Abstract In mice, gene targeting has become a useful tool for resolving the functions of proteins and for creating new animal models. Cre/loxP technology has been used broadly for generation of genetically modified mice. The Cre recombinase recognizes a specific DNA sequence, called loxP, and removes any DNA fragment between two loxP-sites. The activity of the Cre recombinase can be controlled spatially and temporally with cell- or tissue-specific promoters and synthetic inducing agents, such as tamoxifen or tetracycline. In this thesis, we employed tamoxifen-induced Cre recombination in vitro. Cre-ERTM mice were crossed to ROSA26LacZ reporters and Cre-recombination induced by 4OH-TM was monitored by LacZ staining. 0.5 μM 4OH-TM treatment was competent for tamoxifen-induced Cre-mediated activation of LacZ both in kidney cultures and in experimentally induced kidney mesenchymes. Wnt4 is a secreted signaling molecule, which is necessary for the development of several organs including kidney, ovary, adrenal gland, mammary and pituitary glands. Wnt4 is crucial for kidney development and conventional Wnt4-/- mice die soon after birth, likely due to renal failure. In this thesis, two different Wnt4 alleles, Wnt4EGFPCre and floxed Wnt4, were generated and analyzed to learn more about the Wnt4 functions and to apply these mouse lines to renal functional genomics. In the Wnt4EGFPCre, the EGFPCre fusion cDNA was targeted into exon I of the Wnt4 locus. EGFP-derived fluorescence was observed in the pretubular aggregates from E12.5 embryonic kidney onwards. Further characterization by crossing with the floxed ROSA26LacZ and yellow fluorescent protein (YFP) reporter lines demonstrated that in addition to the kidney, reporter expression was observed in the gonad, spinal cord, lung and the adrenal gland. The expression pattern of the Cre activity recapitulates well the known pattern of the Wnt4 gene. Time-lapse analysis in organ culture settings showed that the Wnt4 expressing cells contributed to the nephrons, some cells near the stalk of the developing ureter, as well as a number of positive supposed medullary stromal cells. In the conditional Wnt4 knock-out, loxP sites were placed to flank exons 3 to 5. The Wnt4 gene was specifically inactivated with CAGCre and Wnt4EGFPCre lines. In both of these crosses deletion of Wnt4 gene function led to impaired kidney development. In conclusion, we identified the culture conditions that can be used for the tamoxifen-induced conditional mutagenesis in tissue cultures. In addition, the created Wnt4 mouse lines serve as new useful tools for addressing the roles of Wnt4 function in diverse tissues and in different stages of development. / Tiivistelmä Hiirillä geenikohdennuksesta on muodostunut hyödyllinen väline proteiinien tehtävien selvittämisessä ja uusien eläinmallien luomisessa. Cre/loxP -tekniikkaa on käytetty laajasti muuntogeenisten hiirien tuottamisessa. Cre-rekombinaasi tunnistaa spesifisen DNA-jakson, niin kutsutun loxP:n, ja poistaa kaikki DNA-jaksot kahden loxP-sekvenssin väliltä. Cre-rekombinaasin aktiivisuutta voidaan säädellä paikallisesti ja ajallisesti solu- tai kudosspesifisillä promoottoreilla ja synteettisillä indusoivilla kemikaaleilla, kuten tamoksifeenillä tai tetrasykliinillä. Tässä väitöskirjassa hyödynsimme tamoksifeenin aiheuttamaa Cre-rekombinaatiota in vitro -kudosviljelmissä. Cre-ERTM-hiirilinja risteytettiin ROSA26LacZ-reportterilinjan kanssa, ja 4-hydroksitamoksifeenin indusoima Cre-rekombinaasin aktiivisuutta monitoroitiin LacZ–värjäyksellä. 0.5 µM:n 4OH-TM konsentraatiolla LacZ-reportterigeeni saatiin aktivoitua tehokkaasti Cre-rekombinaasin avulla sekä munuaisviljelmissä että munuaismesenkyymiviljelmissä. Wnt4 on erittyvä signalointimolekyyli, jolla on keskeinen rooli useiden elinten, kuten munuaisen, munasarjan, lisämunuaisen, rintarauhasen ja aivolisäkkeen kehittymisessä. Wnt4-geenillä on ratkaisevan tärkeä rooli munuaisen kehityksessä, ja poistogeeninen Wnt4-/-hiiri kuolee pian syntymän jälkeen, todennäköisesti munuaisen vajaatoimintaan. Tässä väitöskirjatyössä tuotettiin kaksi eri Wnt4 alleelia, Wnt4EGFPCre ja konditionaalinen Wnt4. Nämä hiirilinjat analysoitiin, jotta saisimme lisää tietoa Wnt4-geenin toiminnasta ja pystyisimme soveltamaan kyseisiä hiirikantoja munuaisten toiminnan selvittämisessä. Wnt4EGFPCre-alleelissa EGFPCre-fuusio -cDNA kohdennettiin osaksi endogeenisen Wnt4-geenin ykköseksonia. Vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) aktiivisuus havaittiin varhaisen munuaisen kehityksen aikana. Wnt4EGFPCre-alleelin lisäkarakterisointi reportterilinjoilla (Rosa26LacZ ja Rosa26YFP) osoitti, että Wnt4-geenin ilmentyminen havaittiin munuaisen lisäksi sukurauhasissa, selkäytimessä, keuhkoissa sekä lisämunuaisessa. Wnt4EGFPCre-alleeli ilmentyi niissä kudoksissa, joissa endogeenisen Wnt4-geenin tiedetään olevan aktiivinen. Time-lapse -analyysin avulla osoitettiin, että Wnt4-geeniä ilmentävät solut muodostavat tiettyjä rakenteita munuaisen kehityksen aikana. Wnt4-geeni ilmentyi nefroneissa, kehittyvän virtsajohtimen soluissa sekä useissa medullaarisissa stroomasoluissa. Konditionaalisessa (ehdollisessa) Wnt4 knock-out-hiirilinjassa loxP-sekvenssit sijoitettiin eksonien kolme sekä viisi ympärille. Wnt4-geenin toiminta inaktivoitiin CAGCre- ja Wnt4EGFPCre-hiirilinjojen avulla. Näissä molemmissa tapauksissa Wnt4-geenin toiminnan poistaminen johti munuaisen kehityshäiriöön. Yhteenvetona voimme todeta, että olemme tunnistaneet ne kasvatusolosuhteet, joita voidaan hyödyntää, kun halutaan aktivoida reportterigeenejä tai kehityksen kannalta tärkeitä geenejä tamoksifeenin aiheuttamaa Cre/loxP -rekombinaatiota hyväksikäyttäen kudosviljelmissä. Samoja olosuhteita ja menetelmää käyttäen voidaan myös poistaa jonkun kehityksen kannalta tärkeän geenin toiminta ja tutkia sitä kudosviljelmässä. Tuotetut Wnt4-hiirikannat ovat lisäksi uusia hyödyllisiä työkaluja, kun halutaan tutkia Wnt4-geenin toimintaa erilaisissa kudoksissa ja eri kehitysvaiheiden aikana.

Abstract The embryonic urogenital system generates the metanephric kidneys, the gonads and the adrenal glands, and its development is based on sequential and reciprocal cell and tissue interactions. The mechanisms which regulate urogenital ontogeny are still poorly understood. In this thesis, the roles of Wnt-4 and ErbB4 functions in gonad and kidney development were analysed by using in vivo functional genomic technologies. Wnt-4 is crucial in female development since its absence leads to a partial female to male sex reversal. We found that Wnt-4 mediated the interactions between the somatic and the germ cells and played a role in meiosis which is regulated in part by the secreted signal retinoic acid (RA). Expression of certain meiosis-controlling genes (Stra8, Spo11) was inhibited in the Wnt-4 deficient germ cells, while certain pluripotency genes (Oct4, Fgf9, Sox2 and Dnmt3l) were activated similarly as in the wild-type male gonad. In addition to this, we noted that a gene encoding for a Cyp26b1 enzyme, which degrades RA in the embryonic testis, was ectopically expressed in the Wnt-4 deficient ovary. Microarray analysis was used to identify candidate Wnt-4 target genes by using the Wnt-4 knock-out mouse. Of these genes, Runx-1 may represent a novel signalling target to mediate Wnt-4 activity in the control female development The role of receptor-tyrosine kinase ErbB4 in kidney development was studied by using both in vivo gain and loss of function approaches. In the gain-of-function situation, we found that certain markers for the epithelial tubules and collecting ducts lost their polarized expression pattern. At the same time, the orientation of the cells in the kidney tubules was deregulated and an increase in cell proliferation was noticed. We suggest that the observed defects gave rise to an increase in the tubule diameter and to cyst formation in the kidney cortex. In the loss-of-function mouse, the lack of ErbB4 expression led to a similar phenotype as with the gain of function, and the renal functions of the mutant adult kidneys were compromised. In conclusion, the results point to specific roles for Wnt-4 and ErbB4 in the control of urogenital development. Wnt-4 appears to be crucial in sustaining proper female somatic cell and germ cell differentiation, and maintenance of gonad development during and after the sex determination event, while ErbB4 activity is critical for the regulation of tubular growth in embryonic kidney development. / Tiivistelmä Sekä nisäkkään jälkimunuainen, lisämunuainen että sukurauhanen kehittyvät alkion urogenitaalialueen järjestelmästä ja solu- ja kudosvuorovaikutukset ohjaavat elinkehitysprosessia. Tapahtuman molekyylitason mekanismit ovat kuitenkin huonosti tunnettuja. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin Wnt-4 signaalin tehtäviä sukurauhasen ja ErbB4- proteiinin munuaisen kehityksessä. Wnt-4 signaali on keskeinen naisen sukupuolisuuden kehityksessä, koska signaalin puutos aiheuttaa alkion sukupuolen osittaisen kääntymisen naaraasta koiraaksi. Tarkastelimme aluksi sitä, välittääkö Wnt-4 itusolujen ja sukurauhasen somaattisten solujen vuorovaikutuksia ohjaten itusolujen meioosia, jota mm. A-vitamiini säätelee. Havaitsimme, että Wnt-4 geeni puuttuessa tietyt meioosia säätelevät geenit kuten Stra8 ja Spo11 olivat heikentyneet, kun taas solujen monikykyisyyteen liittyvät geenit kuten Oct4, Fgf9, Sox2 ja Dnmt3l aktivoituivat vastaavalla tavalla kuin havaitaan normaalisti koirasalkion kivesaiheessa. Tämän lisäksi havaitsimme, että Cyp26b1-geeni, joka johtaa A-vitamiinin hajoamiseen alkiossa ja estää normaalisti meioosin koirasalkion kivesaiheessa oli aktivoitunut munuaisrauhasaiheessa, jolta puuttuu Wnt-4 aktiivisuus. Tuloksemme osoittavat, että Wnt-4 säätelee osaltaan naarasalkion itusolujen meioosia. Tarkastelimme myös mikrosirututkimusten avulla niitä geenejä, joita Wnt-4 säätelee sukuelinaiheessa. Identifioimme useissa Wnt ja β-catenin signaalireittiin liittyvissä geeneissa muutoksia. Muuntuneet geenit voivat olla Wnt-4 signaalireitin kohdegeenejä. Näistä Runx-1 saattaa olla keskeinen Wnt signaalitien kohdegeeni, joka säätelee merkittävällä tavalla naaraan munarauhasen kehitystä. Väitöskirjan toisessa osassa tarkastelimme ErbB4-reseptorityrosiinikinaasin tehtäviä munuaisen kehityksen säätelyssä. ErbB4-geenin tehtäviä tutkittiin käyttäen hyväksi siirtogeenisiä malliorganismeja, joissa ErbB4-geenin määrä oli joko koholla tai ajastetusti inaktivoitu. ErbB4- geenin kokeellinen yliaktiivisuus muutti spesifisti tekijöitä, jotka säätelevät osaltaan jälkimunuaisen epiteeliputkien solujen orientaatiota ja solun jakautumista. Solujen orientaatiomuutoksen yhteydessä myös solujen jakautuminen häiriintyi. Oletuksemme on, että nämä epiteelikudoksessa tapahtuneet muutokset ovat syy, miksi kohotettu ErbB4-aktiviteetti muuttaa epiteeliputkien paksuutta ja pituutta erityisesti munuaisen pintakerroksissa. Havaitsimme myös, että ErbB4-geenin ajastettu poistaminen munuaisen epiteelikudoksessa johti hyvin samankaltaisiin, mutta vastakkaisiin muutoksiin kuin ErbB4-aktiviteetin kohottaminen. Muutokset johtivat myös muutoksiin munuaisen toiminnassa. Yhteenvetona toteamme, että näillä Wnt-4 ja ErbB4 solusignallointiin liittyvillä molekyyleillä on keskeinen tehtävä alkion munarauhasen ja munuaisen aiheen kehityksen säätelyssä. Wnt-4 ohjaa sekä itusolujen että somaattisten solujen erilaistumista ja samalla sukupuolen määräytymistä ja jatkokehitystä, kun taas ErbB4-signallointireseptorin tehtävä on avainasemassa munuaisen epiteeliputken kasvun säätelyssä.