Adaptive Immunantworten gegen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) sind von entscheidender Bedeutung für die effektive Eindämmung des Erregers sowie den Schutz vor einer erneuten, sekundären Tuberkulose (TB). Obwohl Schlüsselfaktoren wie die Th1 Zytokine IFN-gamma und TNF-alpha bekannt sind, blieben Bemühungen zur Identifizierung eindeutiger immunologischer Parameter, welche ausschlaggebend für den Krankheitsverlauf sind, bislang erfolglos. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Immunprozesse sowie die Identifikation projektiver Biomarker für TB sind zentrale Ziele dieser Arbeit. Zur Bearbeitung dieser Fragestellungen wurden adaptive Immunantworten gegen M. tuberculosis in gesunden Probanden mit LTBI und Patienten mit aktiver TB analysiert. Hierfür wurde die Erkennung unterschiedlicher Proteine des Erregers durch die Messung IFN-gamma exprimierender CD4+ CD45RO+ Gedächtnis T Zellen untersucht. Eine Besonderheit war die Einbeziehung sogenannter Latenz-assoziierter Proteine, welche in Zusammenhang mit Dormanz und Reaktivierung des Bakteriums stehen. 7 Tage in vitro Inkubation in Verbindung mit einer zweimaligen Restimulation belegten eine spezifische Erkennung durch CD4+ CD45RO+ T Zellen für die Mehrheit der getesteten Proteine bei Spendern mit LTBI. Der darauf folgende Vergleich zwischen Patienten mit aktiver TB und Personen mit LTBI zeigte signifikant höhere T Zell Antworten für 7 der 35 M. tuberculosis Proteine während LTBI. Bemerkenswerterweise konnten spezifische T Zellen für eines der Protein, nämlich Rv3407, ausschließlich während LTBI gemessen werden und nicht bei Patienten mit aktiver TB. Diskriminanz Analysen zeigten, dass eine Unterscheidung zwischen LTBI und TB Patienten basierend auf T Zell Antwort gegen ausgewählte Latenz-assoziierte Antigene mit einer Genauigkeit von 82% möglich ist. Erneut erwies sich Rv3407 als der mit Abstand bedeutendste Faktor innerhalb der ausgewählten M. tuberculosis Proteine. / Adaptive immune responses to Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) are crucial for an efficient containment of the pathogen and protection against secondary tuberculosis (TB). Although key mediators like the Th1 cytokines IFN-gamma and TNF-alpha released by M. tuberculosis-specific T cells are known, the immunological correlates determining the outcome of infection remain elusive. A better understanding of the underlying immune processes and the identification of protective biomarkers for TB are central aims of this thesis. To address these topics adaptive immune responses to M. tuberculosis were analyzed in healthy LTBI and patients with active pulmonary TB. The recognition of M. tuberculosis derived antigens was studied by measuring the expression of IFN-gamma in CD4+ CD45RO+ memory T cells. A special hallmark was the inclusion of latency proteins associated with dormancy, reactivation and resuscitation of the pathogen. Seven days in vitro incubation of PBMC and two rounds of restimulation followed by FACS analysis revealed T cell mediated recognition of the majority of tested latency-associated proteins in donors with LTBI. Comparison between active TB and LTBI documented significantly higher T-cell responses against 7 of 35 tested M. tuberculosis latency-associated antigens in LTBI. Notably, T cells specific for one M. tuberculosis antigen, namely Rv3407, were exclusively detected in the subgroup of LTBI. Discrimination analysis revealed that the T-cell response against selected antigens with our novel assay is capable of distinguishing TB patients and LTBI with 82% accuracy using cross-validation. Again Rv3407 was by far the most influential component present in this cluster. Peptide pool stimulation in a similar fashion identified single distinct candidate epitopes within Rv3407 in four LTBI.

Etwa ein Drittel der Weltbevölkerung ist mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose (TB), infiziert. Daher ist es unbedingt notwendig vorhandenen Behandlungsstrategien weiter zu verbessern. Diese Study beschäftigt sich mit dem Mtb Protein Ag85C, einer Mycolyltransferase, als ein neues Ziel für die medikamentöse Behandlung der TB. Ag85C ist eines von drei verwandten Proteinen, Ag85A, B und C, welche zusammen an der Biogenese der Zellwand von Mtb beteiligt sind. Eine Gruppe von chemischen Molekülen mit den Namen Ag85C-1 bis -4 wurde als Inhibitoren von Ag85C getestet. Alle Verbindungen waren in der Lage das Wachstum von Mtb in Flüssigkulturen zu inhibieren, aber nur Ag85C-3 hatte ebenfalls einen Effekt auf intrazelluläre Bakterien, welches in einem Makrophagen-Infektions-System getestet wurde. Hervorzuheben ist, dass Ag85C-3 darüber hinaus auch das in vitro Überleben eines MDR Stammes inhibierte. Dies macht dieses Molekül zu einem interessanten Kandidaten für neue anti-mycobakterielle Therapieansätze. Desweiteren wurden detaillierte, funktionelle Charakterisierungen der Effekte von Ag85C-3 auf Mtb durchgeführt. Die Verbindung modifiziert die Lipide der mykolischen Säuren in der Zellwand durch die Blockierung der Ag85 Funktionen. Dieser Effekt führt dann zu einer Veränderung in der Durchlässigkeit der Außenhülle von Mtb. Mit Hilfe der microarray Analyse wurden die Regulierungen der Signalwege durch Ag85C-3 umfassend untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass lebensnotwendige Siderophore durch das Molekül modifiziert werden, was auf mehrere Wirkungsmechanismen schließen lässt. Diese Erkenntnisse machen Ag85C, als Ziel, und Ag85C-3, als Inhibitor, zu vielversprechende Kandidaten für zukünftige Medikamentenforschung auf dem Gebiet der TB-Therapien. Diese Studie hebt zudem die zielbasierte Identifizierung von chemischen Inhibitoren als wichtigen und wertvollen Ansatz für die Medikamentenentwicklung hervor. / Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB) infects about one-third of the world’s population. Therefore there is an urgent need to improve existing intervention strategies. This study evaluated the Mtb Ag85C protein, a mycolyl transferase, as a novel target for drug mediated intervention. Ag85C belongs to a family of three cognate proteins, Ag85A, B and C. They are involved in the final steps of Mtb cell envelope biogenesis. A panel of chemical molecules, Ag85C-1-4, which bind to Ag85C were utilized as inhibitors of Ag85C. All compounds inhibited growth of Mtb in vitro in liquid medium cultures but only Ag85C-3 had an effect on intracellular bacteria in macrophage infection system. Importantly, Ag85C-3 can inhibit in vitro survival of a MDR strain of Mtb making it a relevant molecule in the search for novel classes of anti-mycobacterial compounds. Furthermore a detailed functional characterization of Ag85C-3 effect on Mtb was performed. It modified the cell wall mycolic acid containing lipid amounts by blocking Ag85 function that led to changes in permeability of Mtb envelope. A comprehensive analysis of Mtb signalling pathways regulated by Ag85C-3 was investigated through microarray analysis. It showed modification of vital siderophore biosynthesis indicating multiple mechanisms of action. Thus the target, Ag85C and the inhibitor, Ag85C-3 are promising candidates for future TB drug research aimed at combating broad spectrum resistance development. This study also reinforces target based identification of chemical inhibitors as a valid and valuable approach in drug development.

Tuberkulose ist auch heute noch eine der bedrohlichsten Infektionskrankheiten weltweit, verantwortlich für über 1.5 Millionen Todesfälle jährlich. Diese „Erfolgsgeschichte“ ihres Erregers Mycobacterium tuberculosis ist dabei wesentlich durch einen extrem flexiblen Stoffwechsel bestimmt, der dem Bakterium das Wachstum unter den restriktiven Bedingungen der menschlichen Wirtszelle erlaubt. Diese Arbeit erkundet die Flexibilität des zentralen Kohlenstoffmetabolismus in Mykobakterien mit Hilfe mathematischer Modellierungsansätze, ergänzt durch die Integration von qualitativ hochwertigen experimentellen Daten. Ausgehend von einem Überblick über die metabolische Landschaft des zentralen Kohlenstoffmetabolismus, erhöht sich Schritt für Schritt die Detailtiefe bis hin zur genauen Analyse spezieller infektionsrelevanter metabolischer Wege. Die Verknüpfung des zentralen Kohlenstoffmetabolismus zu umgebenden Stoffwechsel- und Biosynthesewegen wird systematisch offen gelegt, als Voraussetzung für eine thermodynamische Charakterisierung des Systems, welche die Glykolyse als limitierenden Stoffwechselweg unter verschiedenen Wachstumsbedingungen charakterisiert. Basierend auf Protein- und Metabolitdaten im Fleißgleichgewicht, erlaubt eine neu vorgestellte Methode die Vorhersage regulatorischer Punkte für den metabolischen Übergang zwischen verschiedenen Kohlenstoffquellen. Abschließend wird mit Hilfe thermodynamisch-kinetischer Modellierung das Zusammenspiel zweier Stoffwechselwege mechanistisch erklärt, welche den robusten Abbau einer intrazellulären Kohlenstoffquelle ermöglichen. Durch die Entwicklung neuer Modellierungstechniken in Kombination mit hochauflösenden experimentellen Daten, trägt diese Arbeit zum besseren Verständnis der kontextabhängigen Flexibilität des mycobakteriellen Stoffwechsels bei, einem vielversprechenden Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose. / Tuberculosis remains one of the major global health threats responsible for over 1.5 million deaths each year. This ’success story’ of the causative agent Mycobacterium tuberculosis is thereby closely linked to a flexible metabolism, allowing growth despite the restrictive conditions within the human host. In this thesis, the flexibility of the mycobacterial central carbon metabolism is explored by modeling approaches integrating high-quality experimental data. The analyses zoom in from a network based view to the detailed functionalities of individual, virulence relevant pathways. The interconnection of the central carbon metabolism to the remaining metabolic network is charted as a prerequisite to characterize its thermodynamic landscape, debunking glycolysis as bottleneck in different nutritional conditions. Based on steady state metabolomics and proteomics data, regulatory sites for the metabolic transition between different carbon sources are predicted by a novel method. Finally, the flexible interplay between two seemingly redundant pathways for the catabolism of an in vivo-like carbon source is explained mechanistically by means of thermodynamic-kinetic modeling. By employing novel modeling methods in combination with high-resolution experimental data, this work adds to the mechanistic understanding of the context dependent flexibility of mycobacterial metabolism, an important target for the development of novel drugs in the battle against tuberculosis.