Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-08Bitstream added on 2014-06-13T21:03:52Z : No. of bitstreams: 1 souza_ec_dr_jabo.pdf: 821266 bytes, checksum: 46390da0d02b9c37aa41e4af297432aa (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico é uma das principais doenças da cultura do citros, provocando lesões nas folhas, ramos e frutos, tendo como consequência a queda dos frutos e folhas, o que leva à perdas significativas na produção. A partir do sequenciamento completo do genoma da bactéria gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), agente causal do cancro cítrico, abriu-se a possibilidade da utilização de estratégias de análise genômica funcional no estudo da função de genes da bactéria relacionados com a infecção na planta e com o desenvolvimento da doença. Uma das estratégias utilizadas foi a obtenção de mutantes de Xac contendo genes relacionados à patogenicidade e virulência interrompidos pelo método de mutagênese insercional aleatória utilizando o transposon Tn5 (LAIA et al., 2009). No presente trabalho a técnica de microarranjos de DNA foi utilizada para avaliar a expressão global de genes de dois mutantes de Xac 72 h após a infecção in planta. Em um dos mutantes (8B7) o gene interrompido foi o xrvA, um regulador de virulência, e no outro mutante (18D6) o gene interrompido codifica uma histidina quinase híbrida sensora que faz parte de um sistema de transdução de sinal de dois componentes. Os resultados das hibridizações revelaram um total de 553 genes diferencialmente expressos para os dois mutantes estudados quando comparado com o genótipo selvagem (Xac 306), sendo 323 no mutante 8B7 e 230 no mutante 18D6. Esses genes foram divididos em diferentes categorias funcionais e uma análise funcional comparativa revelou que eles podem desempenhar um papel importante no processo de patogenicidade / Citrus canker is a major disease affecting citrus crops worldwide, causing lesions on leaves, branches and fruits that results in the falling of fruit and leaves, leading to significant losses in orange production. The complete genome sequencing of Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), a Gram-negative bacteria and the causal agent of citrus canker, allowed the possibility of using functional genomic strategies to study the function of genes related to plant infection and disease development in this bacteria. One strategy was to produce mutants for phatogenicity and virulence genes by random insertional mutagenesis using Tn5 Transposon (LAIA et al., 2009). In the present work DNA microarray analysis was used to evaluate the global gene expression profile of two Xac mutants after 72 hours of plant infection. One mutant (8B7) carry a mutation in the xrvA gene (XAC1495), a virulence regulator, and the other (18D6) carry a mutation in a hybrid histidine quinase sensor of a two-component signal transduction system. The results revealed a total of 553 differentially expressed genes for the two mutant strains compared with Xac wild type, with 323 in the mutant 8B7, and 230 in the mutant 18D6. These genes were allocated into several functional categories and a comparative functional analysis showed that they can play an important role in the pathogenicity and virulence of Xac

Upland cotton (Gossypium hirsutum) is an important crop in Mississippi. Economic losses are incurred every year due to the feeding and treatment of crop pests and plant pathogens. Because it is often unclear what differentiates a pest from a pathogen, I will use the umbrella term “biotic stressor” or BST when referring to a plant pest or pathogen. BSTs employ a special set of proteins known as ‘effectors’ that function at the site of BST physical attack. Effectors dictate how the host-BST relationship will unfold. Effectors include the proteins produced by the BST that are recognized by the plant and invoke the subsequent plant immune responses to the BST. Moreover, some effectors are responsible for the successful modification of the host tissues for the survival of the pest. In this study I utilized Illumina sequencing and computational biology approaches to identify effectors within three evolutionarily diverse cotton BSTs; specifically, Lygus lineolaris (tarnished plant bug), Xanthomonas citri pv. malvacearum (Xcm) (bacterial cotton blight), and Rotylenchulus reniformis (reniform nematode). Transcripts from the Lygus lineolaris salivary gland were found to encode putative degradative proteins used for the extra-oral digestion of host tissues by the insect. Production, assembly, and comparison of a whole genome assembly of the first Xcm genome obtained from a strain isolated in the cotton producing region of the United States revealed that the cotton Xcm is similar to other reported Xcm assemblies and contains most of the proteins found in these other strains. Genome and life-stage specific transcriptome sequencing of the nematode Rotylenchulus reniformis resulted in the identification of 41,570 transcripts of which 3,033 were up-regulated in the parasitic sedentary female life-stage. These studies collectively provide insight into the mechanisms by which key cotton BSTs invade and damage cotton. Further study of the BST effectors and the plant biomolecules with which they interact should facilitate development of highly targeted mechanisms of minimizing/eliminating BST damage. Such customized BST management will increase profits for farmers and maximize resource utilization in an environmentally responsible manner.

O diguanilato cíclico (c-di-GMP) é uma molécula de sinalização intracelular que atua na regulação de importantes processos bacterianos como motilidade, formação de biofilme e virulência. As diguanilato ciclases (DGCs), contendo um domínio GGDEF ativo, catalisam a formação de c-di-GMP a partir de duas moléculas de GTP. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma doença que ataca todas as variedades e espécies de citros. O genoma de Xac codifica 31 proteínas contendo domínios GGDEF. Treze destas proteínas possuem também domínios PAS e/ou GAF, que são ubíquos domínios sensores e de sinalização. Para tentar entender melhor o papel na sinalização por c-di-GMP das interações entre domínios GGDEF e domínios PAS e/ou GAF, estudos bioquímicos e funcionais foram realizados com as proteínas XAC0610 e XAC2446. XAC0610 contém um domínio GAF, quatro domínios PAS e um domínio GGDEF conservado. Análises fenotípicas com a linhagem nocaute XacΔ0610 mostraram que XAC0610 atua na regulação da motilidade e sobrevivência de Xac ao tratamento com H2O2. Ensaios de atividade enzimática demonstraram que XAC0610 é uma DGC cataliticamente ativa, e que a mutação sítio-dirigida de um resíduo conservado de lisina (Lys759) provoca uma grande redução na atividade de DGC. Os domínios GAF e PAS de XAC0610 aparentemente não atuam como domínios sensores, entretanto são importantes para a dimerização da proteína, necessária para a obtenção de altos níveis de atividade de DGC. Além disso, várias observações sugerem que XAC0610 não é submetida à inibição alostérica pelo produto, um mecanismo regulatório comumente utilizado para o controle da atividade de DGC. Por outro lado, os dados de cinética enzimática de XAC0610HIS-35-880 revelaram um efeito de cooperatividade positiva para a ligação dos substratos, com uma constante de dissociação para a ligação da primeira molécula de GTP (K1) cerca de 3-5 vezes maior que a constante de dissociação para a ligação da segunda molécula de GTP (K2). A partir deste estudo, nós apresentamos um esquema cinético geral mais apropriado para as análises dos dados cinéticos de enzimas DGCs e propomos que a ligação cooperativa do substrato talvez possa desempenhar um importante papel na regulação in vivo da atividade de algumas DGCs, aumentando sua sensibilidade a pequenas variações nos níveis celulares de GTP. Outra proteína caracterizada neste trabalho, XAC2446 possui um domínio GAF e um domínio GGDEF que, ao contrário do domínio GGDEF de XAC0610, não deve apresentar atividade de DGC. Mesmo assim, análises funcionais mostraram que XAC2446 regula negativamente a formação de biofilme e positivamente a motilidade de Xac. Ensaios de duplo híbrido em leveduras identificaram que XAC2446 interage com XAC2897, contendo um domínio GGDEF potencialmente ativo, e XAC1185, contendo um domínio HD fosfohidrolase de (p)ppGpp. Alguns estudos indicam que altos níveis celulares de c-di-GMP e baixos níveis de (p)ppGpp podem ser necessários durante a formação de biofilme. XAC2446 talvez possa atuar como um inibidor da atividade enzimática de XAC2897 e XAC1185 e influenciar, indiretamente e antagonicamente, tanto os níveis celulares de c-di-GMP quanto de (p)ppGpp. / Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a range of functions, including cellular motility, biofilm formation and virulence. This molecule is produced from two GTP substrates by the activity of diguanylate cyclases (DGCs) containing a GGDEF domain. The phytopathogenic bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) causes citrus canker in a wide variety of citrus species. The Xac genome codes for 31 proteins with GGDEF domains. Thirteen of the 31 Xac GGDEF domain-containing proteins also possess PAS (Per-Arnt-Sim) or GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA) domains that are ubiquitous signaling and sensory domains. In order to better understand the relationship between these commonly associated domains, biochemical and functional studies were carried out with the XAC0610 and XAC2446 proteins. XAC0610 is a large multi-domain protein containing one GAF domain, four PAS domains and one GGDEF domain. This protein has a demonstrable in vivo and in vitro diguanylate cyclase (DGC) activity. Analysis of a XacΔ0610 knockout strain revealed that XAC0610 plays a role in the regulation of Xac motility and resistance to H2O2. Site-directed mutagenesis of a conserved DGC lysine residue (Lys759 in XAC0610) resulted in a severe reduction in XAC0610 DGC activity. XAC0610 DGC activity was also impaired by removal of the N-terminal GAF and PAS domains, which are probably needed for proper protein dimerization. Furthermore, experimental and in silico analysis suggest that XAC0610 is not subject to allosteric product inhibition, a common regulatory mechanism for DGC activity control. Instead, steady-state kinetics of XAC0610 DGC activity revealed a positive cooperative effect of the GTP substrate with a dissociation constant for the binding of the first GTP molecule (K1) approximately three to five times greater than the dissociation constant for the binding of the second GTP molecule (K2). We present a general kinetics scheme that should be used when analyzing DGC kinetics data and propose that cooperative GTP binding could be a common, though up to now overlooked, feature of these enzymes that may in some cases offer a physiologically relevant mechanism for regulation of DGC activity in vivo. The other characterized protein, XAC2446, has a GAF domain and a degenerated GGDEF domain. Unlike XAC0610, XAC2446 should not present DGC activity. Nevertheless, functional analysis of XAC2446 demonstrated that it plays a role in the regulation of Xac motility and biofilm formation. A yeast two-hybrid screen identifies XAC2897 (a potentially active GGDEF domain-containing protein) and XAC1185 (a (p)ppGpp hydrolase) as specific binding partners of the XAC2446 protein. As indicated by studies in other bacteria, high cellular levels of c-di-GMP and low levels of (p)ppGpp may be both required for biofilm formation. It is possible that XAC2446 might have a role in the antagonistic regulation of c-di-GMP and (p)ppGpp cellular levels by acting as an inhibitor of both XAC2897 and XAC1185 enzymatic activities.

O diguanilato cíclico (c-di-GMP) é uma molécula de sinalização intracelular que atua na regulação de importantes processos bacterianos como motilidade, formação de biofilme e virulência. As diguanilato ciclases (DGCs), contendo um domínio GGDEF ativo, catalisam a formação de c-di-GMP a partir de duas moléculas de GTP. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma doença que ataca todas as variedades e espécies de citros. O genoma de Xac codifica 31 proteínas contendo domínios GGDEF. Treze destas proteínas possuem também domínios PAS e/ou GAF, que são ubíquos domínios sensores e de sinalização. Para tentar entender melhor o papel na sinalização por c-di-GMP das interações entre domínios GGDEF e domínios PAS e/ou GAF, estudos bioquímicos e funcionais foram realizados com as proteínas XAC0610 e XAC2446. XAC0610 contém um domínio GAF, quatro domínios PAS e um domínio GGDEF conservado. Análises fenotípicas com a linhagem nocaute XacΔ0610 mostraram que XAC0610 atua na regulação da motilidade e sobrevivência de Xac ao tratamento com H2O2. Ensaios de atividade enzimática demonstraram que XAC0610 é uma DGC cataliticamente ativa, e que a mutação sítio-dirigida de um resíduo conservado de lisina (Lys759) provoca uma grande redução na atividade de DGC. Os domínios GAF e PAS de XAC0610 aparentemente não atuam como domínios sensores, entretanto são importantes para a dimerização da proteína, necessária para a obtenção de altos níveis de atividade de DGC. Além disso, várias observações sugerem que XAC0610 não é submetida à inibição alostérica pelo produto, um mecanismo regulatório comumente utilizado para o controle da atividade de DGC. Por outro lado, os dados de cinética enzimática de XAC0610HIS-35-880 revelaram um efeito de cooperatividade positiva para a ligação dos substratos, com uma constante de dissociação para a ligação da primeira molécula de GTP (K1) cerca de 3-5 vezes maior que a constante de dissociação para a ligação da segunda molécula de GTP (K2). A partir deste estudo, nós apresentamos um esquema cinético geral mais apropriado para as análises dos dados cinéticos de enzimas DGCs e propomos que a ligação cooperativa do substrato talvez possa desempenhar um importante papel na regulação in vivo da atividade de algumas DGCs, aumentando sua sensibilidade a pequenas variações nos níveis celulares de GTP. Outra proteína caracterizada neste trabalho, XAC2446 possui um domínio GAF e um domínio GGDEF que, ao contrário do domínio GGDEF de XAC0610, não deve apresentar atividade de DGC. Mesmo assim, análises funcionais mostraram que XAC2446 regula negativamente a formação de biofilme e positivamente a motilidade de Xac. Ensaios de duplo híbrido em leveduras identificaram que XAC2446 interage com XAC2897, contendo um domínio GGDEF potencialmente ativo, e XAC1185, contendo um domínio HD fosfohidrolase de (p)ppGpp. Alguns estudos indicam que altos níveis celulares de c-di-GMP e baixos níveis de (p)ppGpp podem ser necessários durante a formação de biofilme. XAC2446 talvez possa atuar como um inibidor da atividade enzimática de XAC2897 e XAC1185 e influenciar, indiretamente e antagonicamente, tanto os níveis celulares de c-di-GMP quanto de (p)ppGpp. / Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a range of functions, including cellular motility, biofilm formation and virulence. This molecule is produced from two GTP substrates by the activity of diguanylate cyclases (DGCs) containing a GGDEF domain. The phytopathogenic bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) causes citrus canker in a wide variety of citrus species. The Xac genome codes for 31 proteins with GGDEF domains. Thirteen of the 31 Xac GGDEF domain-containing proteins also possess PAS (Per-Arnt-Sim) or GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA) domains that are ubiquitous signaling and sensory domains. In order to better understand the relationship between these commonly associated domains, biochemical and functional studies were carried out with the XAC0610 and XAC2446 proteins. XAC0610 is a large multi-domain protein containing one GAF domain, four PAS domains and one GGDEF domain. This protein has a demonstrable in vivo and in vitro diguanylate cyclase (DGC) activity. Analysis of a XacΔ0610 knockout strain revealed that XAC0610 plays a role in the regulation of Xac motility and resistance to H2O2. Site-directed mutagenesis of a conserved DGC lysine residue (Lys759 in XAC0610) resulted in a severe reduction in XAC0610 DGC activity. XAC0610 DGC activity was also impaired by removal of the N-terminal GAF and PAS domains, which are probably needed for proper protein dimerization. Furthermore, experimental and in silico analysis suggest that XAC0610 is not subject to allosteric product inhibition, a common regulatory mechanism for DGC activity control. Instead, steady-state kinetics of XAC0610 DGC activity revealed a positive cooperative effect of the GTP substrate with a dissociation constant for the binding of the first GTP molecule (K1) approximately three to five times greater than the dissociation constant for the binding of the second GTP molecule (K2). We present a general kinetics scheme that should be used when analyzing DGC kinetics data and propose that cooperative GTP binding could be a common, though up to now overlooked, feature of these enzymes that may in some cases offer a physiologically relevant mechanism for regulation of DGC activity in vivo. The other characterized protein, XAC2446, has a GAF domain and a degenerated GGDEF domain. Unlike XAC0610, XAC2446 should not present DGC activity. Nevertheless, functional analysis of XAC2446 demonstrated that it plays a role in the regulation of Xac motility and biofilm formation. A yeast two-hybrid screen identifies XAC2897 (a potentially active GGDEF domain-containing protein) and XAC1185 (a (p)ppGpp hydrolase) as specific binding partners of the XAC2446 protein. As indicated by studies in other bacteria, high cellular levels of c-di-GMP and low levels of (p)ppGpp may be both required for biofilm formation. It is possible that XAC2446 might have a role in the antagonistic regulation of c-di-GMP and (p)ppGpp cellular levels by acting as an inhibitor of both XAC2897 and XAC1185 enzymatic activities.

A habilidade de sensoriar o ambiente extracelular e responder às suas mudanças é inerente para a maioria das bactérias. As concentrações de nutrientes direcionam os processos metabólicos relacionados à sobrevivência e proliferação. O fosfato inorgânico (Pi) é um dos nutrientes cuja regulação, sensoriamento e sinalização são bastante conservados em bactéria. Um dos mecanismos de captação do íon fosfato com alta afinidade é o sistema Pst, um transportador do tipo ABC (ATP-Binding Cassette) , localizado na membrana interna das células. Este transportador, juntamente com as proteínas PhoR/PhoB que formam um sistema de dois componentes (Two-Component Regulatory System) , são capazes de sensoriar e monitorar os níveis deste íon nas células. Ambos os sistemas pertencem ao chamado regulon Pho, conjunto de genes envolvidos no transporte, captação e metabolização do fosfato. Estudos tem mostrado que a interação entre os sistema Pst e o sistema doiscomponentes PhoR/PhoB é mediada pela proteína PhoU, um regulador negativo cujo gene encontra-se no mesmo operon do transportador. Apesar de muito estudados em Escherichia coli , poucas informações existem sobre as características destes sistemas em Xanthomonas citri subsp. citri , bactéria responsável pelo cancro cítrico e de grande importância econômica para o país. Estudos realizados pelo nosso grupo mostraram que X. citri conserva a maioria dos genes descritos como pertencentes ao regulon Pho, incluindo o sistema Pst, as proteínas PhoR/PhoB e PhoU. Este trabalho, portanto, tem como objetivos, a caracterização funcional e estrutural da proteína PhoU de X. citri e a análise da possível interação de PhoU com a proteína PhoR, a histidina quinase do sistema dois componentes. Para tal, as proteínas foram expressas em linhagens de E. coli Tuner e purificadas por cromatografia de afinidade a metal, seguida de exclusão molecular. Visando a caracterização biofísica e estrutural da proteína PhoU, foram realizados ensaios de dicroísmo circular, cristalização, análises de bioinformática e modelagem molecular. Os resultados de bioinformática mostraram que PhoU conserva características estruturais e funcionais quando comparada com ortólogos. Após sua purificação, a proteína foi produzida na sua forma enovelada e mostrou interação com ligantes, conforme descrito na literatura para ortólogos. A expressão da proteína PhoR também foi obtida e ensaios de pull-down foram realizados para a caracterização da interação entre PhoU-PhoR. Adicionalmente, foram realizados estudos de expressão das proteínas em diferentes condições de cultivo, utilizando-se anticorpos policlonais anti-PhoU e anti-PhoR. Os resultados apresentados neste projeto são de grande importância uma vez que se obteve a padronização dos processos de produção de ambas as proteínas e ensaios biofísicos e estruturais para a futura caracterização do complexo, o que será de grande relevância para a compreensão do papel destes sistemas na fisiologia da bactéria. / The ability to sensor the extracellular environment and respond to its changes is inherent to most bacteria. Nutrient concentrations direct metabolic processes related to survival and proliferation. Inorganic phosphate (Pi) is one of the nutrients whose regulation, sensing and signalling are quite preserved in bacteria. One of the mechanisms for phosphate ion uptake with high affinity is the Pst system, composed by an ABC transporter (ATP-Binding Cassette), located on the inner membrane of the cells. This transporter, along with the PhoR/PhoB proteins, which form a Two Component Regulatory System, are capable of sensing and monitoring the levels of phosphate in cells. Both systems belong to the called regulon Pho, set of genes involved in phosphate transport, uptake and metabolism. Studies have shown that the interaction between the Pst system and the two component PhoR/PhoB system is mediated by the PhoU protein, a negative regulator, whose gene is located in the same operon of Pst system. Although much studied in Escherichia coli , there are few information about of these systems in Xanthomonas citri subsp. citri , the major causative of citric canker. Studies conducted by our group showed that X. citri conserves most of the genes described as belonging to regulon Pho, including the Pst system, the proteins PhoR/PhoB and PhoU. This work, therefore, aimed at performing functional and structural characterization of the X. citri PhoU protein and analyzing the possible interaction of PhoU with the PhoR protein, the histidine kinase of the Two Component System. For this, the proteins were expressed in E. coli Tuner strains and purified by metal affinity chromatography, followed by size exclusion chromatography. Aiming at the biophysical and structural characterization of the PhoU protein, we performed circular dichroism, crystallization, bioinformatics and molecular modeling. The results of bioinformatics showed that PhoU retains structural and functional characteristics when compared with orthologs. After purification, the protein was produced in its folded form and showed interaction with ligands, as described in the literature for orthologs. Expression of the PhoR protein was also obtained and Pull Down assays were performed for the characterization of the interaction between PhoUPhoR. In addition, protein expression studies were carried out under different culture conditions using polyclonal anti-PhoU and anti-PhoR antibodies. The results presented in this project are of great importance, once the standardization of the production processes of both proteins has been obtained, as well as biophysical and structural information. These information will be important for future characterization of the complex, which will be of great relevance for the understanding of the role of these systems in the physiology of bacteria.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-23Bitstream added on 2014-06-13T19:23:56Z : No. of bitstreams: 1 rosa_j_dr_jabo.pdf: 2608907 bytes, checksum: b7b01ebc553dff94742210a39847a17e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundecitrus / A distribuição espacial do cancro cítrico em talhões com laranjeira ‘Natal’ enxertada em limoeiro ‘Cravo’ com 3 anos de idade foi estudada utilizando a geoestatística. Foram utilizados 13 talhões mapeados pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), com 595 ou 1080 plantas cada, infectados naturalmente com Xanthomonas citri subsp. citri, em uma única propriedade, no Estado de São Paulo. A severidade da doença em cada planta foi avaliada por meio de uma escala com os seguintes níveis: 0 - sem folhas com sintomas; 1 - de 1 a 5 folhas com sintomas; 2 - de 6 a 10 folhas com sintomas; 3 - de 11 a 20 folhas com sintomas; 4 - de 21 a 50 folhas com sintomas e 5 - > 50 folhas com sintomas. Nestes talhões, as coordenadas correspondentes à posição das plantas contaminadas foram obtidas com um GPS, permitindo mapear a doença no talhão. A distribuição espacial foi avaliada por ajuste de semivariogramas e interpolação dos dados por krigagem. A distribuição de plantas com cancro cítrico no talhão mostrou-se agregada, com raio de agregação de 30 a 45 m. Os mapas de krigagem mostraram que os focos da doença ocorreram mais frequentemente nos limites dos talhões. Quando a nota média de severidade da doença foi menor que 0,04, o semivariograma apresentou efeito pepita puro, indicando que não houve dependência espacial / The spatial distribution of citrus canker in areas with orange 'Natal' grafted on ‘Rangpur’ lime with three years of age were studied using geostatistics. We used 13 plots mapped by Fundecitrus (Citrus Defense Fund), with 595 or 1080 individual plants, naturally infected with Xanthomonas citri subsp. citri that were on the same property in the State of São Paulo. Disease severity in each plant was assessed using a scale with the following levels: 0 - no leaf with symptoms, 1 – 1 - 5 leaves with symptoms; 2 – 6 -10 leaves with symptoms; 3 – 11 - 20 leaves with symptoms; 4 – 21 - 50 leaves with symptoms and 5 - > 50 leaves with symptoms. In these plots, the coordinates corresponding to the position of symptomatic of infected plants was obtained with a GPS, allowing mapping the symptomatic plants in the block. The spatial distribution was evaluated by fitting of semivariograms and kriging interpolation of the data. The distribution of plants with citrus canker in the block was aggregated, with aggregate radius of 30 - 45 meters. Kriging maps showed that the foci of diseased plants stood on the edge of the blocks. When the average grade of severity was less than 0.04, the semivariogram showed pure nugget effect, indicating that no spatial dependence

O pilus tipo IV (T4P) são finos e flexíveis filamentos encontrados na superfície de uma ampla gama de bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e archaea. O T4P desempenha um rol crucial no estilo de vida bacteriano ao estar envolvido em uma variedade de funções incluindo motilidade, aderência, formação de biofilme, patogenicidade, transformação natural e na infecção por fagos. Várias das proteínas requeridas para a biossíntese e regulação do T4P se estendem através do periplasma conectado a membrana interna e externa. O T4P são estruturas dinâmicas que sofrem ciclos de extensão e retração energizados por duas ATPases associadas com a membrana interna bacteriana. Durante a extensão, PilB, a ATPase de biossíntese do T4P, estimula a polimerização do pilus a partir de monômeros de pilinas localizados na membrana interna, através de um mecanismo ainda desconhecido. Duas proteínas, FimX e PilZ estão envolvidas na regulação da biossíntese do T4P via interações com PilB e nocautes de esses genes acabam com a biogênese e função do T4P. Neste trabalho, nós determinamos a estrutura cristalográfica do complexo binário formado pelo domínio N-terminal de PilB (PilBNt, resíduos 12-163) e a PilZ com uma resolução de 1.7 Å. As interações entre PilB e PilZ envolve uma superfície hidrofóbica formada por aminoácidos altamente conservados na família não canônica de domínios PilZ. Mutações ou deleções de alguns destes resíduos em PilZ enfraquecem a interação PilB-PilZ e afeta a função do T4P. Nós também observamos que esta interação induz mudanças conformacionais no domínio PilBNt, revelando a possibilidade de um rearranjo estrutural funcionalmente relevante da região Nterminal de PilB permitindo a sua interação com PilM, conectando a ATPase PilB como a maquinaria do T4P. Nós mostramos que PilB, PilZ e FimX podem formar um complexo ternário estável com uma massa molar aparente de ~600 kDa, sugerindo uma estequiometria de 6PilB:6PilZ:2FimX. Também observamos que FimX incrementa a atividade ATPase do complexo PilB-PilZ. O c-di-GMP e o ATPγS (um análogo não hidrolisável do ATP) induz mudanças conformacionais em FimX e no complexo PilB-PilZ, respectivamente, e estabiliza o complexo ternário PilB-PilZ-FimX. Além disso, PilB, PilZ e FimX localizam em um dos polos da célula (polo líder) em células de X. citri e a localização polar dirige a orientação da motilidade twitching. Finalmente, o T4P é necessário para a exitosa infecção de X. citri pelo fago ΦXacm4-11. Nossos resultados sugerem que asinterações entre PilB-PilZ-FimX estariam envolvidas na regulação da função de PilB, onde sinais especificas sentidas pelos domínios de FimX seriam transmitidas por PilZ até PilB. / Bacterial type IV pili (T4P) are thin and flexible filaments found on the surface of a wide range of Gram-negative bacteria and play a crucial role in their lifestyles due to their involvement in a variety of functions including motility, adherence, biofilm formation, pathogenicity, natural transformation and phage infection. Several proteins required for the biogenesis and regulation of T4P span the periplasm connecting both the inner and outer membranes. T4P are dynamic structures that undergo cycles of extension and retraction powered by two hexameric ATPases associated with the bacterial inner membrane. During extensions, the T4P assembly ATPase PilB stimulates the polymerization of pilin monomers from the inner membrane, though the precise mechanism is unknown. Two proteins, FimX and PilZ are involved in the regulation of T4P biogenesis via interactions with the PilB and knockouts of these proteins abolish T4P biogenesis. Here, we determined the crystal structure of the binary complex made up of the PilB N-terminal domain (PilBNt, residues 12- 163) bound to PilZ at 1.7Å resolution. PilZ interactions with PilB involve a hydrophobic surface made up of amino acids conserved in a non-canonical family of PilZ domains. Mutations or deletion of some these amino acids in PilZ weaken the PilZ-PilB interaction and affect T4P function. This interaction induces significant conformational changes in the PilBNt domain, suggesting that structural rearrangements of the PilB N-terminal domains could be important for its interaction with PilM, connecting the ATPase PilB with T4P machinery. We show also that full-length PilB, PilZ and FimX can form a stable ternary complex with apparent molecular weight of ~600 kDa, suggestive of a 6PilB:6PilZ:2FimX stoichiometry and that FimX increases the ATPase activity of the PilB PilZ complex. C-diGMP and ATPγS (non-hydrolysable analog of ATP) induce conformational changes in FimX and in PilB-PilZ, respectively, and stabilize the ternary PilB-PilZ-FimX complex. In addition, we show that PilB, PilZ and FimX localize at one cell pole (leading pole) that drives the movement in X. citri. Finally, the T4P is necessary for successful infection of X. citri cells by phage ΦXacm4-11. Our results suggest how FimXPilZPilB interactions could be involved in the regulation of PilB function, where specific environmental signals sensed by FimX domains could be transmitted via PilZ to PilB.

Segundos mensageiros nucleotídicos são amplamente utilizados por bactérias para se adaptar às mudanças ambientais e fisiológicas. Neste cenário destaca-se o c-di-GMP, um segundo mensageiro praticamente universal em bactérias responsável por controlar a transição do estilo de vida bacteriano. Em geral, altos níveis celulares de c-di-GMP promovem um estado séssil, de formação de biofilme, enquanto baixos níveis induzem a motilidade. Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, possui uma complexa regulação da sinalização de c-di-GMP, possuindo mais de 30 proteínas envolvidas na síntese, na degradação e na detecção deste segundo mensageiro. Dentre essas proteínas, destacam-se as que possuem os domínios de síntese e degradação presentes na mesma cadeia polipetídica, os domínios GGDEF e EAL respectivamente. A análise das estruturas primárias das 11 proteínas GGDEF-EAL codificadas pelo genoma de Xac revelou que a maior parte delas (6) provavelmente possui o domínio GGDEF inativo, enquanto o EAL é ativo. Três possivelmente possuem ambos os domínios ativos enquanto outras duas possuem ambos os domínios inativos. O nocaute do gene xac2382 que codifica uma dessas proteínas (que possui um domínio periplasmático seguido dos domínios citoplasmáticos HAMP-GGDEF-EAL), demonstra um aumento de motilidade e uma diminuição na formação de biofilme. Construções de fragmentos da proteína revelaram que XAC2382 necessita pelo menos dos domínios HAMP-GGDEF para complementar a cepa nocaute e que a atividade de diguanilato ciclase é essencial para isto. O domínio periplasmático de XAC2382 se mostrou interagir com XAC2383, uma proteína codificada por um gene presente no mesmo cluster do gene de XAC2382, e essa interação parece importante para o controle da motilidade de Xac. A estrutura de XAC2383 foi resolvida por cristalografia de raios X na qual foi revelada uma topologia típica de proteínas da família das periplasmic binding proteins (PBPs) possuindo ainda uma cavidade carregada positivamente contendo um motivo Ser-Thr-Ser (amnioácidos 152-154) importante para a ligação de compostos com grupos fosfatos ou fosfonatos. A mutação sítio dirigida nesse motivo aboliu os efeitos na motilidade dependentes dessa proteína. Esses resultados sugerem que XAC2383 é um sensor periplasmático de um composto eletronegativo e esta proteína interage com XAC2382 regulando a motilidade bacteriana. XAC0495, uma proteína com ambos os domínios GGDEF-EAL provavelmente inativos, pode fazer parte de um sistema de dois componentes com a histidina quinase XAC0494. XAC0495 se comporta como um monômero em solução e possui um formato alongado, como revelado por experimentos de SAXS. / Nucleotide based second messengers are widely used by bacteria in signaling pathways that mediate adaptations to environmental and physiological changes. c-di-GMP is a nucleotide second messenger ubiquitous in Gram-negative bacteria, where it plays a role in many important behaviors that define bacterial lifestyle. In general, high cellular levels of c-di-GMP promote biofilm formation, while low levels induce bacterial motility. Xanthomonas citri subsp. Citri (Xac), a pathogen of great economic importance in Brazil, has a complex repertoire of c-di-GMP signaling molecules, with more than 30 genes coding for proteins involved in the synthesis, degradation and detection of this second messenger. Among these proteins, many have both GGDEF and EAL domains (often associated with c-di-GMP synthesis and degradation, respectively) present in the same polypeptide chain. Analysis of the primary structure of 11 GGDEF-EAL proteins coded by the Xac genome revealed that six most likely possess an inactive GGDEF domain plus an active EALdomain. Another three proteins have both domains active while the other two have both domains inactive. The knockout of the xac2382 gene, coding for a protein which contains a periplasmic domain followed by cytoplasmic HAMP, GGDEF (active) and EAL (active) domains, shows an increase in motility and a decrease in biofilm formation. Constructions containing fragments of this protein revealed that constructs containing at least the HAMP and GGDEF domains are able to complement the knockout strain and that diguanilate cyclase activity is essential for this. The XAC2382 periplasmic domain was shown to interact with a protein encoded by a gene situated in the same cluster, XAC2383, and that this interaction seems crucial for the control of Xac motility. The structure of XAC2383 was solved by X-ray crystallography and was shown to adopt a topology typical of the periplasmic binding proteins (PBP) family. The protein possesses a positively charged groove that contains a Ser-Thr-Ser motif (152STS154) important for the binding of compounds with phosphate or phosphonate groups. Site-directed mutagenesis of this motif abolished the effects on motility caused by this protein. These results suggest that XAC2383 is a periplasmic protein responsible for sensing a compound with electronegative characteristics and which interacts with XAC2382, thereby regulating the bacterial motility. Another protein, XAC0495 (with both GGDEF-EAL domains probably inactive) may be part of a two-component system with the histidine kinase XAC0494. Small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments reveal that XAC0495 exists as an elongated monomer in solution.

Bacteria use specialized systems, called secretion systems, in order to translocate substrates to the environment or to other cells, or even to uptake molecules from the exterior environment. Six different secretion systems have been described in Gram-negative bacteria. The Type IV Secretion System (T4SS) is involved in translocation of virulence factors, bacterial conjugation, uptake and release of DNA, and in the secretion of antibacterial toxins. The T4SS channel corresponds to a toroidal upramolecular complex consisting of 14 repetitions of the VirB7-VirB9-VirB10 heterotrimer. This channel, also called \"core complex\", is divided in two layers, an outer layer consisting of the VirB7 lipoprotein in complex with the C-terminal domains of VirB9 (VirB9CT) and VirB10 (VirB10CT), and an inner layer composed by the N-terminal domains of VirB9 (VirB9NT) and VirB10 (VirB10NT). Xanthomonas citri pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterium that infects citrus plants causing a disease called \"citrus canker\". Although not directly involved in causing the disease, the chromosomally encoded T4SS is responsible for the secretion of toxins, working as a bacterial killing machine (Souza et al., 2015). The three-dimensional structure of Xac\'s VirB7 obtained by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy (PDB 2L4W) revealed that, unlike the canonical VirB7, Xac\'s VirB7 consists of a flexible N-terminal domain followed by a C-terminal globular domain. The flexible N-terminal tail is involved in interaction with VirB9CT. In this thesis, the NMR structure of the complex formed between VirB9CT and a peptide derived from the N-terminal tail of Xac-VirB7 (VirB7NT) was solved. This complex is stabilized by hydrophobic interactions involving the side chains of particular amino acid residues such as Phe30, Trp34 and Val37 in VirB7, and Arg250, Tyr167 and Tyr169 in VirB9. Mutations of such amino acids affect not only the stability of the VirB9:VirB7 complex in vitro, but also reduce the T4SS activity and impairs its assembly in vivo. Furthermore, the ability of forming VirB7:VirB7 oligomers is essential for a functional T4SS, although it is not required for assembling the complex. The structural propensity and flexibility of a fragment derived from the proline-rich region (PRR) of the N-terminal tail of VirB10 (VirB10NT - residues 85 to 182) were studied. Measurements of the {1H}-15N heteronuclear NOE showed that VirB10NT is highly flexible on a sub-nanosecond time scale. Analysis of chemical shifts and NOEs showed that the ensemble and time average conformation of VirB10NT consists of a short alpha helix between residues 151-163, and that this helix is involved in interactions with VirB9NT. These findings provide the first compelling evidence for the interaction between the N-terminal domains of VirB9 and VirB10, and for the existence of significant flexibility within Xacs T4SS. / Bactérias usam sistemas especializados, denominados sistemas de secreção, a fim de translocar substratos para o ambiente ou para outras células, ou até mesmo para capturar moléculas do meio externo. Seis diferentes sistemas de secreção foram descritos em bactérias gram-negativas. O Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS) está envolvido na translocação de fatores de virulência, conjugação bacteriana, absorção e liberação de DNA, e secreção de toxinas antibacterianas. O canal do T4SS (core complex) corresponde a um complexo formado por 14 repetições do heterotrimero VirB7-VirB9-VirB10. A camada externa deste canal é constituída por VirB7 em complexo com os domínios C-terminal de VirB9 (VirB9CT) e VirB10 (VirB10CT). Os domínios N-terminal de VirB9 (VirB9NT) e VirB10 (VirB10NT) formam a camada interna do core complex. Xanthomonas citri pv. citri (Xac) é uma bactéria gram-negativa que infecta plantas cítricas causando uma doença chamada \"cancro cítrico\". Embora não esteja diretamente envolvido na infecção, o T4SS cromossomal secreta toxinas capazes de matar outras bactérias gram-negativas. VirB7 de Xac possui uma cauda N-terminal flexível e um domínio globular C-terminal ausente em outras proteínas VirB7. VirB7 interage com VirB9CT através de sua cauda N-terminal. Nesta tese, a estrutura de RMN do complexo formado por VirB9CT e um peptídeo derivado do segmento N-terminal de VirB7 foi resolvida. O complexo é estabilizado, principalmente, por interações hidrofóbicas envolvendo as cadeias laterais de determinados resíduos de aminoácidos, particularmente a Phe30, o Trp34 e a Val37 em VirB7 e a Arg250, a Tyr167 e a Tyr169 em VirB9. A substituição de alguns destes aminoácidos por alanina afeta não só a constante de dissociação do complexo in vitro, como também a atividade e a montagem do T4SS in vivo. Além disso, resíduos específicos envolvidos em oligomerização de VirB7 são essenciais para a manutenção de um T4SS funcional, embora não sejam essenciais para a montagem do sistema. Estudos estruturais, de dinâmica e de interações de um fragmento derivado da região rica em prolinas (proline-rich region - PRR) contida no N-terminal de VirB10 (VirB10NT - resíduos 85-182) também foram realizados. Medidas de {1H}-15N NOE heteronuclear mostraram que VirB10NT é altamente flexível. Análises de deslocamentos químicos e NOEs mostrou que VirB10NT forma uma hélice curta entre os resíduos 151-163. Ensaios de interação por RMN indicaram que esta hélice está envolvida em interações com VirB9NT. Estes resultados são a primeira evidência convincente para a especificidade de interação entre os domínios N-terminal de VirB9 e VirB10. Estes dados apontam também para a existência de flexibilidade dentro do T4SS de Xac.

Segundos mensageiros nucleotídicos são amplamente utilizados por bactérias para se adaptar às mudanças ambientais e fisiológicas. Neste cenário destaca-se o c-di-GMP, um segundo mensageiro praticamente universal em bactérias responsável por controlar a transição do estilo de vida bacteriano. Em geral, altos níveis celulares de c-di-GMP promovem um estado séssil, de formação de biofilme, enquanto baixos níveis induzem a motilidade. Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, possui uma complexa regulação da sinalização de c-di-GMP, possuindo mais de 30 proteínas envolvidas na síntese, na degradação e na detecção deste segundo mensageiro. Dentre essas proteínas, destacam-se as que possuem os domínios de síntese e degradação presentes na mesma cadeia polipetídica, os domínios GGDEF e EAL respectivamente. A análise das estruturas primárias das 11 proteínas GGDEF-EAL codificadas pelo genoma de Xac revelou que a maior parte delas (6) provavelmente possui o domínio GGDEF inativo, enquanto o EAL é ativo. Três possivelmente possuem ambos os domínios ativos enquanto outras duas possuem ambos os domínios inativos. O nocaute do gene xac2382 que codifica uma dessas proteínas (que possui um domínio periplasmático seguido dos domínios citoplasmáticos HAMP-GGDEF-EAL), demonstra um aumento de motilidade e uma diminuição na formação de biofilme. Construções de fragmentos da proteína revelaram que XAC2382 necessita pelo menos dos domínios HAMP-GGDEF para complementar a cepa nocaute e que a atividade de diguanilato ciclase é essencial para isto. O domínio periplasmático de XAC2382 se mostrou interagir com XAC2383, uma proteína codificada por um gene presente no mesmo cluster do gene de XAC2382, e essa interação parece importante para o controle da motilidade de Xac. A estrutura de XAC2383 foi resolvida por cristalografia de raios X na qual foi revelada uma topologia típica de proteínas da família das periplasmic binding proteins (PBPs) possuindo ainda uma cavidade carregada positivamente contendo um motivo Ser-Thr-Ser (amnioácidos 152-154) importante para a ligação de compostos com grupos fosfatos ou fosfonatos. A mutação sítio dirigida nesse motivo aboliu os efeitos na motilidade dependentes dessa proteína. Esses resultados sugerem que XAC2383 é um sensor periplasmático de um composto eletronegativo e esta proteína interage com XAC2382 regulando a motilidade bacteriana. XAC0495, uma proteína com ambos os domínios GGDEF-EAL provavelmente inativos, pode fazer parte de um sistema de dois componentes com a histidina quinase XAC0494. XAC0495 se comporta como um monômero em solução e possui um formato alongado, como revelado por experimentos de SAXS. / Nucleotide based second messengers are widely used by bacteria in signaling pathways that mediate adaptations to environmental and physiological changes. c-di-GMP is a nucleotide second messenger ubiquitous in Gram-negative bacteria, where it plays a role in many important behaviors that define bacterial lifestyle. In general, high cellular levels of c-di-GMP promote biofilm formation, while low levels induce bacterial motility. Xanthomonas citri subsp. Citri (Xac), a pathogen of great economic importance in Brazil, has a complex repertoire of c-di-GMP signaling molecules, with more than 30 genes coding for proteins involved in the synthesis, degradation and detection of this second messenger. Among these proteins, many have both GGDEF and EAL domains (often associated with c-di-GMP synthesis and degradation, respectively) present in the same polypeptide chain. Analysis of the primary structure of 11 GGDEF-EAL proteins coded by the Xac genome revealed that six most likely possess an inactive GGDEF domain plus an active EALdomain. Another three proteins have both domains active while the other two have both domains inactive. The knockout of the xac2382 gene, coding for a protein which contains a periplasmic domain followed by cytoplasmic HAMP, GGDEF (active) and EAL (active) domains, shows an increase in motility and a decrease in biofilm formation. Constructions containing fragments of this protein revealed that constructs containing at least the HAMP and GGDEF domains are able to complement the knockout strain and that diguanilate cyclase activity is essential for this. The XAC2382 periplasmic domain was shown to interact with a protein encoded by a gene situated in the same cluster, XAC2383, and that this interaction seems crucial for the control of Xac motility. The structure of XAC2383 was solved by X-ray crystallography and was shown to adopt a topology typical of the periplasmic binding proteins (PBP) family. The protein possesses a positively charged groove that contains a Ser-Thr-Ser motif (152STS154) important for the binding of compounds with phosphate or phosphonate groups. Site-directed mutagenesis of this motif abolished the effects on motility caused by this protein. These results suggest that XAC2383 is a periplasmic protein responsible for sensing a compound with electronegative characteristics and which interacts with XAC2382, thereby regulating the bacterial motility. Another protein, XAC0495 (with both GGDEF-EAL domains probably inactive) may be part of a two-component system with the histidine kinase XAC0494. Small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments reveal that XAC0495 exists as an elongated monomer in solution.