Shigella flexneri verursacht im Verlauf der Infektion eine massive Enzündungsreaktion sowie Schädigung des humanen Darmepithels. Neutrophile sind die ersten Zellen des angeborenen Immunsystems, welche den Infektionsherd infiltrieren. Diese Zellen greifen Mikroorganismen mittels Phagozytose, Neutrophiler extrazellulärer Fallen (Neutrophil Extracellular Traps, NETs) oder Degranulierung an. In dieser Arbeit haben wir untersucht, wie die Degranulierung von Neutrophilen die Virulenz von Shigellen beeinflußt und konnten zeigen, dass die Exposition von Shigellen mit Proteinen aus den Granula von Neutrophilen die Invasion in Epithelzellen stark erhöht. Während dieser Exposition binden kationische Proteine der Granula an die Oberfläche von Shigella und bewirken eine verstärkte Adhesion, welche dann schließlich zu “Hyperinvasion” führt. Dieser Effekt wird durch Änderungen der Oberflächenladung bewirkt, da eine Lipopolysaccharid (LPS) Mutante mit negativer Oberflächenladung eine zusätzliche erhöhte Hyperinvasion im Vergleich zu Wildtyp Shigellen zeigt. Zusätzlich zur Hyperinvasion bewirkt die Infektion von Epithelzellen mit Shigellen, die mit Granula Proteinen in Kontakt gekommenen sind, eine Verminderung der IL-8 Sekretion. Dieses Zytokin bewirkt eine starke Rekrutierung von Neutrophilen. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass Shigella in der Lage ist, antimikrobielle Proteine des Wirtes zur Erhöhung seiner Virulenz durch Hyperinvasion zu verwenden sowie eine weitere Rekrutierung von Neutrophilen durch Inhibition der IL-8 Sekretion zu verhindern. Somit unterwandert Shigella das angeborenen Immunsystem und nutzt dessen Angriff zu seinem Vorteil. / Shigella flexneri is an enteric pathogen that causes massive inflammation and destruction of the human intestinal epithelium. Neutrophils are the first cells of the innate immune system recruited to the site of infection. These cells can attack microbes by phagocytosis, Neutrophil Extracellular Trap (NET) formation and degranulation. Here, we investigated how neutrophil degranulation affects virulence and show that exposure of Shigella to granular proteins enhances infection of epithelial cells. During this process, cationic granular proteins bind to the Shigella surface causing increased adhesion which ultimately leads to hyperinvasion. This effect is mediated by changes in the surface charge, since a lipopolysaccharide (LPS) mutant with a negative surface shows enhanced hyperinvasion compared to wild-type Shigella. In addition, infection with Shigella exposed to granular proteins leads to the inhibition of secretion of the neutrophil attracting cytokine IL-8. We propose that Shigella uses host defense molecules to enhance its virulence by increased infection of its host cells and reduced recruitment of neutrophils after hyperinvasion through inhibition of IL-8 secretion. With this Shigella subverts the innate immune system and uses its attack for its own benefit.

In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise der sauren Histidin-Phosphatasen (HAPs) an zwei Vertretern, der PhyK (Phytase) aus Klebsiella sp. ASR1 und der AgpE (Glukose-1-Phosphatase) aus Enterobacter cloacae, untersucht. Neben den biochemischen Charakterisierungen der beiden Enzyme und deren Substitutionsmutanten konnten die Proteinstrukturen aufgeklärt werden. Die Kokristallisationen mit Phytat bzw. myo-Inositolhexasulfat ermöglichten die Modellierungen der Substratbindungen in den aktiven Zentren. Es konnten für die Glukose-1-Phosphatase AgpE zum ersten Mal zwei Konformationszustände, eine offene und eine geschlossene Form, ähnlich der E. coli Phytase (AppA) gezeigt werden. Ungeachtet deutlicher funktioneller Unterschiede wiesen die AgpE und AppA starke strukturelle Ähnlichkeiten auf. Deshalb wurden gezielte Aminosäuren-Substitutionen im aktiven Zentrum der AgpE durchgeführt, um deren Eigenschaften zu modifizieren. Bereits der Austausch von nur zwei Aminosäuren führte zu einem deutlich veränderten Substratspektrum der AgpE und bewirkte einen weiteren, hier zum ersten Mal gezeigten, Phytatabbau durch eine Glukose-1-Phosphatase. Die PhyK aus Klebsiella sp. ASR1 wurde ebenfalls verschiedenen Substitutionsmutagenesen unterzogen. Hierbei wurden Phytasevarianten erzeugt, die bis zu 20 % höhere spezifische Aktivitäten und damit einen effizienteren Phytatabbau aufwiesen sowie eine deutlich verringerte Substrathemmung zeigten. Aus den “High Performance Ion Chromatography” Analysen (HPIC) des Phytatabbaus der nativen Klebsiella-Phytase und der Mutanten konnten Rückschlüsse auf die Bedeutung einzelner Aminosäuren für die Substratbindung und daher auch auf den Hydrolysemechanismus gezogen werden. Ausserdem konnte auch gezeigt werden, dass der kombinierte Einsatz der effizienteren Phytasemutante mit der nativen AppA aus E. coli eine deutlich schnellere, vollständige Phytathydrolyse bewirkte und somit einen interessanten Aspekt für die Anwendung in der Tierernährung darstellt. / This work presents the analysis of the enzymatic function of histidine acid phosphatases (HAPs) exemplary studied on two enzymes: the phytase of Klebsiella sp. ASR1 (PhyK) and the glucose-1-phosphatse (AgpE) of Enterobacter cloacae. The AgpE belongs to the HAPs and shows lower catalytic activity for phytate. Besides biochemical analysis the structure of these two enzymes were solved. Binding of phytate and the inhibitor myo-inositolhexa sulfate at the active site of these enzymes were fitted according to the date obtained by co-crystallisations experiments. For the first time two district conformational states could be observed for a glucose-1-phosphatase (AgpE). The open and closed conformations as well as the structures were very similar to the well characterized AppA phytase of E. coli however bothe enzymes showed differences in catalytic efficiency. For this reason substitutions of amino acid within the active site were performed to change substrate spectra and specific activities. The substitutions of only two amino acids strongly changed the substrate spectrum and affected the further phytate hydrolysis by the AgpE. Extensive amino acid substitutions were performed for the phytase of Klebsiella sp. ASR1 as well. In this case phytase mutants with 20% higher specific phytase activities were generated. Besides that, the observed strong substrate-induced inhibitory effect on the phytase activity was lower in these mutants. The biochemical characterizations and high performance ion chromatography analysis (HIPC) of these phytase mutants allowed drawing conclusions of the importance of particular amino acid residues for substrate binding and substrate hydrolysis. Furthermore the combination of Klebsiella phytase mutant and AppA resulted in a more efficient phytate hydrolysis. This aspect offers an interesting possibility for usage of the Klebsiella phytase in livestock breading and animal feeding.