Die Muscle-RING-finger (MuRF) Proteine sind E3-Ubiquitin-Ligasen, die im Muskelgewebe den Ubiquitin-Proteasom-System abhängigen Abbau von Proteinen vermitteln. MuRF1 wird in der Muskelatrophie verstärkt synthetisiert, was zu einem gesteigerten Proteinabbau und damit zum Verlust von Muskelmasse führt. Zudem sind Mäuse, denen MuRF1 fehlt vor Muskelatrophie geschützt. E3-Ubiquitin-Ligasen fungieren oftmals in Multiproteinkomplexen. Dies wurde für MuRF-Proteine bisher nicht gezeigt. Aufgrund dessen sollten neue MuRF-Multiproteinkomplex assoziierte Faktoren mittels Hefe-Zwei-Hybrid-System und SILAC AP-MS identifiziert und deren Einfluss auf die MuRF-Funktion charakterisiert werden. Es wurden sowohl neue als auch publizierte MuRF-Interaktionspartner (Iap) gefunden. Von den neu entdeckten MuRF-Iap wurde der Fokus auf WDR42A gelegt, da das Protein mit beiden Methoden identifiziert wurde und zudem funktionell hoch interessant ist. WDR42A homologe Proteine bilden zirkuläre β-Propeller Strukturen die Multiproteinkomplexe koordinieren. Die Interaktion zwischen MuRF-Proteinen und WDR42A wurde mittels Ko-IP Experimenten und Kolokalisationsstudien bestätigt. Cycloheximid-Abbau-Experimente deuten darauf hin, dass WDR42A kein MuRF1 Substrat-Protein ist. Da die MuRF-Proteine spezifisch im Muskel hergestellt werden, sollte überprüft werden ob WDR42A ebenfalls im Muskelgewebe synthetisiert wird. Es wurde gezeigt, dass WDR42A ubiquitär sowie im Muskelgewebe und in immortalisierten Muskelzellen hergestellt wird. Analog zu MuRF1 wird WDR42A in der Denervations-induzierten Skelettmuskelatrophie und der Muskelentwicklung verstärkt synthetisiert. Die Herunterregulation von WDR42A mittels siRNA in C2C12 Myotuben schützte diese Zellen vor dem Auftreten von Atrophie. Diese Ergebnisse zeigen, dass WDR42A wie MuRF1 an der Entstehung von Muskelatrophie beteiligt ist. Aufgrund der WDR42A Domänenstruktur wird vermutet, dass WDR42A als Scaffolding-Protein MuRF1-Multiproteinkomplexe reguliert. / The muscle-RING-finger (MuRF) proteins are E3 ubiquitin ligases which coordinate the ubiquitin-proteasome system dependent protein degradation in muscle tissue. MuRF1 is up-regulated under muscle atrophy conditions. This leads to enhanced proteolysis and thereby to loss of muscle mass and strength. Furthermore are MuRF1 knockout mice resistant to muscle atrophy. E3 ubiquitin ligases often operate in multi-protein complexes. This has not been shown for MuRF proteins. Therefore we used yeast-two-hybrid and SILAC-AP-MS to identify and subsequently characterize new MuRF multi-protein complex associated proteins. We found new and also published MuRF interaction partners (Iap) with both methods. Amongst the new Iap, we focused on WDR42A, because it was found with both techniques and his interesting functional potential. WDR42A exhibits seven consecutive arranged WD40-repeat domains. This domain arrangement leads in homologues proteins to the formation of seven-bladed β-propeller structures, which act as protein interaction platforms that coordinate multi-protein complexes. The protein interaction between the MuRFs and WDR42A was confirmed with Co-IP and co-localization experiments. Cycloheximide decay experiments indicated that WDR42A is not a MuRF1 substrate protein. The MuRF proteins are muscle specific, therefore we tested if WDR42A is also synthetized in muscle tissue. We could show that WDR42A is ubiquitously, but also in muscle tissue as well as in immortalized muscle cells produced. WDR42A is similar to MuRF1 up-regulated under denervation-induced skeletal muscle atrophy as well as in muscle development. Furthermore are C2C12 myotubes resistant to muscle atrophy after siRNA down-regulation of WDR42A. These results demonstrate that WDR42A is like MuRF1 important for the development of muscle atrophy. Due to the domain structure of WDR42A, we hypothesize that WDR42A regulates MuRF1 multi protein complexes as scaffolding protein.

Hintergrund und Zielsetzung: DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie im Kindesalter und bis heute unheilbar. Sie wird durch das Fehlen des Proteins Dystrophin verursacht, welches verschiedene Signaltransduktionswege beeinflusst. Das Anliegen der Arbeit ist die Untersuchung und Modulation von Signaltransduktionswegen, die als alternative Therapiestrategie den Verlust von Dystrophin kompensieren könnten. Experimentelle Strategie: Für die Charakterisierung von Dystrophin nachgeschalteten Prozessen wurden mRNA-Expressionsanalysen in Muskelgeweben von DMD-Patienten und einem DMD-Brüderpaar mit einem infrafamiliär unterschiedlichen Verlauf der DMD durchgeführt. Aus diesen Expressionsdaten wurde erstmalig ein Petri-Netz entwickelt, welches Dystrophin mit in diesem Zusammenhang bisher unbekannten Signaltransduktionswegen verknüpft. Das Petri-Netz wurde auf Netzwerkintegrität und –verhalten mittels Invarianten- (INA) und theoretischen Knockout- (Mauritius Maps) Analysen untersucht. Durch beide Methoden läßt sich der maßgebliche Teilsignalweg bestimmen. In diesem Signalweg wurden die Proteinaktivität und die Genexpression durch siRNA, Vektor-DNA und chemische Substanzen in humanen SkMCs moduliert. Anschließend wurden die Proliferation und die Vitalität der Zellen sowie auch die Expression auf mRNA- und Protein-Niveau untersucht. Ergebnisse: RAP2B und CSNK1A1 waren in dem DMD-Brüderpaar differentiell exprimiert und konnten erstmalig in einem neuen, komplexen Signalweg in Zusammenhang mit Dystrophin nachgeschalteten Prozessen dargestellt werden. Mittelpunkt dieses Signalweges ist die De- und Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFATc. Seine Zielgene umfassen neben anderen den negativen Proliferationsfaktor p21, das Dystrophin homologe UTRN und den Differenzierungsfaktor MYF5. Folglich würde ein Anstieg von UTRN eine unerwünschte Reduktion der Proliferationsrate von Myoblasten implizieren. Letzteres konnte bereits nachgewiesen werden und stellte das Motiv für weitere Studien dar. Jedoch zeigten siRNA- und Vektor-DNA-Experimente, daß NFATc nicht der ausschlaggebende Faktor für diese Zielgene ist. Die Substanzen Deflazacort (DFZ) und Cyclosporin A (CsA) wurden dagegen beschrieben, die Aktivierung von NFATc zu beeinflussen. Die Ergebnisse zeigten, daß beide Substanzen die Proliferation von Myoblasten erhöhen können. Die gleichzeitige Applikation von DFZ und CsA führte zu einem Anstieg der UTRN-Expression. Schlußfolgerung: Die Modulation der Proliferation und UTRN-Expression ist unabhängig von einander möglich. Entsprechend der Grundidee der Arbeit zeichnet sich eine neue Therapiestrategie ab, welche Dystrophin nachgeschaltete Prozesse einbezieht. / Background and aim: DMD is the most common muscular dystrophy in childhood and incurable to date. It is caused by the absence of dystrophin, what influences several signal transduction pathways. The thesis is interested in the investigation and modulation of signal transduction pathways that may compensate the lack of dystrophin as an alternative therapy strategy. Experimental strategy: To study Dystrophin downstream pathways the mRNA expression of DMD patients and two DMD siblings with an intra-familially different course of DMD were analysed in muscle tissue. On the basis of these expression data a Petri net was first developed implicating signal transduction pathways and Dystrophin downstream cascades. Invariant (INA) and theoretical knockout (Mauritius Maps) analyses were applied for studying network integrity and behaviour. Both methods provide information about the most relevant part of the network. In this part modulation of protein activity and of gene expression using siRNA, vector-DNA, and chemical substances were performed on human SkMCs. Subsequently, the cells were studied by proliferation and vitality tests as well as expression analyses at mRNA and protein level. Results: RAP2B and CSNK1A1 were differently expressed in two DMD siblings, and first are part of a signal transduction pathway implicating Dystrophin downstream processes. The central point of this pathway is the de- and activation of the transcription factor NFATc. Its target genes are, among others, the negative proliferation factor p21, the Dystrophin homologue UTRN, and the differentiation factor MYF5. Consequently, an increase in UTRN implicates an undesirably reduced myoblast proliferation rate. Latter was found in DMD patients and was target for further studies. But, siRNA and vector DNA experiments showed that NFATc is not the decisive factor for the target genes. Deflazacort and cyclosporin A are known to influence the activation of NFATc. The results first showed that both substances do induce myoblast proliferation. The use of deflazacort in combination with cyclosporin A resulted in an increase of UTRN expression. Conclusion: The modulation of proliferation and UTRN-expression independently of each other is possible. According to the basic idea of this study, a new therapeutic strategy becomes apparent, which considers Dystrophin downstream processes.

Die Komposition der Skelettmuskulatur resultiert aus der fein abgestimmten Balance von Proteinauf- und Abbaumechanismen. Die Skelettmuskelatrophie kann in verschiedenen Situationen entstehen bzw. von diversen Krankheiten ausgelöst werden (Altern, Hunger, Krebs, Nervenschädigung, Kachexie) und ist meist die Folge von gesteigertem Proteinabbau, der die Proteinsynthese überwiegt. Der Muskelabbau ist physiologisch teilweise sinnvoll und dient der Notversorgung von lebenswichtigen Organen mit Lipiden, Aminosäuren und Glukose. Insgesamt ist eine funktionsfähige Muskulatur sehr wichtig, sowohl für Gesunde als auch Erkrankte, da bei Muskelatrophie auslösenden Erkrankungen das Gesamtüberleben wesentlich verringert ist und die Lebensqualität der Patienten enorm reduziert ist. Der Abbau von strukturellen Muskelproteinen wurde hauptsächlich dem Ubiquitin-Proteasom System zugeschrieben, dessen Regulation und von seinen einzelnen Enzymen muss genauestens verstanden sein, um in der Zukunft zielgerichtete Therapien entwickeln zu können. Eines der zentralen Enzyme in der Skelett- und Herzmuskelatrophie ist die E3 Ubiquitin Ligase MuRF1. In nahezu allen Modellen für Muskelatrophie wurde eine starke Zunahme der Expression von MuRF1 beschrieben. Betrachtet man die sehr zentrale Rolle von MuRF1 im UPS, dort vermittelt MuRF1 den Abbau von strukturellen Proteinen des Sarkomers, und der beobachteten starken Regulation bei diversen Atrophie-Modellen, wird klar, wie wichtig das Verständnis der transkriptionellen Regulation von MuRF1 selbst ist. In den letzten Jahren wurden bereits einige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die an der Regulation von MuRF1 bei verschiedenen Atrophie-Modellen beteiligt sind, die Studien zeigten aber auch, dass noch nicht alle Modelle erklärt werden konnten. Um die verbleibenden Wissenslücken zu füllen, wurde in dieser Studie nach neuen transkriptionellen Regulatoren von MuRF1 gesucht und deren Beteiligung an bereits bekannten Signalwegen analysiert. / Skeletal muscle mass is permanently balanced as a result of fine tuned protein synthesis and degradation mechanisms. Skeletal muscle atrophy occurs when protein degradation exceeds protein synthesis, which happens in a variety of conditions, such as aging, starvation, cancer, cachexia or denervation. Degradation of muscle mass can sometimes be useful, e.g. as source for lipids, amino acids and glucose in case of critical malnutrition as well as several other physiological conditions. But a solid composition and thereby functional maintenance of muscles is necessary for healthy individuals as well as individuals suffering from atrophy releasing diseases as to retain their mobility and to preserve full heart functions. Since degradation of structural proteins in muscle tissue has been addressed mainly to the ubiquitin-proteasome-system, the regulation of the participating components needs to be understood in detail to develop constructive treatments and therapies for atrophy prevention. One of the key enzymes in skeletal and heart muscle atrophy is the E3 ubiquitin ligase MuRF1. Its expression levels and protein content was found to be elevated in almost every know atrophy model. MuRF1 is very critical for the muscles composition and thus their functional integrity, as it marks and initiates degradation of structural and contractile proteins via the UPS. Since MuRF1 plays a prominent role in muscle atrophy, its transcriptional regulation needs to be well understood to develop effective therapies for all the different atrophy models MuRF1 has been linked to. Several transcription factors have been identified to regulate MuRF1 at different ratios and in diverse atrophy models. Importantly, they do not explain all MuRF1 inducing events observed. To fill some of the remaining knowledge gaps, the studies aims were to find new transcriptional regulators for MuRF1 and to analyze potential involvements of the obtained candidates in pathways affecting skeletal muscle atrophy.