Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein grampositives Bakterium, das in der Rhizosphäre das Pflanzenwachstum fördert (PGPR - Plant Growth Promotion) und pathogene Organismen hemmt. Abgesehen von dieser Fähigkeit produziert es eine Vielzahl von sekundären Metaboliten, die sowohl ribosomale als auch nicht-ribosomale Peptide umfassen. In dieser Arbeit erfolgte die Untersuchung der transkriptionellen Aktivierung und Regulation der Bacilysin- Biosynthese an den Promotoren der bac- und ywfH- Gene. Durch 5´-Deletionsanalysen wurde der Promotor von Bacilysin identifiziert. Die A (Sigmafaktor A) - abhängige Transkription startet über die konservierten Promotorelemente (-10 und -35) von den bac- und ywfH Genen. Die Untersuchungen der Promotoraktivitäten vom Wildtyp und den erzeugten Regulationsmutanten erfolgten über in vivo ß-Galaktosidase-(Reporter)-Assays. Die Ergebnisse der Reporter-Aktivitäten zeigten, dass Transkriptionsregulatoren die Expression der Bacilysin- Gene aktivieren. Mehrere globale Regulatoren wie DegU, ComA, Hpr und AbrB beeinflussen die Genexpression. In dieser Arbeit wurde mithilfe von DNaseI Footprinting-Analysen die DegU-Bindung an die bac- und ywfH- Promotoren bestätigt.Die negative Regulation der Bacilysin-Biosynthese wird durch den Regulator der transienten Phase Hpr bewerkstelligt. Eine direkte Hpr-Bindung an bac Promotor wurde mit DNaseI Footprint-Analysen gezeigt. Der Promotor des monocistronischen Gens ywfH wurde aber durch Hpr nicht beeinflusst. Die anderen Transkriptionsregulatoren, wie ComA und AbrB, regulieren die Genexpression von Bacilysin indirekt über DegQ und Hpr. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass der globale Regulator AbrB den Promotor vom hpr-Gen direkt kontrolliert. Zusammenfassend liefert diese Studie neue Informationen über die genetische Regulation der Bacilysin- Biosynthese in B. amyloliquefaciens FZB42. / Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is a Gram-positive, pathogen-suppressing and plant-growth promoting rhizobacterium. Apart from this ability, it produces a vast array of secondary metabolites, which includes both ribosomal and non-ribosomal peptides. In this work, the transcriptional activation and regulation of bacilysin biosynthesis were studied at the promoters of bac and ywfH genes. The promoter of bacilysin was identified using 5''-deletion analysis. Sigma factor A (σA) was found to start transcription via conserved promoter elements (-10 and -35) of bac and ywfH genes. lacZ reporter fusion studies were performed in wild type and regulatory mutants. The results show the involvement of transcriptional regulators to activate the expression of bacilysin genes. Several global regulators such as DegU, ComA, Hpr and AbrB were identified and found to influence gene expression. In particular, I confirmed DegU binding in bac and ywfH promoters using radioactive DNase I footprinting. Furthermore, Hpr, a transition state regulator was found negatively to control bacilysin biosynthesis. Hpr binding to bac promoter was demonstrated using radioactive DNase I footprinting. Remarkably, Hpr does not influence the promoter of the monocistronic gene, ywfH. The other transcriptional regulators, such as ComA and AbrB, were correlated indirectly to affect the gene expression of bacilysin via DegQ and Hpr, respectively. The gene regulation of hpr was studied in this work. It was demonstrated that AbrB, a global regulator, directly controls the promoter of the hpr gene. However, the consensus sequence for AbrB binding was not identified, since it covers the entire promoter region in the DNA-protein interaction study. To conclude, this study provides new information regarding the genetic regulation of bacilysin biosynthesis in B. amyloliquefaciens FZB42.

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 besitzt einen beeindruckenden Effekt zur Verbesserung des Pflanzenwachstums. Um die Mechanismen, vor allem auf molekularer Ebene, zu verstehen, wurde das komplette Genom von FZB42 in dieser Arbeit sequenziert. Abwesenheit von der weit verbreiteten Phagen-verwandten Genen im Genom von B. subtilis 168, der in enger Verwandtschaft zum FZB42 steht, ist ein besonderes Merkmal. Dagegen enthält das Genom von FZB42 viele DNA-Inseln, in denen unikale Gene in FZB42 als Cluster gefunden wurden. Viele Gene, die möglicherweise zur Pflanzenwachstumsförderung beitragen, wurden in dieser Arbeit identifiziert. B. amyloliquefaciens FZB42 ist natürlich kompetent. Das kompetente Stadium in FZB42 kommt früher als in B. subtilis 168, nämlich während der späten exponentiellen Wachstumsphase. Das FZB42-Genom enthält den kompletten Satz von Genen, die für die Entwicklung der genetischen Kompetenz nötig sind. Ausgenommen von Gene für Quorum-Sensing-System ist die Mehrzahl der Kompetenz-Gene von FZB42 sehr ähnlich zu denen in B. subtilis 168. Das FZB42 Genom birgt ein enormes Potential zur Produktion von sekundären Metaboliten. Genetische Manipulationen wurden durchgeführt, um die Funktionen der trans-AT Domänen und der Modifikationsdomänen in den PKS-Gen-Clustern zu erklären. Mit Ausnahme von fünf Gen-Clustern in B. subtilis 168 (Surfactin, Fengycin, Bacillibactin, Bacillaene und Bacilysin), sind Bacillomycin D, Difficidin, Macrolactin und ein hypothetisches Tripeptid einzigartig im Genom der FZB42. FZB42 kann kein bekanntes ribosomal synthetisiertes Bacteriocin produzieren kann. Gleichzeitig beinhaltet sein Genom ein Gen-Cluster, das wahrscheinlich für die Produktion eines neuartigen Bacteriocins verantwortlich ist. Die eindrucksvolle genetische Kapazität zur Herstellung von antagonistischen sekundären Metaboliten ermöglicht es FZB42, nicht nur erfolgreich neben konkurrierenden Organismen innerhalb seiner natürlichen Umgebung zu überleben, sondern auch Pflanzen gegen pathogene Bakterien und Pilze zu schützen. / Bacillus amyloliquefaciens FZB42 has an impressive effect to improve plant growth. In order to understand the mechanisms, especially at the molecular biological level, the whole genome of FZB42 was sequenced in this work. The absence of extended phage insertions which are typical for the closely related B. subtilis 168 genome is a particular feature. On the other hand, several DNA islands where unique genes in FZB42 were found clustered. Many candidate genes that may contribute to the plant growth promotion were identified in this works. B. amyloliquefaciens FZB42 is naturally competent. FZB42 exhibited its maximal competence earlier than B. subtilis, during late exponential growth. Not surprisingly, the FZB42 genome harbors the complete set of genes necessary for development of genetic competence. The majority of competence genes are highly homologous to their counterparts in B. subtilis 168, excluded from genes for the quorum-sensing system. The FZB42 genome harbors enormous potential for producing secondary metabolites. Genetic manipulation was carried out to investigate the trans-AT domains and some modification domains in the pks gene clusters. With the exception of five gene clusters in B. subtilis 168 (Surfactin, Fengycin, Bacillibactin, Bacillaene and Bacilysin), Bacillomycin D, Difficidin, Macrolactin and a hypothetical tripeptide are unique in the genome of the FZB42. A remarkable feature of the FZB42 genome is that it does not produce any known ribosomally synthesized bacteriocin, whereas a gene cluster probably responsible for production of a new bacteriocin was identified in this work. The impressive genetic capacity to produce antagonistic acting secondary metabolites not only enables FZB42 to cope successfully with competing organisms within its natural environment, but also to protect plants from pathogenic bacteria and fungi.

Die Verknüpfung einer exergonischen mit einer endergonischen Reaktion zur Ermöglichung der letzteren ist eine in biologischen Systemen weit verbreitete Strategie. Energetisch benachteiligte Elektronenübertragungsreaktionen im Rahmen der reduktiven Aktivierung von Nitrogenasen, Radikal-abhängigen β,α-Dehydratasen, der zu diesen verwandten Benzoyl-CoA-Reduktasen und diversen Cobalamin-abhängigen Methyltransferasen sind gekoppelt an die Hydrolyse von ATP. Der Methylgruppentransfer des reduktiven Acetyl-CoA-Weges von Carboxydothermus hydrogenoformans erfordert den Co(I)-Zustand des Corrinoid/Eisen-Schwefel Proteins (CoFeSP). Um diese superreduzierte Form nach einer oxidativen Inaktivierung zu regenerieren ist ein „Reparaturmechanismus“ erforderlich. Ein offenes Leseraster (orf7), welches möglicherweise für eine reduktive Aktivase von Corrinoid Enzymen (RACE) kodiert, wurde in dem Gencluster der am reduktiven Acetyl-CoA-Weg beteiligten Proteine entdeckt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses potenzielle RACE Protein biochemisch und strukturell charakterisiert und die ATP-abhängige reduktive Aktivierung von CoFeSP untersucht. Auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse wurde ein Mechanismus für die ATP-abhängige Aktivierung entworfen. Dieser gibt Einblicke wie die durch ATP-Hydrolyse bereitgestellte Energie einen energetisch ungünstigen Elektronentransfer ermöglichen kann. Hierzu kombiniert RACo das Ausgleichen von Bindungsenergien mit Modulationen am Elektronenakzeptor. Eine vergleichbare Strategie wurde bisher in keinem anderen ATP-abhängigen Elektronenübertragungssystem wie dem von Nitrogenasen, Radikal-abhängigen β,α-Dehydratasen oder Benzoyl-CoA-Reduktasen beobachtet und könnte ein für RACE Proteine allgemein gültige Eigenschaft darstellen. / The principle of coupling an exergonic to an endergonic reaction to enable the latter is a widespread strategy in biological systems. Unfavoured electron transfer reactions in the reductive activation of nitrogenases, radical-dependent β,α-dehydratases and the related benzoyl- CoA reductases, as well as different cobalamin-dependent methyltransferases are coupled to the hydrolysis of ATP. The reductive acetyl-CoA pathway of Carboxydothermus hydrogenoformans relies on the superreduced Co(I)-state of the corrinoid/iron-sulfur protein (CoFeSP) that requires a “repair mechanism” in case of incidental oxidation. An open reading frame (orf7) coding for a putative reductive activase of corrinoid enzymes (RACE) was discovered in the gene cluster of proteins involved in the reductive acetyl-CoA pathway. In this work, this putative RACE protein was biochemically and structurally characterised and the ATP-dependent reductive activation of CoFeSP was investigated. Based on the results of this study, a mechanism for the ATP-dependent reactivation of CoFeSP was deduced providing insights into how the energy provided by ATP could trigger this unfavourable electron transfer. The reductive activator of CoFeSP combines balance of binding energies and modulations of the electron acceptor to promote the uphill electron transfer to CoFeSP. A comparable strategy has not been observed in other ATP-dependent electron transfer systems like nitrogenases, radical-dependent β,α-dehydratases and benzoyl- CoA reductases and could be a universal feature of RACE proteins.

Das Proteasomsystem ist die Hauptquelle von Peptiden für die MHC Klasse I Antigen-Präsentation. In Vertebraten kann dieses durch die Expression verschiedener Subtypen des 20S Proteasoms moduliert werden. Die häufigsten Subtypen sind konstitutive Proteasomen (c20S) mit den katalytischen Untereinheiten beta1, beta2 und beta5 und Immunoproteasomen (i20S) mit den Immunountereinheiten beta1i, beta2i und beta5i. Die Expression von i20S optimiert in der Regel die MHC Klasse I Antigen-Präsentation, indem die Bildung von Peptiden mit hoher Affinität zu MHC I Molekülen verstärkt wird. Die Bildung von i20S wird momentan durch ein Modell der kooperativen Assemblierung erklärt, das auf der präferentiellen Interaktion zwischen den Immunountereinheiten beruht. In dieser Arbeit wurde die Assemblierung von 20S Proteasomen in beta5i defizienten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes analysiert. In diesem Modell konnte keine präferentielle Interaktion zwischen den Untereinheiten festgestellt werden. Stattdessen zeigen die Ergebnisse, daß die Integration von konstitutiven oder Immunountereinheiten durch direkte Kompetition reguliert wird. Des Weiteren wurde während der Infektion eine beta5i-abhängige Zunahme der zellulären Proteasommenge festgestellt und somit ein neuer Mechanismus zur Regulation des zellulären Proteasomgehaltes entdeckt. Funktionell führt die beta5i-Defizienz zu einer verringerten MHC I Expression auf antigenpräsentierenden Zellen und zu einer verminderten Prozessierung des bakteriellen Antigens LLO296-304. Bei der Analyse der LLO296-304 spezifischen CD8 T Zell Antwort konnte jedoch kein Unterschied zwischen Wildtyp- und beta5i defizienten Mäusen festgestellt werden .Die Kontrolle der Infektion in den beta5i defizienten Mäusen ist jedoch in der Leber verzögert. Dies deutet darauf hin, dass die Erkennung und Elimination infizierter Zellen durch cytotoxische CD8 T Zellen auf Grund der geringeren MHC Klasse I Präsentation bakterieller Antigene behindert wird. / The proteasome-system is the main source of peptides for MHC class I antigen presentation. In vertebrates this system can be modulated by the expression of different subtypes of the 20S proteasome. The most common subtypes are constitutive proteasomes (c20S) with the catalytic subunits beta1, beta2 and beta5 and immunoproteasomes (i20S) with the immunosubunits beta1i, beta2i and beta5i. Expression of i20S generally optimizes MHC class I antigen presentation by increasing the generation of peptides with high affinity to MHC class I molecules. Currently, the formation of i20S is explained by a model of cooperative proteasome assembly, which is based on preferential interactions among the immunosubunits. Here, the assembly of 20S proteasomes was analysed in beta5i deficient mice during an ongoing infection with Listeria monocytogenes. In this model, no preferential interactions among constitutive subunits or immunosubunits could be determined. Instead, the results show that the integration of constitutive subunits or immunosubunits is regulated by direct competition. Further, a beta5i-dependent increase in cellular proteasome quantity was observed following infection. This reveals a novel mechanism for the regulation of cellular proteasome quantity, which is based on the differential expression of beta5i. Functionally, the deficiency in beta5i results in a reduced MHC class I cell surface expression on professional antigen presenting cells and a drastically diminished processing of the bacterial antigen LLO296-304. However, the analyses of LLO296-304 specific CD8 T cells did not reveal differences in the frequencies of these T cells between wild-type and beta5i deficient mice. Still, the control of infection in the liver of beta5i deficient mice was delayed. This phenotype suggests that the recognition and elimination of infected target cells by cytotoxic CD8 T cells is constrained due to the lowered MHC class I presentation of bacterial antigens.