No description available.

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains. / Clinical and in vitro studies suggest that subchondral bone sclerosis due to abnormal osteoblasts (Ob) is involved in the progression and/or onset of osteoarthritis (OA). Human Ob isolated from sclerotic subchondral OA bone tissue show an altered phenotype, a decreased canonical Wnt/ß-catenin signaling pathway (cWnt), and a reduced mineralization in vitro. Besides the cWnt pathway, at least two non-canonical signaling pathways, the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathway have been described. These pathways are activated when a non-canonical Wnt ligand like Wnt-5a binds to a Wnt receptor coupled with non-canonical co-receptors. This activates, respectively for Wnt/PKC-Ca2+ and Wnt/PCP, the phosphorylation of PKC (pPKC) and the phosphorylation of JNK (pJNK) and their effect on downstream targets. However, there are no reports of either pathway in OA Ob. Here, we studied if alterations of the non-canonical pathways could be observed in OA Ob. We prepared primary human subchondral Ob using the tibial plateaus of OA patients undergoing total knee arthroplasty, or from tibial plateaus of normal individuals at autopsy. The expression of genes involved in Wnt/PKC and Wnt/PCP was evaluated by RT-qPCR and their protein production by Western blot analysis, in addition to p-PKC and p-PCP and NFAT and AP-1 activity with luciferase. Alkaline phosphatase activity and osteocalcin levels were evaluated respectively by substrate hydrolysis and ELISA respectively, and mineralization levels were evaluated with Alizarin red staining. OA Ob showed an increased alkaline phosphatase activity and osteocalcin release. The expression of Wnt5a was increased in OA Ob compared to normal. The expression of LGR5 was significantly increased in these cells. Moreover, the expression and production of LGR5 is directly modulated via the stimulation or inhibition of Wnt5a. However, Wnt5a did not stimulate the expression of LGR4. Wnt5a increased the phosphorylation of PKC and JNK as well as NFAT and AP-1 activity. Mineralization levels as well as alkaline phosphatase activity and osteocalcin secretion levels were also linked with changes in Wnt-5a levels. These data indicate that Wnt5a, which is increased in OA Ob, can directly stimulate the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathways and this can affect the phenotype and mineralization observed in human OA Ob.

Abstract The embryonic urogenital system generates the metanephric kidneys, the gonads and the adrenal glands, and its development is based on sequential and reciprocal cell and tissue interactions. The mechanisms which regulate urogenital ontogeny are still poorly understood. In this thesis, the roles of Wnt-4 and ErbB4 functions in gonad and kidney development were analysed by using in vivo functional genomic technologies. Wnt-4 is crucial in female development since its absence leads to a partial female to male sex reversal. We found that Wnt-4 mediated the interactions between the somatic and the germ cells and played a role in meiosis which is regulated in part by the secreted signal retinoic acid (RA). Expression of certain meiosis-controlling genes (Stra8, Spo11) was inhibited in the Wnt-4 deficient germ cells, while certain pluripotency genes (Oct4, Fgf9, Sox2 and Dnmt3l) were activated similarly as in the wild-type male gonad. In addition to this, we noted that a gene encoding for a Cyp26b1 enzyme, which degrades RA in the embryonic testis, was ectopically expressed in the Wnt-4 deficient ovary. Microarray analysis was used to identify candidate Wnt-4 target genes by using the Wnt-4 knock-out mouse. Of these genes, Runx-1 may represent a novel signalling target to mediate Wnt-4 activity in the control female development The role of receptor-tyrosine kinase ErbB4 in kidney development was studied by using both in vivo gain and loss of function approaches. In the gain-of-function situation, we found that certain markers for the epithelial tubules and collecting ducts lost their polarized expression pattern. At the same time, the orientation of the cells in the kidney tubules was deregulated and an increase in cell proliferation was noticed. We suggest that the observed defects gave rise to an increase in the tubule diameter and to cyst formation in the kidney cortex. In the loss-of-function mouse, the lack of ErbB4 expression led to a similar phenotype as with the gain of function, and the renal functions of the mutant adult kidneys were compromised. In conclusion, the results point to specific roles for Wnt-4 and ErbB4 in the control of urogenital development. Wnt-4 appears to be crucial in sustaining proper female somatic cell and germ cell differentiation, and maintenance of gonad development during and after the sex determination event, while ErbB4 activity is critical for the regulation of tubular growth in embryonic kidney development. / Tiivistelmä Sekä nisäkkään jälkimunuainen, lisämunuainen että sukurauhanen kehittyvät alkion urogenitaalialueen järjestelmästä ja solu- ja kudosvuorovaikutukset ohjaavat elinkehitysprosessia. Tapahtuman molekyylitason mekanismit ovat kuitenkin huonosti tunnettuja. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin Wnt-4 signaalin tehtäviä sukurauhasen ja ErbB4- proteiinin munuaisen kehityksessä. Wnt-4 signaali on keskeinen naisen sukupuolisuuden kehityksessä, koska signaalin puutos aiheuttaa alkion sukupuolen osittaisen kääntymisen naaraasta koiraaksi. Tarkastelimme aluksi sitä, välittääkö Wnt-4 itusolujen ja sukurauhasen somaattisten solujen vuorovaikutuksia ohjaten itusolujen meioosia, jota mm. A-vitamiini säätelee. Havaitsimme, että Wnt-4 geeni puuttuessa tietyt meioosia säätelevät geenit kuten Stra8 ja Spo11 olivat heikentyneet, kun taas solujen monikykyisyyteen liittyvät geenit kuten Oct4, Fgf9, Sox2 ja Dnmt3l aktivoituivat vastaavalla tavalla kuin havaitaan normaalisti koirasalkion kivesaiheessa. Tämän lisäksi havaitsimme, että Cyp26b1-geeni, joka johtaa A-vitamiinin hajoamiseen alkiossa ja estää normaalisti meioosin koirasalkion kivesaiheessa oli aktivoitunut munuaisrauhasaiheessa, jolta puuttuu Wnt-4 aktiivisuus. Tuloksemme osoittavat, että Wnt-4 säätelee osaltaan naarasalkion itusolujen meioosia. Tarkastelimme myös mikrosirututkimusten avulla niitä geenejä, joita Wnt-4 säätelee sukuelinaiheessa. Identifioimme useissa Wnt ja β-catenin signaalireittiin liittyvissä geeneissa muutoksia. Muuntuneet geenit voivat olla Wnt-4 signaalireitin kohdegeenejä. Näistä Runx-1 saattaa olla keskeinen Wnt signaalitien kohdegeeni, joka säätelee merkittävällä tavalla naaraan munarauhasen kehitystä. Väitöskirjan toisessa osassa tarkastelimme ErbB4-reseptorityrosiinikinaasin tehtäviä munuaisen kehityksen säätelyssä. ErbB4-geenin tehtäviä tutkittiin käyttäen hyväksi siirtogeenisiä malliorganismeja, joissa ErbB4-geenin määrä oli joko koholla tai ajastetusti inaktivoitu. ErbB4- geenin kokeellinen yliaktiivisuus muutti spesifisti tekijöitä, jotka säätelevät osaltaan jälkimunuaisen epiteeliputkien solujen orientaatiota ja solun jakautumista. Solujen orientaatiomuutoksen yhteydessä myös solujen jakautuminen häiriintyi. Oletuksemme on, että nämä epiteelikudoksessa tapahtuneet muutokset ovat syy, miksi kohotettu ErbB4-aktiviteetti muuttaa epiteeliputkien paksuutta ja pituutta erityisesti munuaisen pintakerroksissa. Havaitsimme myös, että ErbB4-geenin ajastettu poistaminen munuaisen epiteelikudoksessa johti hyvin samankaltaisiin, mutta vastakkaisiin muutoksiin kuin ErbB4-aktiviteetin kohottaminen. Muutokset johtivat myös muutoksiin munuaisen toiminnassa. Yhteenvetona toteamme, että näillä Wnt-4 ja ErbB4 solusignallointiin liittyvillä molekyyleillä on keskeinen tehtävä alkion munarauhasen ja munuaisen aiheen kehityksen säätelyssä. Wnt-4 ohjaa sekä itusolujen että somaattisten solujen erilaistumista ja samalla sukupuolen määräytymistä ja jatkokehitystä, kun taas ErbB4-signallointireseptorin tehtävä on avainasemassa munuaisen epiteeliputken kasvun säätelyssä.