Umgebung (ENR) führten 1 Tag oder 4 Wochen nach BrdU zu einem signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe (CTR), was die Anzahl BrdU+ Zellen im gesamten Cortex zusamengefaßt betrifft. Dagegen konnten die vorbeschriebenen Effekte von RUN und ENR auf hippokampale BrdU-inkorporierende Zellen repliziert werden. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass die Verstärkung adulter Neurogenese durch RUN und ENR im Gyrus dentatus des Hippokampus eine hippokampus-spezifische Reaktion und nicht etwa Teil einer generalisierten zentralnervösen Reaktion ist. Jedoch konnte gezeigt werden, dass körperliche Aktivität und eine reizreiche Umgebung zur lokalen Beeinflussung kortikaler Zellneubildung in bestimmten Schichten und Regionen führten. So konnten bei RUN-Tieren signifikant mehr BrdU+ Zellen in Schicht I des cingulären, motorischen und visuellen Cortex als bei CTR-Tieren gefunden werden. ENR-Tiere hatten 4 Wochen nach BrdU signifikant mehr BrdU+ Zellen in Schicht II/III des visuellen Cortex als CTR-Tiere. Die Phänotypisierung BrdU+ Zellen in diesen kortikalen Bereichen ergab, dass RUN zu einer lokalen, deutlich ausgeprägten Verstärkung der Neubildung von Mikroglia führte, während ENR tendentiell lokal kortikale Astrozytogenese verstärkte (signifikant in Schicht I des motorischen Cortex 4 Wochen nach BrdU). Damit konnte erstmals berichtet werden, dass körperliche Aktivität zelltypspezifisch die Neubildung kortikaler Mikroglia stimuliert. Dieses Ergebnis ist zunächst überraschend, da mikrogliale Proliferation und Aktivierung klassischweise im Zusammenhang mit Schadenszuständen des ZNS gesehen werden. In der Tat ist dies einer der ersten Befunde, der eine mikrogliale Reaktion mit nicht-pathologischen, vollkommen physiologischen Bedingungen in Verbindung bringt. Dies könnte einen neuen Blickwinkel auf mikrogliale Funktionen eröffnen. / The effect of physical activity and enriched environment on cell genesis in the cerebral cortex of adult mice were investigated. It is well known that living under the conditions of an enriched environment and physical activity both enhance the generation of new neurons in the adult murine hippocampus. To label proliferating cells mice were injected with bromodesoxyuridine (BrdU). The number of BrdU incorporating cells in different regions and layers of the cerebral cortex was determined 1 day and 4 weeks after BrdU administration. To characterize cortical BrdU+ cells phenotypically immunohistochemistry and confocal microscopy were used. Adult-generated cortical cells were glial cells. None of all the examined cortical BrdU+ cells showed immunoreactivity for NeuN (expressed in mature neurons) unambiguously indicating that the generation of new neurons in the adult brain is a speciality of the hippocampus and other brain structures. Physical activity (RUN) and enriched environment (ENR) did not affect the number of BrdU+ cells in all cortical regions taken together compared to control animals (CTR), both 1 day and 4 weeks after BrdU. However, the known effects of RUN and ENR on hippocampal cell genesis were replicated suggesting that the enhancement of adult hippocampal neurogenesis by RUN and ENR is a hippocampus-specific reaction and not part of a generalized reaction of the adult cns. It was shown that physical activity and enriched environment had effects on cell genesis in distinct cortical layers and regions. RUN-animals had significantly more BrdU+ cells in layer I of the cingulate, motor and visual cortex than CTR. ENR-animals had significantly more BrdU+ cells in layer II/III of the visual cortex than CTR 4 weeks after BrdU. Phenotyping of BrdU+ cells in these cortical parts revealed that RUN led to a marked increase of the generation of microglia. ENR tended to enhance astrocytogenesis in several cortical parts (reaching significance in layer I of the motor cortex 4 weeks after BrdU). This is the first report that physical activity stimulates the generation of cortical microglia in a cell-type-specific and to some degree region-specific manner. This result is surprising because microglial proliferation and activation are generally thought to occur under conditions involving damage to the nervous system. In fact, this is one of the first reports linking a microglial reaction with an entirely physiological condition. This might shed a new light on microglial function.

Bei Patienten mit Keimzelltumoren werden Mobilisation und Separation peripherer Blut-stammzellen durch das Alter, die zytostatische Vorbehandlung und Art der Mobilisations-chemotherapie statistisch signifikant beeinfluát. Der beste pr diktive Parameter f r die gesammelten Stamm- und Vorl uferzellen ist die Anzahl der peripheren CD34+ Zellen, die am Tag der Leukapherese im Blutkreislauf zirkulieren. F r die Rekonstitution der Granulo- und Thrombozytopoese nach Hochdosischemotherapie ist die Dosis der trans-fundierten CD34+ Zellen von signifikantem Wert. Bei der Transplantation von mehr als 2,5 x 10 hoch 6 CD34+ Zellen/kg kann mit einer schnellen und sicheren Regeneration der H matopoese, einem niedrigeren Bedarf an Antibiotika, Erythrozyten- und Thrombozy-tenkonzentraten sowie einem k rzeren Krankenhausaufenthalt gerechnet werden. / In patients with germ cell cancer the mobilization and collection of peripheral blood progenitor cells are significantly influenced by patient's age, cytotoxic pretreatment and the mobilization chemotherapy used. The best predictive factor for harvested progenitor cells is the number of CD34+ cells circulating in the peripheral blood on the day of leukapheresis. The dose of transfused CD34+ cells has a significant impact on the reconstitution of granulocytes and platelets after high-dose chemotherapy. Transplantation of more than 2,5 x 10 to the power of 6 CD34+ cells/kg results in a rapid and safe regeneration of hematopoiesis, less antibiotics and transfusion requirements (red blood cell and platelet concentrates) and a shorter hospital stay.

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