Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1945153 bytes, checksum: 2c1abc7e6111c3fc75af32ff4400e496 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From Xylopia langsdorfiana A. St-Hil. & Tul. stem bark was isolated the diterpene of trachylobane class, ent-7α-hydroxytrachyloban-18-oic acid (trachylobane-318) that in previous studies showed to be able to relax guinea-pig trachea pre-contracted by carbachol (CCh). Thus, we aimed to investigate the action mechanism underlying in this trachylobane-318 relaxant activity. Trachea rings were suspended in organ baths, containing Kreb s solution, at 37 ºC and aired with carbogenic mixture. Isometric contractions were registered using a digital acquisition system. In order to evaluate a direct effect of the diterpene in Ca2+-calmodulin complex was used chlorpromazine (CPZ) (10-6 M), a calmodulin inhibitor, and we observed that trachylobane-318 relaxation effect (pD2 = 4.38 ± 0.07, n = 5) was not significantly altered in presence of this inhibitor (pD2 = 4.25 ± 0.07, n = 5). Then, was performed a protocol using different potassium (K+) extracellular concentrations which indicated that trachylobane-318 would be acting as a possible potassium channels activator since its relaxation was more potent when guinea-pig trachea was pre-contracted by KCl 18 mM (pD2 = 4.90 ± 0.25, n = 5) than by KCl 60 mM (pD2 = 3.88 ± 0.01, n = 5). To confirm the potassium channels participation was used a non-selective potassium channels blocker, tetraethylammonium (TEA+) 10 mM, that was pre-incubated before CCh addition, that resulted in an attenuation of diterpene relaxation (pD2 = 4.01 ± 0.06, n = 5). To determinate which potassium channels subtypes would be involved in the trachylobane-318 action, the diterpene relaxation curve was assessed in the presence of several potassium channels selective blockers. The fact of the trachylobane-318 relaxation curve was shifted to the right in a significant manner in the presence of 4-AP, a selective blocker of voltage activated K+ channels (Kv) (pD2 = 4.00 ± 0.06, n = 5); glibenclamide, a selective blocker of ATP-sensitive K+ channel (KATP) (pD2 = 3.91 ± 0.003, n = 5); apamin, a selective blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) (3.45 ± 0.14, n = 5) and big conductance calcium-activated K+ channels (BKCa) (3,80 ± 0,05, n = 5) is suggestive that the diterpene is modulating positively these channels to exert its relaxant effect. On the other hand, the inwardly rectifying K+ channels (Kir) was discarded since the relaxation curve was not altered (pD2 = 4.15 ± 0.10, n = 5) in the presence of BaCl2, selective blocker of these channels. Cyclic nucleotides participation was discarded since the relaxation curve obtained with aminophylline on guinea-pig contracted by CCh (pD2 = 4.27 ± 0.09, n = 5), a phosphodiesterases (PDEs) non-selective inhibitor, was not altered in trachylobane-318 presence (pD2 = 4.46 ± 0.08, n = 5). Thus, trachylobane-318 relaxant effect seems to involve the positive modulation of potassium channels subtypes Kv, KATP, SKCa and BKCa on guinea pig trachea. / A partir das cascas do caule de Xylopia langsdorfiana A. St-Hil. & Tul. foi isolado o diterpeno da classe dos traquilobanos, ent-7α-hidroxitraquiloban-18-oico (traquilobano-318) que em estudos anteriores mostrou-se capaz de relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol (CCh). Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação envolvido nesta atividade relaxante do traquilobano-318. Os anéis de traqueia foram suspensos em cubas para órgão isolado, contendo solução de Krebs, a 37º C e aerados com carbogênio. As contrações isométricas foram registradas com o auxílio de um sistema de aquisição digital. Para avaliar uma possível ação direta do diterpeno sobre o complexo Ca2+-calmodulina foi utilizado a clorpromazina (CPZ) (10-6 M), um inibidor da calmodulina, e observou-se que o efeito relaxante do traquilobano-318 (pD2 = 4,38 ± 0,07, n = 5) não foi significantemente alterado na presença deste inibidor (pD2 = 4,25 ± 0,07, n = 5). Em seguida foi realizado um protocolo usando diferentes concentrações extracelulares de potássio (K+) que indicaram que o traquilobano-318 estaria agindo como um possível ativador dos canais de K+, uma vez que seu efeito relaxante mostrou-se mais potente quando a traqueia era pré-contraída por 18 mM de KCl (pD2 = 4,90 ± 0,25, n = 5) do que quando pré-contraída por 60 mM de KCl (pD2 = 3,88 ± 0,01, n = 5). Para confirmar a participação dos canais de K+ utilizou-se um bloqueador não seletivo destes canais, tetraetilamônio (TEA+) (10 mM) que foi pré-incubado antes da adição de CCh, o que resultou na atenuação do relaxamento promovido pelo diterpeno (pD2 = 4,01 ± 0,06, n = 5). Com o objetivo de se determinar quais subtipos de canais de potássio estariam envolvidos na ação relaxante do traquilobano-318, a curva de relaxamento do diterpeno foi avaliada na presença de vários bloqueadores seletivos destes canais. O fato da curva de relaxamento do traquilobano-318 (pD2 = 4,38 ± 0,07) ter sido desviada para direita, de maneira significante, na presença de 4-AP, bloqueador dos canais de K+ sensíveis a voltagem (Kv) (pD2 = 3,91 ± 0,003); glibenclamida, bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP) (pD2 = 4,00 ± 0,06); apamina, bloqueador dos canais de K+ ativados pelo cálcio de pequena condutância (SKCa) (pD2 = 3,45 ± 0,14) e na presença de iberiotoxina, bloqueador dos canais de K+ ativados pelo cálcio de grande condutância (BKCa) (pD2 = 3,80 ± 0,05) sugere que o diterpeno está modulando positivamente estes canais para exercer seu efeito relaxante. Por outro lado a participação dos canais de potássio retificadores de entrada (Kir) foi descartada pois a curva de relaxamento do traquilobano-318 não foi alterada (pD2 = 4,15 ± 0,10, n = 5) na presença do BaCl2, bloqueador seletivos destes canais. A participação dos nucleotídios cíclicos foi descartada, uma vez que a curva de relaxamento em traqueia pré-contraída por CCh obtida com aminofilina (pD2 = 4,27 ± 0,09, n = 5), um inibidor não seletivo das fosfodiesterases (PDEs), não foi alterada na presença do traquilobano-318 (pD2 = 4,46 ± 0,08, n = 5). Assim, o efeito relaxante do traquilobano-318 parece envolver a modulação positiva dos subtipos de canais de potássio KATP, Kv, SKCa e BKCa em traqueia isolada de cobaia.

Made available in DSpace on 2015-05-08T15:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1953357 bytes, checksum: 23121995cc00993662a60006ebf50ffe (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), popularly known as pimenteria da terra , was isolated the diterpene ent-7-α-acetoxytrachyloban-18-oic acid (trachylobane-360) from which it was made a structural modification in which the acetoxy group was substituted by hydroxy generating the ent-7a-hidroxitrachyloban-18-oic acid (trachylobane-318). How there are some reports that show spasmolytic activity of some diterpenes, we aimed to investigate this activity on male rat aorta, rat uterus, guinea-pig trachea and ileum. On rat aorta and rat uterus nor trachylobane-360 or its derivative trachylobane-318 promoted significant spasmolytic effect until the concentration of 10-4 M. However on guinea-pig trachea, only the derivative relaxed this organ pre-contracted with carbachol (CCh) in the presence (EC50 = 3.3 0.9 ± 0.4 x 10-5 M) and absence (EC50 = 3.5 ± x 10-5 M) of functional epithelium, in a equipotent manner, suggesting a possible direct effect on tracheal smooth muscle and that the structural modification was essential for the relaxant effect in this organ. On the other hand, on guinea pig ileum, both diterpenes inhibited the phasic contractions induced by CCh or histamine. When the ileum was pre-contracted with KCl, CCh or histamine, the diterpenes induced relaxation and this effect is not by competitive antagonism of histamine, which was confirmed by the shifted of the cumulative curves to histamine to the right, in a non-parallel manner with reduction of the maximal effect (Emax). How the tonic component of contraction induced by KCl, CCh or histamine is maintained mainly by the opening of CaV, we hypothesized that the trachylobanes could be acting on these channels. The hypothesis was confirmed with the observation that both diterpenes antagonized the CaCl2-induced contractions in depolarizing Ca2+-free solution also relaxed the ileum pre-contracted by S-(-) Bay K 8644, an Cav1 agonist (EC50 = 3.5 ± 0.7 x 10-5 e 5.5 ± 0.3 x 10-5 M, respectively) confirming that the Cav subtype involved is the L-type (Cav1.2). To investigate the involvement of K+ channels to the effect of diterpenes as observed that the relaxation curves of trachylobane-360 (EC50 = 0.5 ± 0.04 x 10-4 M) and trachylobane-318 (EC50 = 2.0 ± 0.5 x 10-5 M) were significantly shifted to the right in the presence of 5 mM TEA+, a non-selective channel blocker for K+, suggesting involvement of these channels in the effects of diterpenes. The effect of trachylobane-360 appears to involve the subtypes of K+ channels (KATP, SKCa, Kv and BKCa,) since the CE50 have not changed in the presence of blockers of these channels. Interestingly the effect of trachylobane-318 appears to involve the activation of the channel type KATP, Kv and SKCa but not BKCa, evidenced by shifts from the relaxation curves to the right in the presence of K+ channels blockers as glibenclamide, apamin and 4-AP, respectively. These results all together suggest that the structural change was essential for these differentiated effects, but not for the involvement of the cyclic nucleotides pathway, since that in the presence of aminophylline the relaxation curves of trachylobanes were not modified. Both diterpenes reduce the intensity of fluorescence on intestinal myocytes of guinea-pig ileum stimulated by histamine which reflect reduction of [Ca2+]c, what would explain the spasmolytic effects of these diterpenes in functional level. / Das cascas do caule da Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), conhecida popularmente como pimenteira da terra foi isolado o diterpeno ácido ent-7a-acetoxitraquiloban-18-óico (traquilobano-360) que sofreu uma modificação estrutural do grupo acetoxi pelo hidroxi gerando o ácido ent-7a-hidroxitraquiloban-18-óico (traquilobano-318). O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo de uma possível atividade espasmolítica dos diterpenos em aorta de rato, útero de rata, traquéia e íleo de cobaia. Foram realizadas medidas de contrações isotônicas e isométricas e do cálcio citosólico. Em aorta de rato e útero de rata nenhum dos diterpenos promoveu efeito espasmolítico significante até a concentração de 10-4 M. Já em traquéia de cobaia, apenas o traquilobano-318 relaxou este órgão pré-contraído com carbacol (CCh) na presença e na ausência de epitélio funcional, de maneira equipotente, sugerindo um possível efeito direto no músculo liso traqueal e que a modificação estrutural foi essencial para o efeito relaxante neste órgão. Por outro lado, em íleo de cobaia, ambos os diterpenos inibiram as contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina. No íleo pré-contraído com KCl, CCh ou histamina os diterpenos induziram relaxamento e este efeito não se dá por antagonismo competitivo dos receptores histaminérgicos, o que foi confirmado pelo desvio das curvas cumulativas induzidas pela histamina para a direita com redução dos Emax. Como o componente tônico da contração induzida por KCl, CCh ou histamina é mantido principalmente pela abertura dos CaV, hipotetizou-se que os traquilobanos poderiam estar agindo sobre estes canais. Hipótese confirmada com a observação de que ambos diterpenos antagonizaram as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante sem Ca2+ além de relaxarem o íleo pré-contraído por S-(-) Bay K 8644, agonista dos Cav1 (CE50 = 3,5 ± 0,7 x 10-5 e 5,5 ± 0,3 x 10-5 M, respectivamente) confirmando assim que o subtipo de Cav envolvido é o Cav1.2. Para investigar a participação dos canais para K+ no efeito dos diterpenos, observou-se que as curvas de relaxamento do traquilobano-360 (CE50 = 0,5 ± 0,04 x 10 -4 M) e do traquilobano-318 (CE50 = 2,0 ± 0,5 x 10-5 M) foram significantemente desviadas para a direita na presença de 5 mM de TEA+, bloqueador não seletivo dos canais para K+, sugerindo a participação destes canais no efeito dos diterpenos. O efeito do traquilobano-360 parece não envolver os subtipos de canais para K+ (KATP, SKCa, Kv e BKCa,) uma vez que o relaxamento não foi alterado na presença dos bloqueadores destes canais. Entretanto, o efeito do traquilobano-318 parece envolver a ativação dos canais do tipo KATP, SKCa e Kv mas não dos BKCa, fato este evidenciado pelos desvios da curva de relaxamento para direita na presença dos bloqueadores de canais para K+ como glibenclamida, apamina e 4-AP, respectivamente. Estes resultados sugerem que a modificação estrutural foi essencial para esses efeitos diferenciados, mas não para o envolvimento da via dos nucleotídios cíclicos, uma vez que na presença da aminofilina as curvas de relaxamento dos traquilobanos não foram alteradas. Os dois diterpenos reduziram a intensidade de fluorescência em miócitos intestinais de íleo de cobaia estimulados por histamina em conseqüência da redução da [Ca2+]c, o que explica os efeitos espasmolíticos destes diterpenos em nível funcional.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1953353 bytes, checksum: 1474e81c59d80eee12bba062027ce9d3 (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), popularly known as pimenteria da terra , was isolated the diterpene ent-7-α-acetoxytrachyloban-18-oic acid (trachylobane-360) from which it was made a structural modification in which the acetoxy group was substituted by hydroxy generating the ent-7a-hidroxitrachyloban-18-oic acid (trachylobane-318). How there are some reports that show spasmolytic activity of some diterpenes, we aimed to investigate this activity on male rat aorta, rat uterus, guinea-pig trachea and ileum. On rat aorta and rat uterus nor trachylobane-360 or its derivative trachylobane-318 promoted significant spasmolytic effect until the concentration of 10-4 M. However on guinea-pig trachea, only the derivative relaxed this organ pre-contracted with carbachol (CCh) in the presence (EC50 = 3.3 0.9 ± 0.4 x 10-5 M) and absence (EC50 = 3.5 x 10-5 M) of functional epithelium, in a equipotent manner, suggesting a possible direct effect on tracheal smooth muscle and that the structural modification was essential for the relaxant effect in this organ. On the other hand, on guinea pig ileum, both diterpenes inhibited the phasic contractions induced by CCh or histamine. When the ileum was pre-contracted with KCl, CCh or histamine, the diterpenes induced relaxation and this effect is not by competitive antagonism of histamine, which was confirmed by the shifted of the cumulative curves to histamine to the right, in a non-parallel manner with reduction of the maximal effect (Emax). How the tonic component of contraction induced by KCl, CCh or histamine is maintained mainly by the opening of CaV, we hypothesized that the trachylobanes could be acting on these channels. The hypothesis was confirmed with the observation that both diterpenes antagonized the CaCl2-induced contractions in depolarizing Ca2+-free solution also relaxed the ileum pre-contracted by S-(-) Bay K 8644, an Cav1 agonist (EC50 = 3.5 ± 0.7 x 10-5 e 5.5 ± 0.3 x 10-5 M, respectively) confirming that the Cav subtype involved is the L-type (Cav1.2). To investigate the involvement of K+ channels to the effect of diterpenes as observed that the relaxation curves of trachylobane-360 (EC50 = 0.5 ± 0.04 x 10-4 M) and trachylobane-318 (EC50 = 2.0 ± 0.5 x 10-5 M) were significantly shifted to the right in the presence of 5 mM TEA+, a non-selective channel blocker for K+, suggesting involvement of these channels in the effects of diterpenes. The effect of trachylobane-360 appears to involve the subtypes of K+ channels (KATP, SKCa, Kv and BKCa,) since the CE50 have not changed in the presence of blockers of these channels. Interestingly the effect of trachylobane-318 appears to involve the activation of the channel type KATP, Kv and SKCa but not BKCa, evidenced by shifts from the relaxation curves to the right in the presence of K+ channels blockers as glibenclamide, apamin and 4-AP, respectively. These results all together suggest that the structural change was essential for these differentiated effects, but not for the involvement of the cyclic nucleotides pathway, since that in the presence of aminophylline the relaxation curves of trachylobanes were not modified. Both diterpenes reduce the intensity of fluorescence on intestinal myocytes of guinea-pig ileum stimulated by histamine which reflect reduction of [Ca2+]c, what would explain the spasmolytic effects of these diterpenes in functional level. / Das cascas do caule da Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), conhecida popularmente como pimenteira da terra foi isolado o diterpeno ácido ent-7-acetoxitraquiloban-18-óico (traquilobano-360) que sofreu uma modificação estrutural do grupo acetoxi pelo hidroxi gerando o ácido ent-7a-hidroxitraquiloban-18-óico (traquilobano-318). O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo de uma possível atividade espasmolítica dos diterpenos em aorta de rato, útero de rata, traquéia e íleo de cobaia. Foram realizadas medidas de contrações isotônicas e isométricas e do cálcio citosólico. Em aorta de rato e útero de rata nenhum dos diterpenos promoveu efeito espasmolítico significante até a concentração de 10-4 M. Já em traquéia de cobaia, apenas o traquilobano-318 relaxou este órgão pré-contraído com carbacol (CCh) na presença e na ausência de epitélio funcional, de maneira equipotente, sugerindo um possível efeito direto no músculo liso traqueal e que a modificação estrutural foi essencial para o efeito relaxante neste órgão. Por outro lado, em íleo de cobaia, ambos os diterpenos inibiram as contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina. No íleo pré-contraído com KCl, CCh ou histamina os diterpenos induziram relaxamento e este efeito não se dá por antagonismo competitivo dos receptores histaminérgicos, o que foi confirmado pelo desvio das curvas cumulativas induzidas pela histamina para a direita com redução dos Emax. Como o componente tônico da contração induzida por KCl, CCh ou histamina é mantido principalmente pela abertura dos CaV, hipotetizou-se que os traquilobanos poderiam estar agindo sobre estes canais. Hipótese confirmada com a observação de que ambos diterpenos antagonizaram as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante sem Ca2+ além de relaxarem o íleo pré-contraído por S-(-) Bay K 8644, agonista dos Cav1 (CE50 = 3,5 ± 0,7 x 10-5 e 5,5 ± 0,3 x 10-5 M, respectivamente) confirmando assim que o subtipo de Cav envolvido é o Cav1.2. Para investigar a participação dos canais para K+ no efeito dos diterpenos, observou-se que as curvas de relaxamento do traquilobano-360 (CE50 = 0,5 ± 0,04 x 10 -4 M) e do traquilobano-318 (CE50 = 2,0 ± 0,5 x 10-5 M) foram significantemente desviadas para a direita na presença de 5 mM de TEA+, bloqueador não seletivo dos canais para K+, sugerindo a participação destes canais no efeito dos diterpenos. O efeito do traquilobano-360 parece não envolver os subtipos de canais para K+ (KATP, SKCa, Kv e BKCa,) uma vez que o relaxamento não foi alterado na presença dos bloqueadores destes canais. Entretanto, o efeito do traquilobano-318 parece envolver a ativação dos canais do tipo KATP, SKCa e Kv mas não dos BKCa, fato este evidenciado pelos desvios da curva de relaxamento para direita na presença dos bloqueadores de canais para K+ como glibenclamida, apamina e 4-AP, respectivamente. Estes resultados sugerem que a modificação estrutural foi essencial para esses efeitos diferenciados, mas não para o envolvimento da via dos nucleotídios cíclicos, uma vez que na presença da aminofilina as curvas de relaxamento dos traquilobanos não foram alteradas. Os dois diterpenos reduziram a intensidade de fluorescência em miócitos intestinais de íleo de cobaia estimulados por histamina em conseqüência da redução da [Ca2+]c, o que explica os efeitos espasmolíticos destes diterpenos em nível funcional.