Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Charakterisierung des XIAP-Gens bei zwei Familien mit X-chromosomalem lymphoproliferativem Syndrom Eingereicht von: Peter Christian Horn geboren am 04.08.1982 in Freiburg Angefertigt an: Der Universitätsklinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche Leipzig und dem Zentrum für familiären Brust- und Eierstockkrebs der technischen Universität München Betreuer: Prof. Dr. med. Volker Schuster (Universität Leipzig) Prof. Dr. rer. nat. Alfons Meindl (TU München) Eingereicht im Dezember 2014 Das X-linked-inhibitor-of-apoptosis Protein XIAP nimmt eine zentrale Rolle in der Hemmung von Apoptoseprozessen beim Menschen ein. In Abwesenheit von XIAP kann eine defekte Immunabwehr gegenüber viralen Infektionen beobachtet werden. In Folge können lebensbedrohliche Immunreaktionen wie hämophagozytäre Lymphhistiozytose, aplastische Anämie und persistierende Hypogammaglobulinämie auftreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob bei einem Patientenkollektiv mit lymphoproliferativem Syndrom Mutationen im XIAP-Gen Auslöser der Erkrankung sind. Es wurde eine molekulargenetische Sequenzierung und Auswertung des XIAP- 5 Zusammenfassung der Arbeit 53 Gens bei 36 Verdachtsfällen eines X-chromosomal vererbten lymphoproliferativen Syndroms durchgeführt. In allen Fällen wurde der gesamte exonische Abschnitt des Gens sequenziert und auf Polymorphismen und Mutationen untersucht. Bei zwei Proben wurden Mutationen im XIAP-Gen gefunden. Weiter konnten Mutter und Bruder eines der Betroffenen untersucht werden, so dass insgesamt drei Knaben mit XIAP-Gendefekt sowie eine heterozygote Konduktorin identifiziert wurden. Nach der Identifikation der Mutationsträger erfolgte eine Auswertung der Krankenge- schichte und ein Vergleich mit den verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz. Die beiden neu identifizierten Mutationen verursachen ein Krankheitsbild, das mit den wenigen verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz vereinbar ist. Die Auswer- tung der Klinik der drei Betroffenen unterstützt die Hypothese, dass bei XIAP- Defizienz keine Lymphome auftreten. Die Therapieentscheidung bei XIAP-Defizienz ist einzelfallabhängig. Die Arbeit ver- gleicht den Krankheitsverlauf der neu beschriebenen Patienten mit der Literatur und unterstreicht, dass die Entscheidung zu einer Knochenmarkstransplantation gut begrün- det werden muss. Es sind inzwischen mehr Patienten bekannt, die ohne Therapie oder unter IVIG-Gabe asymptomatisch sind, als solche, die eine Knochenmarkstransplantati- on überlebt haben. Alle hier beschriebenen Patienten konnten ohne Transplantation be- handelt werden. Eine Stammzelltransplantation kann jedoch erfolgreich sein. Bei kon- servativ behandelten Patienten können Rezidive auftreten. Kritisch zu sehen sind im Licht der Erfahrung mit den XIAP-defizenten Patienten An- strengungen, XIAP-Inhibitoren zur Tumortherapie am Menschen zu entwickeln – dies könnte als Nebenwirkung paradoxe Folgen wie Lymphoproliferation oder HLH haben. Die in der Arbeit beschriebenen Patienten waren die ersten Patienten mit XIAP- Defizienz, die im deutschsprachigen Raum identifiziert wurden. Die beiden Mutationen die bei den Familien gefunden wurden, waren bisher nicht beschrieben.

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Charakterisierung des XIAP-Gens bei zwei Familien mit X-chromosomalem lymphoproliferativem Syndrom Eingereicht von: Peter Christian Horn geboren am 04.08.1982 in Freiburg Angefertigt an: Der Universitätsklinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche Leipzig und dem Zentrum für familiären Brust- und Eierstockkrebs der technischen Universität München Betreuer: Prof. Dr. med. Volker Schuster (Universität Leipzig) Prof. Dr. rer. nat. Alfons Meindl (TU München) Eingereicht im Dezember 2014 Das X-linked-inhibitor-of-apoptosis Protein XIAP nimmt eine zentrale Rolle in der Hemmung von Apoptoseprozessen beim Menschen ein. In Abwesenheit von XIAP kann eine defekte Immunabwehr gegenüber viralen Infektionen beobachtet werden. In Folge können lebensbedrohliche Immunreaktionen wie hämophagozytäre Lymphhistiozytose, aplastische Anämie und persistierende Hypogammaglobulinämie auftreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob bei einem Patientenkollektiv mit lymphoproliferativem Syndrom Mutationen im XIAP-Gen Auslöser der Erkrankung sind. Es wurde eine molekulargenetische Sequenzierung und Auswertung des XIAP- 5 Zusammenfassung der Arbeit 53 Gens bei 36 Verdachtsfällen eines X-chromosomal vererbten lymphoproliferativen Syndroms durchgeführt. In allen Fällen wurde der gesamte exonische Abschnitt des Gens sequenziert und auf Polymorphismen und Mutationen untersucht. Bei zwei Proben wurden Mutationen im XIAP-Gen gefunden. Weiter konnten Mutter und Bruder eines der Betroffenen untersucht werden, so dass insgesamt drei Knaben mit XIAP-Gendefekt sowie eine heterozygote Konduktorin identifiziert wurden. Nach der Identifikation der Mutationsträger erfolgte eine Auswertung der Krankenge- schichte und ein Vergleich mit den verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz. Die beiden neu identifizierten Mutationen verursachen ein Krankheitsbild, das mit den wenigen verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz vereinbar ist. Die Auswer- tung der Klinik der drei Betroffenen unterstützt die Hypothese, dass bei XIAP- Defizienz keine Lymphome auftreten. Die Therapieentscheidung bei XIAP-Defizienz ist einzelfallabhängig. Die Arbeit ver- gleicht den Krankheitsverlauf der neu beschriebenen Patienten mit der Literatur und unterstreicht, dass die Entscheidung zu einer Knochenmarkstransplantation gut begrün- det werden muss. Es sind inzwischen mehr Patienten bekannt, die ohne Therapie oder unter IVIG-Gabe asymptomatisch sind, als solche, die eine Knochenmarkstransplantati- on überlebt haben. Alle hier beschriebenen Patienten konnten ohne Transplantation be- handelt werden. Eine Stammzelltransplantation kann jedoch erfolgreich sein. Bei kon- servativ behandelten Patienten können Rezidive auftreten. Kritisch zu sehen sind im Licht der Erfahrung mit den XIAP-defizenten Patienten An- strengungen, XIAP-Inhibitoren zur Tumortherapie am Menschen zu entwickeln – dies könnte als Nebenwirkung paradoxe Folgen wie Lymphoproliferation oder HLH haben. Die in der Arbeit beschriebenen Patienten waren die ersten Patienten mit XIAP- Defizienz, die im deutschsprachigen Raum identifiziert wurden. Die beiden Mutationen die bei den Familien gefunden wurden, waren bisher nicht beschrieben.:Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................... 2 Abbildungsverzeichnis.................................................................................................... 4 Tabellenverzeichnis......................................................................................................... 4 Bibliographische Beschreibung ..................................................................................... 5 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 6 Vorwort ............................................................................................................................ 8 1 1.1 1.2 Einleitung................................................................................................................... 9 Ziele / Fragestellung ................................................................................................ 9 Wissensstand zu Beginn der Arbeit ....................................................................... 10 1.2.1 Begriffserklärung: Lymphoproliferative Erkrankung ......................................... 10 1.2.2 Begriffserklärung: Mononukleose ....................................................................... 11 1.2.3 Begriffserklärung: Hämophagozytische Lymphhistiozytose (HLH) .................. 11 1.2.4 X-chromosomale lymphoproliferative Syndrome – Erstbeschreibung ............... 13 1.2.5 X-chromosomale lymphoproliferative Syndrome - Entdeckung der XIAP- Defizienz.............................................................................................................. 18 1.2.6 X-chromosomale lymphoproliferative Syndrome – Klinik der XIAP- Defizienz.............................................................................................................. 22 1.3 2 2.1 Aufgabenstellung ................................................................................................... 22 Material und Methoden.......................................................................................... 25 Auswahl der zu untersuchenden Proben ................................................................ 25 2.2 2.2.1 Isolierung der DNA ............................................................................................. 26 2.2.2 Herstellung der Primer......................................................................................... 27 2.2.3 Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und Sequenzierung ..................................... 29 2.3 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 Genetische Untersuchung ...................................................................................... 25 Auswertung ............................................................................................................ 31 Resultate................................................................................................................... 32 Genveränderungen ................................................................................................. 32 Single Nucleotide-Polymorphismen .................................................................... 32 Mutationen ........................................................................................................... 32 Klinik der Patienten ............................................................................................... 33 Familie I: S347Lfs5x-Mutation ........................................................................... 33 Familie I: Mutter und zwei Onkel der Betroffenen ............................................. 34 Familie I: 27 Jahre alter, positiv getesteter Erwachsener .................................... 35 Inhaltsverzeichnis 3 3.2.4 3.2.5 3.3 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.2 4.3 Familie I: 29 Jahre alter, positiv getester Erwachsener ....................................... 35 Familie II: 17 Jahre alter Knabe mit R222X-Mutation ....................................... 37 Übersicht über die Klinik der Patienten ................................................................. 38 Diskussion ................................................................................................................ 41 Hauptthese: Im Patientenkollektiv können XIAP-Gen Mutationsträger identifiziert werden .............................................................................................. 41 Prozentualer Anteil positiv getesteter Proben und Vergleich mit der Literatur .. 42 Vergleich der erhobenen klinischen Daten mit der Literatur .............................. 44 Nebenthese: Bei XIAP-Defizienz werden im Gegensatz zur SAP-Defizienz keine Lymphome beobachtet ............................................................................... 46 Nebenthese: Bei der Therapie kann ein konservativer Ansatz einer Knochenmarkstransplantation vorzuziehen sein ................................................. 47 5 Anhang: Einwilligungen ............................................................................................... 54 Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 56 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ......................................... 62 Lebenslauf...................................................................................................................... 63 Verzeichnis eigener Veröffentlichungen ..................................................................... 64 Danksagung ................................................................................................................... 65

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

TESI:L'objecte d'estudi d'aquesta tesi és el receptor CD84, que pertany a la Família del CD150, alhora englobada dins la superfamília de les immunoglobulines. La família del CD150 està composta per nou receptors que comparteixen una elevada homologia estructural, i que poden presentar interacció homotípica o heterotípica. Sis dels membres d'aquesta família presenten a la seva cua citoplasmàtica almenys un motiu d'unió a les proteïnes adaptadores SAP i EAT-2. La deficiència del gen que codifica per la proteïna SAP (SH2D1A), és la causant de l'aparició d'una immunodeficiència lligada al cromosoma X, la Síndrome XLP, corresponent a un desordre de baixa incidència, que es caracteritza per una elevada susceptibilitat al virus del Epstein-Barr. El CD84 es troba àmpliament expressat a la superfície dels leucòcits i és l'únic membre de la família que es troba expressat a nivells elevats en mastòcits en estat basal. Els mastòcits són les principals cèl·lules efectores de les reaccions al·lèrgiques, tot i que es troben implicats en molts altres processos, inclosos la immunitat innata i l'autoimmunitat. La via clàssica d'activació dels mastòcits s'inicia amb la unió de la IgE al receptor d'alta afinitat per la IgE (FcepsilonRI) i dóna lloc a l'alliberació d'histamina i molts altres mediadors. Les respostes mastocitàries requereixen una regulació molt precisa que està mitjançada per un ampli ventall de factors i molècules. L'objectiu d'estudi d'aquesta tesi ha estat determinar la funció del receptor CD84 en l'activació mastocitària, donada l'elevada expressió d'aquest immunoreceptor en mastòcits, i les implicacions d'aquest tipus cel·lular en la regulació de les respostes del sistema immunitari.Mitjançant estudis de sobre-expressió del receptor CD84 en una línia mastocitària de rata, RBL-2H3, vam caracteritzar el CD84 com un nou receptor inhibidor de la cascada de senyalització iniciada pel receptor d'alta afinitat per la IgE. Vam demostrar que el receptor CD84 inhibeix tant esdeveniments primerencs (com la senyalització de calci, la reorganització del citoesquelet, la desgranulació i la fosforilació de MAPKs), com esdeveniments tardans (síntesi de citocines), mitjançant la interacció homotípica, on el receptor actua com el seu propi lligand. Mitjançant la generació de mutants puntuals per a les quatre tirosines que el receptor CD84 presenta a la seva cua citoplasmàtica, vam disseccionar la implicació de cadascuna d'elles en el mecanisme inhibitori del CD84, i vam comprovar que les tirosines responsables de la inhibició del CD84 són les que es troben a les posicions 279 i 324. Per altra banda, les tirosines 262 i 299, que es troben englobades en motius d'unió a les proteïnes adaptadores SAP i EAT-2, no participen en el mecanisme inhibitori del CD84, determinant que la funció negativa del receptor és independent de SAP. Mitjançant estudis bioquímics, vam determinar que les molècules adaptadores c-CBL i DOK-1 participen en el mecanisme inhibitori del CD84. Vam fer també estudis de transfecció en cèl·lules COS, amb la finalitat d'establir les cinases implicades en la fosforilació del receptor CD84 i vam determinar LYN i FPS/FES com les cinases principals en la fosforilació de les tirosines 279 i 324, respectivament. Finalment, vam utilitzar una línia mastocitària humana, LAD-2, que ens ha permès corroborar els efectes observats amb la línia RBL-2H3 en un sistema fisiològicament més proper a l'humà. Vam comprovar que l'efecte inhibitori del CD84, es manté en els esdeveniments primerencs estudiats en LAD-2, i vam confirmar també, en aquesta línia cel·lular, la implicació de DOK-1 en la senyalització negativa del CD84. Les dades obtingudes en aquesta tesi perfilen el receptor CD84 com un molècula important en la funció dels mastòcits i una possible diana terapèutica en al·lèrgies inflamatòries. / CD84 belongs to the CD150 family of receptors. This family is a subset of the CD2 cell-surface receptor Ig superfamily and it is defined by its binding to the cytoplasmic adaptors SAP and EAT-2. SAP/SH2D1A is the product of the gene mutation in X-linked lymphoproliferative disease (XLP), a rare immune disorder commonly triggered by Epstein-Barr virus. CD84 is a homophilic adhesion molecule expressed in a broad range of leukocytes. The CD84 is the only member of the CD150 family expressed in resting mast cells. Mast cells are currently recognized as effector cells in many settings other than mere allergic reactions, including innate immunity and autoimmunity. The classic and most studied activation pathway of these cells starts with the binding of IgE to the high-affinity Fc receptor for IgE (FcepsilonRI); and the release of histamine and other mediators after crosslinking of surface-bound IgE by allergen. Appropriate activation and fine tuning of mast cell responses is mediated by a complex array of factors and molecules. The aim of this work was to determine the function of CD84 in mast cells.The CD84 receptor was transfected and overexpressed in the rat mast cell line RBL-2H3. We found that this receptor has an inhibitory effect in early events (degranulation, cytoskeleton arrangement, calcium influx, MAPKs phosphorylation and PI3K phosphorylation) and late events (cytokines synthesis). Generation of mutants for each of the four tyrosines present in the cytoplasmic tail of the CD84, demonstrates that this inhibitory effect is related with Y279 and Y324. Interestingly, Y262 and Y299, which are part of a consensus motif for SAP or EAT-2 binding, do not participate in CD84-mediated inhibition. Thus, we postulate that the inhibitory effect of the CD84 is not mediated by SAP or EAT-2 in mast cells. We performed transfection studies with COS cells and we determined that LYN and FPS/FES kinases are the main kinases in Y279 and Y324 phosphorylation, respectively. Finally we used a human mast cell line, LAD-2, to corroborate the effects observed in RBL-2H3. We found that CD84 receptor has also an inhibitory effect in IgE-dependent early events in LAD-2, whereas no inhibitory effect was seen using non-immunological stimuli. These data suggest that CD84 may play a role in modulating FcepsilonRI-mediated signaling in mast cells and it could have a protective role against undesired allergic and inflammatory responses.

Une réponse immunitaire adéquate nécessite la participation coordonnée de plusieurs populations de cellules immunitaires, comme les lymphocytes T et B, les macrophages, les cellules dendritiques ou les cellules NK. L’activation de ces types cellulaires est modulée par différents récepteurs membranaires dont la fonction est de déclencher une cascade de signalisation.L’activation des lymphocytes T, acteurs cruciaux de la mise en place de la réponse immunitaire adaptative, s’initie par l’engagement du récepteur T (TCR). Plusieurs autres types de récepteurs participent à la modulation des réponses cellulaires. Ainsi, les récepteurs aux facteurs de croissance, aux cytokines et aux chimiokines ainsi que les molécules d’adhésion et les récepteurs de la famille SLAM (pour Signaling Lymphocyte Activation Molecule) influencent l’activation cellulaire. Des travaux récents ont montré que l’activation des récepteurs SLAM induit leur association avec les membres de la famille SAP et est nécessaire à l’induction d’une réponse humorale, au développement des cellules NKT ainsi qu’à la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T CD8 et les cellules NK. L’altération du gène sh2d1a codant pour SAP conduit à l’apparition du syndrome lymphoprolifératif lié à l’X-1 (XLP-1). Les patients atteints de ce syndrome développent trois principaux phénotypes cliniques qui sont une mononucléose infectieuse fulminante, une dysgammaglobulinémie, et des désordres lymphoprolifératifs.L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier les étapes précoces d’activation des lymphocytes T et de comprendre comment la protéine SAP, associée à d’autres protéines ou domaines protéiques intracellulaires, est impliquée dans la régulation de ces mécanismes d’activation. Mon travail s’est donc orienté vers l’identification de nouveaux partenaires de SAP, autres que les récepteurs SLAM, et qui nous permettraient de mieux définir la fonction de SAP dans la signalisation T. Par une approche de biochimie, mon travail a permis de démontrer que SAP s’associe directement à la chaîne CD3 du complexe TCR-CD3, régule la signalisation induite par l’activation du récepteur T et permet la sécrétion de cytokines. Enfin, par une approche de double hybride, nous avons identifié Pecam-1 comme nouveau partenaire de SAP. Nous avons par la suite observé que l’association de SAP avec Pecam-1 régule l’adhérence des lymphocytes T. Par ces deux études, mon travail de thèse a permis de démontrer l’implication de SAP dans de nouvelles voies de signalisation et permet de mieux comprendre les mécanismes dérégulés lors de l’absence de SAP. / Immune responses need a coordinate involvement between different immune cell populations, as T and B cells, macrophages, dendritic cells or NK cells. Activation of these different cell populations is mediated by different receptors whose function is to initiate a signal transduction cascade. T cell activation, a crucial event in adaptive immune response, begins with T cell receptor (TCR) triggering. A large number of receptors can modulate T cell responses. Thus, cytokines, chimiokines and growth factors receptors, adhesion molecules and SLAM (for Signaling Lymphocyte Activation Molecule) family receptors regulate cell activation. Recent works have shown that SLAM receptors triggering induce their association with SAP (for SLAM-Associated Protein) family members and is vital for humoral immunity, NKT cell development and T CD8+ and NK cells cytotoxicity. Mutations in sh2d1a gene, which code for SAP, are responsible of X-linked Lymphoproliferative-1 (XLP-1) syndrome. Patients, who suffer from this syndrome, develop three main clinical manifestations: a fulminant infectious mononucleosis, dysgammaglobulinemia and lymphoproliferative syndromes. My thesis work was to study early steps of T cell activation and to understand how the SAP protein, associated with its partners, regulates these cellular mechanisms. Thus, my work was to identify new SAP partners, others than SLAM receptors, in order to better understand SAP function in T cell signaling. With a biochemical approach, my work has demonstrated that SAP directly associates with CD3 chain of TCR-CD3 complex, regulates cell signaling and cytokines secretion following TCR triggering. Finally, with a two-hybrid assay, we have identified the adhesion molecule Pecam-1 as a new SAP partner. Then, we have observed that SAP directly interacts with Pecam-1 to regulate T cell adhesion. During my thesis work, we have identified new cellular signaling pathways that are regulated by SAP and permit to better understand the cellular mechanisms that are affected when SAP is absent.

Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT) représentent une sous-population particulière de cellules T qui se distingue par son développement, ses fonctions et les ligands qu’elle reconnaît. Chez l’homme, les cellules iNKT expriment le réarrangement Vα24-Jα18/Vβ11 et reconnaissent des glycosphingolipides présentés par la molécule monomorphe du CMH de classe I CD1d. De plus, elles produisent rapidement de grandes quantités de cytokines, et sont ainsi considérées comme des cellules T ayant des caractéristiques innées. Les mécanismes moléculaires qui régulent l’homéostasie descellules iNKT ne sont pas complètement compris. La protéine XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis) est un inhibiteur physiologique des caspases 3, 7 et 9. Des mutations du gène XIAP sont à l’origine du syndrome lymphoprolifératif lié à l’X de type 2 (XLP-2), un déficit immunitaire primitif (DIP) caractérisé par une susceptibilité accrue à l’infection par le virus Epstein Barr (EBV). Les patients souffrant du XLP-2 présentent une forte réduction de leur nombre de cellules iNKT dans le sang. Au cours de mon travail de thèse, j’ai montré que XIAP est requis pour la survie des cellules iNKT humaines. Cette fonction de XIAP corrèle avec un phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT qui n’est pas retrouvé dans les cellules T conventionnelles. La susceptibilité accrue à l’apoptose des cellules iNKT est observée en utilisant des stimuli de la voie intrinsèque ou extrinsèque de l’apoptose. Les cellules iNKT, contrairement aux cellules T conventionnelles expriment des quantités élevées de protéines pro-apoptotiques comme les caspases 3 ou 7 ou Bid. Ce phénotype proapoptotique est acquis de manière précoce, puisqu’il est déjà présent dans des cellules iNKT de thymus ou de sang de cordon. L’extinction de XIAP dans des cellules iNKT et l’analyse de patients déficients en XIAP indiquent que XIAP est un inhibiteur efficace de l’apoptose dans les cellules iNKT alors qu’il n’a qu’un effet modéré dans les cellules T conventionnelles. J’ai ensuite montré que le phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT est dépendant de l’expression du facteur de transcription PLZF. Celui-ci est déjà connu comme étant nécessaire à l’acquisition des fonctions effectrices de cescellules. De manière concordante, la surexpression de PLZF dans des cellules T conventionnelles conduit à un phénotype pro-apoptotique et à une augmentation de l’expression de la caspase 3. Récemment, une deuxième population de cellules T invariantes, les cellules MAIT (Mucosal Associated Invariant T) a été décrite. Ces cellules expriment un TCR semi-invariant Vα7.2-Jα33 et partagent avec les cellules iNKT certaines caractéristiques qui en font des cellules T innées comme les cellules iNKT. De la même manière que les cellules iNKT, les cellules MAIT ont un phénotype proapoptotiqueet sont diminuées dans le sang des patients déficients en XIAP. Ce phénotype proapoptotique est aussi dépendant de PLZF. De manière intéressante, un patient déficient en XIAP et ayant un nombre normal de cellules iNKT a été identifié. Ce patient n’a pas encore rencontré l’EBV, suggérant que la diminution des cellules iNKT chez les patients déficients en XIAP est due à une apoptose augmentée dans un contexte d’infection par l’EBV. Enfin, j’ai obtenu des données préliminaires suggérant que l’EBV utilise un mécanisme d’échappement aux cellules iNKT en diminuant l’expression de CD1d à la surface des cellules B. Mon travail de thèse a donc permis d’identifier une voie de régulation inconnue des lymphocytes T innés qui dépend de XIAP et de PLZF. PLZF est donc un facteur clé pour la différentiation et l’homéostasie des cellules T innées en régulant l’acquisition de leurs fonctions effectrices et en limitant leur survie. Ces observations ont aussi permis d’identifier le premier DIP associé à un déficit en cellules MAIT. Enfin, ces résultats suggèrent un rôle des cellules iNKT dans le contrôle de l’infection par l’EBV. / Invariant natural killer T (iNKT) lymphocytes represent a peculiar T cell-lineage that differs from conventional T cells by its development, function, and ligands it recognizes. In humans, iNKT cells express an invariant TCR made of the V?24-J?18/V?11 rearrangement, which recognizes glycosphingolipids presented by the MHC class I monomorphic molecule CD1d. Moreover, they rapidly produce high amounts of cytokines when stimulated and are thus considered as innate-like T cells. The molecular mechanisms that control the homeostasis of iNKT are poorly understood. XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis) is a physiological inhibitor of caspases 3, 7 and 9 and is mutated in the X-linked lymphoproliferation syndrome 2 (XLP-2), a rare primary immunodeficiency (PID) characterized by a peculiar susceptibility to Epstein-Barr virus (EBV) infection. Patients with a XIAP deficiency exhibit a strong reduction of their iNKT cells in blood. Here, I report that XIAP is required for the survival of iNKT cells in humans. The requirement of XIAP correlates with a pro-apoptotic phenotype of iNKT cells that is not observed in conventional T cells. The increased susceptibility to apoptosis of iNKT cells was observed upon stimuli that trigger either extrinsic or intrinsic apoptosis pathways. iNKT cells by contrast to conventional T cells express elevated amounts of pro-apoptotic molecules including caspases 3 or 7 and Bid. The pro-apoptotic phenotype of iNKT cells is early acquired since iNKT cells from cord blood and thymus display a similar pro-apoptotic phenotype. Knock-down of XIAP in iNKT cells and analysis of XIAP-deficient humans indicate that XIAP is a potent inhibitor of apoptosis in iNKT cells while it has only a moderate effect in conventional T cells. I also show that this pro-apoptotic phenotype of iNKT cells is dependent of the expression of the transcription factor PLZF. This factor is already known to be necessary for the acquisition of the effector functions of these cells. Conversely, over expression of PLZF in conventional T cells leads to a pro-apoptotic phenotype and to an increased expression of caspase 3. Recently, a second invariant T cell subpopulation, the mucosal associated invariant T (MAIT) cells was identified both in humans and mice. These cells express a semi-invariant TCR made of V?7.2-J?33 rearrangements and share with iNKT cells a number of developmental, functional and phenotypical features that lead to consider MAIT cells as innate-like T cells like iNKT cells. Similarly, MAIT cells also exhibit a pro-apoptotic phenotype and are decreased in XIAP-deficient humans. The pro-apoptotic phenotype of MAIT cells is also dependent on PLZF. Interestingly, one XIAP-deficient patient with normal iNKT cell number was identified. This patient has not yet encountered EBV, suggesting that reduction of iNKT cells in XIAP-deficient patients is likely due to increased apoptosis in the context of EBV infection. I also show that EBV might have an escape mechanism from iNKT cells by down-regulating the expression of CD1d on the surface of B cells. My thesis works identify a previously unknown pathway controlling innate T cell homeostasis depending on XIAP and PLZF. PLZF is thus a key factor involved in the differentiation and the homeostasis of innate T cells by regulating the acquisition of their effector functions and their survival. I also identified the first PID associated with a defect in MAIT cells. Finally, these results provide evidences that iNKT cells might play a role against EBV infection.

Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT) représentent une sous-population particulière de cellules T qui se distingue par son développement, ses fonctions et les ligands qu'elle reconnaît. Chez l'homme, les cellules iNKT expriment le réarrangement Vα24-Jα18/Vβ11 et reconnaissent des glycosphingolipides présentés par la molécule monomorphe du CMH de classe I CD1d. De plus, elles produisent rapidement de grandes quantités de cytokines, et sont ainsi considérées comme des cellules T ayant des caractéristiques innées. Les mécanismes moléculaires qui régulent l'homéostasie descellules iNKT ne sont pas complètement compris. La protéine XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis) est un inhibiteur physiologique des caspases 3, 7 et 9. Des mutations du gène XIAP sont à l'origine du syndrome lymphoprolifératif lié à l'X de type 2 (XLP-2), un déficit immunitaire primitif (DIP) caractérisé par une susceptibilité accrue à l'infection par le virus Epstein Barr (EBV). Les patients souffrant du XLP-2 présentent une forte réduction de leur nombre de cellules iNKT dans le sang. Au cours de mon travail de thèse, j'ai montré que XIAP est requis pour la survie des cellules iNKT humaines. Cette fonction de XIAP corrèle avec un phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT qui n'est pas retrouvé dans les cellules T conventionnelles. La susceptibilité accrue à l'apoptose des cellules iNKT est observée en utilisant des stimuli de la voie intrinsèque ou extrinsèque de l'apoptose. Les cellules iNKT, contrairement aux cellules T conventionnelles expriment des quantités élevées de protéines pro-apoptotiques comme les caspases 3 ou 7 ou Bid. Ce phénotype proapoptotique est acquis de manière précoce, puisqu'il est déjà présent dans des cellules iNKT de thymus ou de sang de cordon. L'extinction de XIAP dans des cellules iNKT et l'analyse de patients déficients en XIAP indiquent que XIAP est un inhibiteur efficace de l'apoptose dans les cellules iNKT alors qu'il n'a qu'un effet modéré dans les cellules T conventionnelles. J'ai ensuite montré que le phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT est dépendant de l'expression du facteur de transcription PLZF. Celui-ci est déjà connu comme étant nécessaire à l'acquisition des fonctions effectrices de cescellules. De manière concordante, la surexpression de PLZF dans des cellules T conventionnelles conduit à un phénotype pro-apoptotique et à une augmentation de l'expression de la caspase 3. Récemment, une deuxième population de cellules T invariantes, les cellules MAIT (Mucosal Associated Invariant T) a été décrite. Ces cellules expriment un TCR semi-invariant Vα7.2-Jα33 et partagent avec les cellules iNKT certaines caractéristiques qui en font des cellules T innées comme les cellules iNKT. De la même manière que les cellules iNKT, les cellules MAIT ont un phénotype proapoptotiqueet sont diminuées dans le sang des patients déficients en XIAP. Ce phénotype proapoptotique est aussi dépendant de PLZF. De manière intéressante, un patient déficient en XIAP et ayant un nombre normal de cellules iNKT a été identifié. Ce patient n'a pas encore rencontré l'EBV, suggérant que la diminution des cellules iNKT chez les patients déficients en XIAP est due à une apoptose augmentée dans un contexte d'infection par l'EBV. Enfin, j'ai obtenu des données préliminaires suggérant que l'EBV utilise un mécanisme d'échappement aux cellules iNKT en diminuant l'expression de CD1d à la surface des cellules B. Mon travail de thèse a donc permis d'identifier une voie de régulation inconnue des lymphocytes T innés qui dépend de XIAP et de PLZF. PLZF est donc un facteur clé pour la différentiation et l'homéostasie des cellules T innées en régulant l'acquisition de leurs fonctions effectrices et en limitant leur survie. Ces observations ont aussi permis d'identifier le premier DIP associé à un déficit en cellules MAIT. Enfin, ces résultats suggèrent un rôle des cellules iNKT dans le contrôle de l'infection par l'EBV.

La família del CD150 es troba constituïda per nou proteïnes expressades en la superficie dels leucòcits implicades en l'activació dels limfòcits i que pertanyen a la superfamília de les immunoglobulines. Els receptors CD84, CD150 (SLAM), CD229 (Ly9), CD244 (2B4), NTB-A i CS1 s'associen amb els adaptadors SAP (SLAM-associated protein) i EAT-2. L'adaptador SAP és una proteïna intracel·lular que es troba mutada en malalts amb el síndrome d'immunodeficiència lligat al cromosoma X (XLP).Aquest estudi s'ha analizat l'expressió de CD84, CD150, CD229 i CD244 en diferents leucòcits i poblacions limfocitàries mitjançant citometria de fluxe. El CD84 i el CD150 estaven presents en timòcits, cèl·lules T madures i cèl·lules presentadores d'antígen. L'expressió de CD84 i CD150 era elevada en cél·lules T memòria. L'expressió de CD150 s'incrementava molt després de l'activació. Al contrari que el CD84, el CD150 es trobava absent en monòcits en repòs i en cèl·lules dendrítiques immadures. El CD229 presentava un patró d'expressió restringit a limfòcits. El CD244 s'expressava de forma preferencial en cèl·lules NK, limfòcits CD8+ efectors, monòcits en repòs, basòfils i eosinòfils. Nosaltres hem descrit una distribució de CD84, CD150, CD229 i CD244 més àmplia que la prèviament descrita i hem demostrat que aquestes molècules s'expressen de forma diferencial en les cèl·lules hematopoiètiques. L'expressió heterogènea d'aquests receptors indica que deuen tenir funcions no redundants en la regulació tant del sistema immune adaptatiu com de l'innat.Amb la finalitat d'identificar el lligand de CD84, es va generar una proteïna de fusió soluble constituïda pels dominis extracel·lulars de CD84 i dos dominis immunoglobulina constants de la IgG humana (CD84-Ig). Degut a que ja havien estat descrites diverses interaccions entre membres de la mateixa família CD2 / CD150, es va assajar la interacció de la proteïna de fusió CD84-Ig amb cèl·lules COS transfectades amb els cDNAs de diferents membres de la família CD2 / CD150. La proteïna de fusió CD84-Ig interaccionava amb cèl·lules transfectades amb el cDNA de CD84, però no s'observava cap interacció amb la resta de membres de la família del CD2 / CD150. Així doncs, el CD84 interaccionava amb ell mateix. Els anticossos contra CD84 que reconeixien el primer domini V-like, bloquejaven la interacció de la proteïna de fusió de CD84 en les cèl·lules transfectades amb el cDNA de CD84 i en plaquetes. A més a més, els resultats obtinguts amb quimeres humà / murí dels dominis extracel·lulars de CD84, demostren que únicament el primer domini extracel·lular N-terminal és el responsable de la interacció homofílica. La interacció CD84-CD84 és independent de la seva cua citoplasmàtica. Finalment, la co-lligació del CD84 amb anticossos contra CD84 o la proteïna de fusió CD84-Ig i anticossos contra CD3, incrementen la secreció de IFN-gamma en limfòcits humans. Així, CD84 interacciona de manera homotípica i actua com a molècula coestimuladora.Amb l'objectiu d'indentificar el lligand de CD229, es va generar una proteïna de fusió soluble que contenia els dos dominis Ig N-terminals del receptor CD229 (CD229-Ig). La proteïna de fusió CD229-Ig s'unia a les cèl·lules transfectades amb el cDNA de CD229 però no es va detectar cap interacció amb les cèl·lules que expressaven la resta dels membres de la família del CD150, demostrant així que CD229 interaccionava de manera homofílica. Tant el CD229 humà com el de ratolí interaccionen amb ells mateixos. Amb mutants en que es deleccionaven els dominis Ig es va demostrar que el domini immunoglobulina N-terminal mitjançava l'adhesió homofílica. La interacció CD229-CD229 es veia severament compromesa quan es mutaven tres aminoàcids carregats del domini Ig N-terminal: E27 i E29 en el "loop" B-C i R89 en el "loop" F-G, localitzacions predites mitjançant anàlisi computacional. De manera sorprenent, la mutació R44A augmentava la interacció homofílica. Imatges obtingudes per microscopia confocal revelaven que el CD229 es relocalizava en les zones de contacte entre les cèl·lules B i T durant la formació de la sinapsi immunològica. Per tant, CD229 interacciona de forma homotípica i participa en la sinapsi immunològica.

Une réponse immunitaire adéquate nécessite la participation coordonnée de plusieurs populations de cellules immunitaires, comme les lymphocytes T et B, les macrophages, les cellules dendritiques ou les cellules NK. L'activation de ces types cellulaires est modulée par différents récepteurs membranaires dont la fonction est de déclencher une cascade de signalisation.L'activation des lymphocytes T, acteurs cruciaux de la mise en place de la réponse immunitaire adaptative, s'initie par l'engagement du récepteur T (TCR). Plusieurs autres types de récepteurs participent à la modulation des réponses cellulaires. Ainsi, les récepteurs aux facteurs de croissance, aux cytokines et aux chimiokines ainsi que les molécules d'adhésion et les récepteurs de la famille SLAM (pour Signaling Lymphocyte Activation Molecule) influencent l'activation cellulaire. Des travaux récents ont montré que l'activation des récepteurs SLAM induit leur association avec les membres de la famille SAP et est nécessaire à l'induction d'une réponse humorale, au développement des cellules NKT ainsi qu'à la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T CD8 et les cellules NK. L'altération du gène sh2d1a codant pour SAP conduit à l'apparition du syndrome lymphoprolifératif lié à l'X-1 (XLP-1). Les patients atteints de ce syndrome développent trois principaux phénotypes cliniques qui sont une mononucléose infectieuse fulminante, une dysgammaglobulinémie, et des désordres lymphoprolifératifs.L'objectif de mon travail de thèse a été d'étudier les étapes précoces d'activation des lymphocytes T et de comprendre comment la protéine SAP, associée à d'autres protéines ou domaines protéiques intracellulaires, est impliquée dans la régulation de ces mécanismes d'activation. Mon travail s'est donc orienté vers l'identification de nouveaux partenaires de SAP, autres que les récepteurs SLAM, et qui nous permettraient de mieux définir la fonction de SAP dans la signalisation T. Par une approche de biochimie, mon travail a permis de démontrer que SAP s'associe directement à la chaîne CD3 du complexe TCR-CD3, régule la signalisation induite par l'activation du récepteur T et permet la sécrétion de cytokines. Enfin, par une approche de double hybride, nous avons identifié Pecam-1 comme nouveau partenaire de SAP. Nous avons par la suite observé que l'association de SAP avec Pecam-1 régule l'adhérence des lymphocytes T. Par ces deux études, mon travail de thèse a permis de démontrer l'implication de SAP dans de nouvelles voies de signalisation et permet de mieux comprendre les mécanismes dérégulés lors de l'absence de SAP.