TonEBP, la proteína que se une al elemento regulatorio que responde a tonicidad “TonE” es el único factor transcripcional conocido de eucariontes que responde a cambios de la osmolaridad extracelular. Este factor transcripcional pertenece a la familia Rel, al igual que NFAT1-5 y NFκB. TonEBP también se conoce como NFAT5 y se ha asociado al mecanismo de adaptación celular a condiciones de hiperosmolaridad, regulando la expresión de genes que codifican para aldosa reductasa y para los transportadores de taurina, mio-inositol y betaina. Todas estas proteínas regulan los niveles de osmolitos intracelulares compatibles asociados al control del volumen celular. El corazón es un órgano que normalmente no está sujeto a cambios osmóticos excepto durante isquemia-reperfusión, coma diabético y shock séptico. La capacidad de regular el volumen celular se ha vinculado a la sobrevida celular en condiciones de estrés hiperosmótico. Por lo tanto, la capacidad de las células cardíacas de regular el volumen celular, podría ser un factor de sobrevida en patologías como el infarto al miocardio. En nuestro Laboratorio, se describió previamente que TonEBP está presente en los cardiomiocitos y que responde al estrés hiperosmótico. Además, se demostró que el estrés hiperosmótico induce la masa y la actividad de aldosa reductasa con acumulación intracelular de sorbitol, y que la muerte inducida por estrés hiperosmótico es mediada por esta enzima. La activación de TonEBP induce un aumento de los niveles y actividad de aldosa reductasa que mediaría la muerte de los cardiomiocitos inducida por estrés hiperosmótico. Sin embargo, ratones knock out para TonEBP muestran una severa atrofia de su médula renal, incremento de la sensibilidad de sus timocitos al estrés hiperosmótico e incremento de la fragmentación del DNA en células de la fibra del lente, indicando que TonEBP tendría un efecto protector frente al daño inducido por estrés hiperosmótico. Por lo tanto, de estos resultados se deduce que existiría una contradicción entre los datos descritos en la literatura y nuestros hallazgos sobre el papel de TonEBP en la sobrevida celular. La hipótesis de la presente tesis es “TonEBP media la adaptación del cardiomiocito a la hiperosmolaridad generada por isquemia cardiaca”. Los objetivos específicos son: • Caracterizar el mecanismo de muerte inducida por estrés osmótico. • Determinar si el factor de transcripción TonEBP se activa bajo condiciones de isquemia cardiaca in vivo e in vitro. • Determinar el efecto directo de TonEBP en la viabilidad del cardiomiocito. • Evaluar si TonEBP protege a los cardiomiocitos de la muerte inducida por hiperosmolaridad Como modelo experimental se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiperosmótico en presencia y en ausencia de la sobreexpresión adenoviral de TonEBP tipo silvestre (wtTonEBP) o TonEBP dominante negativo (dnTonEBP). Además se utilizaron modelos experimentales de infarto al miocardio por ligación de la arteria coronaria descendente anterior y de sobreexpresión in vivo de wtTonEBP y dnTonEBP por transducción intracardíaca de adenovirus. El estrés hiperosmótico indujo muerte de los cardiomiocitos por un mecanismo que involucra aumento entrada de Ca2+ a través de un canal de Ca2+ tipo L, aumento de los niveles citoplasmáticos y mitocondriales de Ca2+, depolarización de la mitocondria y reducción de los niveles intracelulares de ATP. Además se detectó liberación de citocromo c pero no del factor inductor de apoptosis (AIF), desde la mitocondria, con activación secuencial de procaspasa 9 y procaspasa 3. Sin embargo, se determinó que la muerte de los cardiomiocitos inducida por sorbitol 600 mOsm correspondía a una apoptosis independiente de caspasas, ya que el pretratamiento con el inhibidor general de caspasas Z VAD fmk, no previno la muerte inducida por estrés hiperosmótico. En un modelo de infarto al miocardio se detectó un aumento de los niveles proteicos de TonEBP en el sitio vecino al infarto a los 2 días post cirugía. Este mismo aumento se detectó en cultivos in vitro de cardiomiocitos sometidos a 30 o 60 min de isquemia simulada seguida de 4 u 8 h de reperfusión. Estos resultados sugieren que la isquemia induce a TonEBP. Debido a que no existen inhibidores y/o activadores farmacológicos para TonEBP se construyeron adenovirus que sobrexpresaban wtTonEBP (Ad wtTonEBP) y dnTonEBP (Ad dnTonEBP). Determinando los niveles proteicos de aldosa reductasa, un blanco transcripcional de TonEBP, se demostró que ambos adenovirus eran funcionales en cardiomiocitos. Estos experimentos demostraron que la sobreexpresión de wtTonEBP aumentó los niveles proteicos de â-actina en forma dependiente de la dosis viral mientras que disminuyó los niveles de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC). La sobreexpresión del dnTonEBP tuvo un efecto contrario al wtTonEBP en los niveles proteicos de β-actina y β-MHC. El aumento de los niveles proteicos de βctina inducida por la sobreexpresión de wtTonEBP se acompañó de una reorganización del citoesqueleto de actina, visualizada por inmunocitoquímica usando faloidina-rodamina. La sobreexpresión de wtTonEBP, pero no de dnTonEBP, indujo muerte de los cardiomiocitos, principalmente por necrosis. Los niveles de necrosis dependieron del nivel de sobreexpresión de wtTonEBP y del tiempo de transducción adenoviral. La transducción adenoviral por inoculación intracardíaca de Ad wtTonEBP y Ad dnTonEBP mostró que Ad dnTonEBP indujo mortalidad en 3 de los 8 animales transducidos, efecto que no se detectó en ratas transducidas con Ad wtTonEBP y Ad LacZ (control). Este resultado sugiere que TonEBP cumpliría alguna función importante en el corazón. Utilizando una multiplicidad de infección de 1000, dosis viral que no inducía muerte celular, se mostró que la sobreexpresión de tanto de wtTonEBP como del dnTonEBP no protegieron a los cardiomiocitos de la muerte inducida por estrés hiperosmótico. La sobreexpresión de ambas proteínas tampoco indujo un cambio en el mecanismo de muerte, apoptosis o necrosis, inducida por estrés hiperosmótico. Se determinó que la muerte inducida por sobreexpresión de wtTonEBP no dependía de la sobreactivación de aldosa reductasa, ya que un inhibidor específico de aldosa reductasa, zopolrestat, no atenuó la muerte inducida por Ad wtTonEBP. Esta muerte tampoco se asemejó al colapso metabólico detectado al someter a los cardiomiocitos a sorbitol 600 mOsm, ya que no se observó disminución de los niveles intracelulares de ATP. Finalmente, los datos obtenidos en esta tesis permiten concluir que el infarto o la isquemia/reperfusión in vitro induce a TonEBP, pero la sobreexpresión de este factor transcripción no está asociada con la protección de los cardiomiocitos al estrés hiperosmótico, sino más bien es un inductor de muerte celular por necrosis.

Memoria para optar al título de Bioquímico / El uso de elevadas dosis de testosterona produce hipertrofia cardiaca, sin embargo los mecanismos celulares no son completamente entendidos. La proteína quinasa GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) es una quinasa que regula una amplia gama de procesos celulares como la síntesis proteica y actividad de factores transcripcionales, siendo el factor nuclear de células T activadas, NFAT, uno de los más importantes. La GSK3-β ha sido descrita como el principal regulador anti-hipertrófico celular. En este trabajo se estudió si los efectos hipertróficos de la testosterona son mediados, en parte, por la actividad de la vía de transducción de señales GSK3-β/NFAT en cultivo primario de cardiomiocitos de rata neonata. Los resultados muestran que dosis de testosterona que provocan la hipertrofia del cardiomiocito (100 nM) inducen el aumento la fosforilación de GSK3-β, determinado mediante western blot. GSK3-β puede ser fosforilada a través de las vías de señalización intracelulares PI3K/Akt y ERK1/2. En nuestro laboratorio hemos descrito que la testosterona activa ambas vías. Para evaluar si estas quinasas modulan la actividad de GSK3-β se utilizaron inhibidores específicos para ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) y Akt (Akt-inhibitor-VIII). La inhibición de la PI3K o de Akt bloqueó la fosforilación de GSK3-β inducida por testosterona, mientras que la inhibición de ERK1/2 no tuvo efectos significativos, lo que sugiere que la vía PI3K/Akt está involucrada en la inhibición de la GSK3-β. El mecanismo de acción de la testosterona involucra la unión de la hormona al receptor intracelular para andrógenos (AR). Para evaluar la contribución del AR en la inhibición de la GSK3-β, los cardiomiocitos fueron pre-incubados con ciproterona, un inhibidor del AR. La inhibición del AR no provocó cambios en el aumento de la fosforilación de la GSK3-β, lo que sugiere que el AR no participa en la inhibición de la GSK3-β inducida por testosterona. Para determinar los efectos de la testosterona sobre los principales efectores río abajo de la GSK3-β se evaluó tanto el cambio en el estado de fosforilación del eIF2Bε y el cambio en la actividad de NFAT. La estimulación de los cardiomiocitos con la hormona disminuyó la fosforilación de eIF2Bε, lo que se asocia al aumento de su actividad traductora y aumento de la síntesis proteica. Además, utilizando el inhibidor específico de GSK3-β, 1-Azakenpaulona (1-Azk), se indujo la desfosforilación de eIF2Bε, lo que sugiere que la inhibición de GSK3-β modula la activación del factor eIF2Bε inducida por testosterona. Por otra parte, la testosterona aumento la actividad transcripcional de NFAT, medida como actividad luciferasa. Al estimular con testosterona cardiomiocitos tratados con diferentes dosis de 1-Azk se observa un efecto aditivo sobre la activación de NFAT-luc, lo que sugiere una relación entre la inhibición de la GSK3-β y el incremento de la actividad de NFAT inducida por testosterona. La testosterona aumentó el tamaño celular y la expresión de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC) y la α-actina esquelética (SKA), considerados como parámetros hipertróficos. El tratamiento con el inhibidor de NFAT, ciclosporina A (CsA, 1 μM), evitó el aumento en del área célula inducido por testosterona. Además, el bloqueo del receptor para IP3 inhibió el aumento de los marcadores de hipertrofia β-MHC y SKA, lo que en conjunto sugiere que la vía Cn/NFAT participaría en la hipertrofia de la célula cardiaca inducida por testosterona. Por otra parte, el uso de 1-Azk por sí sólo incrementó ambos parámetros hipertróficos, lo que sugiere que la inhibición de la GSK3-β participaría en la hipertrofia del cardiomiocito. El tratamiento en conjunto con testosterona y 1-Azk no incremento los efectos hipertróficos de la hormona, lo que se podría deber a que la célula cardiaca en cultivo primario crece hasta un límite definido. La evidencia experimental de este trabajo sugiere que la testosterona induce la inhibición de GSK3-β a través de la vía PI3K/Akt, lo que se traduce en un aumento de la actividad de NFAT y de eIF2Bε. Además, la inhibición de NFAT bloquea la hipertrofia inducida por testosterona. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la vía GSK3-β/NFAT podría participar en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por la testosterona / Elevated doses of testosterone produce cardiac hypertrophy. However, the cellular mechanisms are not fully understood. The GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) is a protein kinase that regulates several cellular processes like protein synthesis and transcription factors activity. Moreover, this kinase has been described as an anti-hypertrophic regulator. In this study we examined whether the hypertrophic effects of testosterone are mediated, in part, by GSK3-β in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes. The results from this study show that hypertrophic testosterone concentrations (100 nM) increased GSK3-β phosphorylation. GSK3-β can be phosphorylated by upstream signaling pathways as PI3K/Akt and ERK1/2. Previously, we have described that testosterone activates both signaling pathways. To evaluate the contribution of these kinases on GSK3-β activity specific inhibitors for ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) and Akt (Akt-inhibitor-VIII) were used Inhibition of either PI3K or Akt completely blocked the GSK3-β phosphorylation induced by testosterone, while inhibition of ERK1/2 had no effect, suggesting that PI3K/Akt pathway is involved in the inhibition of GSK3-β. Testosterone exerts most effects through the direct binding to specific intracellular androgen receptor (AR). To assess the contribution of AR in the GSK3-β inhibition, cardiomyocytes were prei-ncubated with cyproterone an inhibitor of AR. Inhibition of AR did not modifies testosterone-induced GSK3-β phosphorylation, suggesting that the AR is not involved in this event. To determine the effects of testosterone on the main downstream GSK3-β effectors both eIF2Bε phosphorylation and NFAT activity were determined. The hormone decreased eIF2Bε phosphorylation which is associated with translation activity and protein synthesis increase. Moreover, testosterone increased NFAT transcriptional activity, which is associated with gene expression. The specific inhibitor of GSK3-β, 1-Azakenpaullone (1-Azk), induced both eIF2Bε dephosphorylation and increase in the NFAT activity. In cardiomyocytes treated with 1-Azk, testosterone produced eIF2Bε activation and NFAT over-activation. Testosterone increased cell size and expression of β-MHC and SKA, both hypertrophic parameters. Treatment with the upstream NFAT phosphatase calcineurin (Cn) inhibitor cyclosporin A (CsA, 1 mM) prevented the cell area increase induced by testosterone. Furthermore, the IP3 receptor (IP3R) blockade inhibited the increase of β-MHC and SKA, which together suggest that the IP3R/Cn/NFAT pathway modulates the cardiac cell hypertrophy. Moreover, 1-Azk alone increased both hypertrophic parameters, showing that GSK3-β is involved in cardiomyocyte hypertrophy. The combined treatment of testosterone and 1-Azk did not increase the hypertrophic effects on cardiomyocytes, suggesting that cardiac cell grows until a defined limit. Experimental evidence of this work suggests that testosterone induces the inhibition of GSK3-β through the PI3K/Akt pathway, resulting in an increase in the activity of NFAT and eIF2Bε. Furthermore, inhibition of NFAT blocks testosterone-induced hypertrophy. Taken together, these results suggest that the GSK3-β/NFAT pathway is involved in cardiomyocyte hypertrophy induced by testosterone

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Thesis (Ph. D.)--Cornell University, May, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 154-181).

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2008. / Härtill 5 uppsatser.

El NFAT5 es un factor de transcripción de la familia Rel, la cual incluye a los NFATc y los NF-[kappa]B. Hasta ahora, el NFAT5 había sido caracterizado principalmente como un factor de respuesta a estrés osmótico ya que regula la expresión de genes osmoprotectores y citoquinas en respuesta a hipertonicidad. En este trabajo hemos identificado y caracterizado una nueva función del NFAT5, la regulación de genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activados por la vía de los receptores de tipo Toll (TLR), importantes para la respuesta inmunitaria innata y adaptativa a una amplia variedad de estímulos patogénicos. Nuestros resultados muestran que el NFAT5 es un regulador importante en la ruta de los TLR, jugando un papel en la actividad de varios miembros de esta familia de receptores, tal y como lo hacen los factores de transcripción NF[kappa]B e IRF5. / NFAT5 is a transcription factor of the Rel family, which includes NFATc and NF-[kappa]B. NFAT5 has been mainly characterized as a hypertonicity responsive factor, since it regulates the expression of osmoprotective genes and cytokines in response to osmotic stress. In this work we have identified and characterized a novel role for NFAT5, the regulation of genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activated by the Toll-like receptor pathway (TLR), important for innate and adaptive immunity responses to a wide variety of pathogenic molecules. Our results show that NFAT5 is an important transcription factor of the TLR pathway, playing a role in the activity of several members of this receptor family, like other transcription factors such as NF-[kappa]B and IRF5.

Thesis (Ph.D. in Neuroscience) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 110-125). Online version available via ProQuest Digital Dissertations.

Hintergrund und Zielsetzung: DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie im Kindesalter und bis heute unheilbar. Sie wird durch das Fehlen des Proteins Dystrophin verursacht, welches verschiedene Signaltransduktionswege beeinflusst. Das Anliegen der Arbeit ist die Untersuchung und Modulation von Signaltransduktionswegen, die als alternative Therapiestrategie den Verlust von Dystrophin kompensieren könnten. Experimentelle Strategie: Für die Charakterisierung von Dystrophin nachgeschalteten Prozessen wurden mRNA-Expressionsanalysen in Muskelgeweben von DMD-Patienten und einem DMD-Brüderpaar mit einem infrafamiliär unterschiedlichen Verlauf der DMD durchgeführt. Aus diesen Expressionsdaten wurde erstmalig ein Petri-Netz entwickelt, welches Dystrophin mit in diesem Zusammenhang bisher unbekannten Signaltransduktionswegen verknüpft. Das Petri-Netz wurde auf Netzwerkintegrität und –verhalten mittels Invarianten- (INA) und theoretischen Knockout- (Mauritius Maps) Analysen untersucht. Durch beide Methoden läßt sich der maßgebliche Teilsignalweg bestimmen. In diesem Signalweg wurden die Proteinaktivität und die Genexpression durch siRNA, Vektor-DNA und chemische Substanzen in humanen SkMCs moduliert. Anschließend wurden die Proliferation und die Vitalität der Zellen sowie auch die Expression auf mRNA- und Protein-Niveau untersucht. Ergebnisse: RAP2B und CSNK1A1 waren in dem DMD-Brüderpaar differentiell exprimiert und konnten erstmalig in einem neuen, komplexen Signalweg in Zusammenhang mit Dystrophin nachgeschalteten Prozessen dargestellt werden. Mittelpunkt dieses Signalweges ist die De- und Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFATc. Seine Zielgene umfassen neben anderen den negativen Proliferationsfaktor p21, das Dystrophin homologe UTRN und den Differenzierungsfaktor MYF5. Folglich würde ein Anstieg von UTRN eine unerwünschte Reduktion der Proliferationsrate von Myoblasten implizieren. Letzteres konnte bereits nachgewiesen werden und stellte das Motiv für weitere Studien dar. Jedoch zeigten siRNA- und Vektor-DNA-Experimente, daß NFATc nicht der ausschlaggebende Faktor für diese Zielgene ist. Die Substanzen Deflazacort (DFZ) und Cyclosporin A (CsA) wurden dagegen beschrieben, die Aktivierung von NFATc zu beeinflussen. Die Ergebnisse zeigten, daß beide Substanzen die Proliferation von Myoblasten erhöhen können. Die gleichzeitige Applikation von DFZ und CsA führte zu einem Anstieg der UTRN-Expression. Schlußfolgerung: Die Modulation der Proliferation und UTRN-Expression ist unabhängig von einander möglich. Entsprechend der Grundidee der Arbeit zeichnet sich eine neue Therapiestrategie ab, welche Dystrophin nachgeschaltete Prozesse einbezieht. / Background and aim: DMD is the most common muscular dystrophy in childhood and incurable to date. It is caused by the absence of dystrophin, what influences several signal transduction pathways. The thesis is interested in the investigation and modulation of signal transduction pathways that may compensate the lack of dystrophin as an alternative therapy strategy. Experimental strategy: To study Dystrophin downstream pathways the mRNA expression of DMD patients and two DMD siblings with an intra-familially different course of DMD were analysed in muscle tissue. On the basis of these expression data a Petri net was first developed implicating signal transduction pathways and Dystrophin downstream cascades. Invariant (INA) and theoretical knockout (Mauritius Maps) analyses were applied for studying network integrity and behaviour. Both methods provide information about the most relevant part of the network. In this part modulation of protein activity and of gene expression using siRNA, vector-DNA, and chemical substances were performed on human SkMCs. Subsequently, the cells were studied by proliferation and vitality tests as well as expression analyses at mRNA and protein level. Results: RAP2B and CSNK1A1 were differently expressed in two DMD siblings, and first are part of a signal transduction pathway implicating Dystrophin downstream processes. The central point of this pathway is the de- and activation of the transcription factor NFATc. Its target genes are, among others, the negative proliferation factor p21, the Dystrophin homologue UTRN, and the differentiation factor MYF5. Consequently, an increase in UTRN implicates an undesirably reduced myoblast proliferation rate. Latter was found in DMD patients and was target for further studies. But, siRNA and vector DNA experiments showed that NFATc is not the decisive factor for the target genes. Deflazacort and cyclosporin A are known to influence the activation of NFATc. The results first showed that both substances do induce myoblast proliferation. The use of deflazacort in combination with cyclosporin A resulted in an increase of UTRN expression. Conclusion: The modulation of proliferation and UTRN-expression independently of each other is possible. According to the basic idea of this study, a new therapeutic strategy becomes apparent, which considers Dystrophin downstream processes.