Ingeniero Civil en Biotecnología / Enfermedades como la sepsis, artritis reumatoide, tendinitis, entre otras, están ligadas a respuestas pro-inflamatorias anómalas. En ellas participan citoquinas pro-inflamatorias y factores de transcripción activados a partir de la vía de señalización mediada por receptores Tipo Toll y proteínas adaptadoras afínes. Estos receptores inician una cascada de señalización a partir de su homodimerización al ser inducidos por señales microbianas. Luego prosigue el reclutamiento de una serie de adaptadores proteicos que terminan finalmente con la transcripción de factores y producción de citoquinas proinflamatorias. En particular, este proyecto se enmarca en el estudio de las vías de señalización en las cuales está involucrado el receptor TLR4. Las enfermedades mencionadas pueden ser tratadas mediante el uso de fármacos, pero su uso resulta poco efectivo en etapas medio-avanzadas de la enfermedad y la presencia de efectos secundarios serios como osteoporosis, obesidad centrípeta, hipertensión, diabetes mellitus, entre otros. En vista de esto se plantea que la descripción de las interacciones del sistema mediado por TLR4 puede permitir diseñar nuevos tratamientos para estas enfermedades caracterizadas por respuestas inflamatorias anómalas. En función de lo anterior, se define el objetivo general de este trabajo que corresponde al estudio y reconstrucción in silico del acoplamiento e interacciones proteína-proteína producidas en la vía pro-inflamatoria activada por TLR4 y proteínas adaptadoras MAL, TRAM y MyD88. Por medio del uso de algoritmos de acoplamiento y herramientas de dinámica molecular se estudia el acoplamiento de los dominios TIR del homodímero de TLR4 y los adaptadores MAL, MyD88 y TRAM. Las interacciones propuestas son caracterizadas determinándose: área de contacto, tipos de interacciones y energía libre de los complejos. De manera adicional, se comparó los resultados con otros modelos presentados en publicaciones anteriores (Nuñez et al. (2007), Basith et al. (2011)). Los resultados obtenidos muestran que los adaptadores MAL y TRAM interactúan con el receptor TLR4 mediante la unión a la nueva superficie formada por la homodimerización de los dominios TIR de TLR4. En ambos casos, se observa que tanto MAL como TRAM se acoplan al receptor TLR4 orientando frente a frente sus lazos BB, lo que confirma la relevancia de este sector en las interacciones de esta vía. Otra zona importante de interacción corresponde al lazo CD del adaptador MAL y TRAM, el que según los resultados interactuaría con la Hélice B de TLR4. Por su parte, el estudio del complejo TLR4-MAL-MyD88, muestra que el adaptador MyD88 se une preferentemente a la nueva superficie que se produce a partir de la interacción TLR4-MAL. A partir de la estimación de la energía libre de unión vía MM-PBSA, se demuestra que los contactos y el acoplamiento de los modelos propuestos muestran estructuras de mayor estabilidad termodinámica que las presentadas por Nuñez (2007). Los resultados demuestran que zonas como los lazos BB, CD, hélice A y C son transversalmente relevantes dentro de la cadena de señalización y que presentan características generalizables al tipo de interacciones que se produce en esta vía mediada por el receptor TLR4. Finalmente, se destaca que la metodología planteada en este trabajo se transforma en un procedimiento novedoso y no descrito en trabajos anteriores relacionados a la descripción de interacciones vía TLR. Más aún, el conjunto de herramientas utilizadas permiten modelar las interacciones, probar hipótesis de interacción, brindar explicación a la acción de mutantes y encontrar sectores potenciales de interacción en cualquier tipo de sistema proteína-proteína.

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Os mecanismos imunológicos que governam a interação entre o fungo Paracoccidioides brasiliensis e o hospedeiro têm sido pouco estudados. Tanto os componentes do fungo como os receptores dos fagócitos envolvidos nesta interação são pouco conhecidos. Baseados nestes fatos, nosso trabalho teve por objetivo caracterizar in vitro e in vivo o envolvimento do receptor Toll Like-2 (TLR-2) e da proteína adaptadora MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) na infecção de camundongos pelo P. brasiliensis. O TLR-2 é um receptor da imunidade inata envolvido no reconhecimento de PAMPs (padrões moleculares associados aos patógenos), enquanto que MyD88 é uma molécula envolvida na sinalização celular induzida por muitos TLRs e que culmina com a ativação de vários fatores de transcrição, entre eles o NFB, envolvidos na ativação de genes ligados à resposta inflamatória. Para tanto, utilizamos camundongos C57Bl/6 deficientes e normais para TLR-2 e para MyD88. Demonstramos que, comparado ao grupo controle, animais TLR2-/- apresentavam uma infecção pulmonar menos grave associada com menor síntese de óxido nítrico (NO). Resultados equivalentes foram obtidos com macrófagos peritoneais e alveolares infectados in vitro. Inesperadamente, apesar das diferenças na carga fúngica, ambas as linhagens apresentavam tempo médio de sobrevida semelhante e lesões pulmonares de gravidade equivalente. Os estudos com leucócitos infiltrantes de pulmão revelaram um aumento de leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) nos animais TLR-2-/- associado com um menor número de linfócitos TCD4+ e TCD8+ ativados. Animais TLR-2-/- deficientes apresentaram uma discreta diferença quanto à síntese de citocinas pulmonares dos tipos Th1 e Th2, porém estes animais apresentaram maiores níveis de KC, uma quimiocina CXC envolvida na quimiotaxia de neutrófilos, assim com maiores níveis de citocinas Th17 (IL-6, IL-17, IL-23 e TGF-). Além disso, a resposta imune Th17 desenvolvida por animais TLR-2-/- esteve associada com menor expansão de células T regulatórias CD4+CD25+FoxP3+. Assim, o TLR-2 controla a imunidade inata e adaptativa frente ao P. brasiliensis e regula negativamente a resposta imune Th17 e a patologia pulmonar. Em relação aos estudos com animais deficientes para a proteína adaptadora MyD88 na paracoccidioimicose verificamos que sua ausência resultou numa produção deficiente in vitro e in vivo de NO, além de uma produção deficiente in vivo de citocinas do tipo Th1, Th2 e Th17. Animais MyD88-deficientes infectados desenvolveram uma resposta imune prejudicada, evidenciada pelo menor número de macrófagos ativados, assim como uma imunidade adaptativa menos eficiente, evidenciada pelo menor número de células T CD4 ativadas que afluíram aos pulmões. Este quadro culminou com uma carga fúngica maior nos pulmões dos animais MyD88- deficientes, como também permitiu uma exuberante disseminação do fungo para outros órgãos, como fígado e baço. Os pulmões e o fígado apresentaram graves lesões com a presença de granulomas coalescentes e ricos agregados fúngicos. Assim, camundongos MyD88-deficientes não foram capazes de controlar a doença e morreram em um tempo mais curto que os animais MyD88-competentes, como evidenciado em experimentos de sobrevida. Assim, nossos achados demonstram que a sinalização intracelular mediada pela proteína MyD88 é importante para a ativação dos mecanismos fungicidas, assim como para a ativação das respostas imunes inata e adaptativa contra o P. brasiliensis. Em conjunto, nosso trabalho demonstra que tanto o TLR-2 quanto a molécula adaptadora MyD88 desempenham um papel relevante no controle da infecção, assim como na indução da resposta imune contra este patógeno fúngico primário. / The immunological mechanisms that govern the interaction between hosts and the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis have been scarcely studied. Both, fungal and phagocyte receptors involved in this interaction are poorly understood. Based on these facts, the aim of our study was to characterize in vitro and in vivo the role played by Toll Like Receptor-2 (TLR-2) and the adaptor protein MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) in murine pulmonary paracoccidioidomycosis. The TLR-2 is a receptor of innate immunity involved in the recognition of PAMPs (pathogen associated molecular patterns), whereas MyD88 is a molecule involved in cell signaling induced by many TLRs . TLR-mediated activation results in the production of several nuclear transcription factors, including NFB, which activate important genes of the inflammatory response. Wild-type (WT) besides TLR- 2- and MyD88-deficient C57Bl/6 mice were used in our investigation. We showed that, compared to control animals, TLR2-/- mice developed a less severe pulmonary infection associated with reduced synthesis of nitric oxide (NO). Equivalent results were obtained with in vitro infected peritoneal and alveolar macrophages. Unexpectedly, despite the differences in fungal loads, TLR-2-/- and WT mice showed equivalent survival times and pulmonary lesions. Studies with lung infiltrating leukocytes revealed an increase of polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) in TLR-2-/- mice associated with a low number of activated T CD4 and T CD8+ lymphocytes. Compared with WT mice, the TLR-2-deficient mice showed slight differences in the production of pulmonary Th1 and Th2 cytokines, but presented higher levels of KC, a CXC chemokine involved in neutrophil chemotaxis, besides increased levels of Th17 cytokines ( IL-6, IL-17, IL-23 and TGF-). Furthermore, the prevalent Th17 immune response developed by TLR-2-/- mice was associated with lower expansion of regulatory T cells CD4+CD25+FoxP3+. Thus, TLR-2 controls the innate and adaptive immunity against the P. brasiliensis infection and negatively regulates Th17 immune response and pulmonary pathology. Studies with MyD88-deficient mice showed an impaired production of NO in vivo and in vitro, and a deficient in vivo production of Th1, Th2 and Th17 cytokines. In addition, infected MyD88-deficient mice developed an impaired immune response, evidenced by poorly activated macrophages, as well as by an inefficient adaptive immunity mediated by a diminished influx of activated CD4+ T cells to the lungs. These events led to increased fungal loads in the lungs of MyD88-deficient mice and allowed a marked dissemination of the fungus to other organs such as liver and spleen, which presented severe lesions composed by coalescent granulomas containing high numbers of fungal cells. As consequence, MyD88-deficient mice were unable to control fungal growth and presented a decreased survival time. Our findings demonstrate that MyD88 signaling is important to the activation of fungicidal mechanisms and to the induction of the innate and adaptive immunity against P. brasiliensis. Altogether, our work shows that both TLR-2 and the adapter molecule MyD88, play an important role in controlling of P. brasiliensis infection, as well as in the induction of immune responses against this primary fungal pathogen.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29 / Objetivo: avaliar a possível relação entre polimorfismos dos genes codificadores de receptor 1 de interleucina (IL) 1 (IL-1R1) (PstI, rs2234650), IL-12 (+1188, rs3212227), IL-18 (-137, rs187238), IL-18 (-607, rs1946519), receptor tipo Toll (TLR) 2 (TLR-2) (+2258, rs5743708) e TLR-4 (+896, rs4986790) e a pré-eclâmpsia (PE). Pacientes e métodos: Este estudo de caráter caso-controle incluiu 109 pacientes com PE e 174 gestantes sem patologia sistêmica ou obstétrica, e com história de duas ou mais gestações sem intercorrências, como controles. O DNA genômico foi extraído de sangue periférico por método de DTAB/CTAB, e os polimorfismos foram genotipados por técnicas de PCR-RFLP ou PCR-ARMS. Para a análise dos resultados, foram utilizados os testes t de Student e exato de Fischer, tendo sido adotado o nível de significância de p<0,05. Resultados: As freqüências genotípicas do polimorfismo do gene IL-1R1 foram 20,9% CC, 59% CT e 20,1% TT em casos de PE; e 24,7% CC, 56,2% CT e 19,1% TT em controles (p=0,82). As freqüências do polimorfismo do gene IL-12 foram 54,7% AA, 32,9% AC e 12,4% CC em casos de PE; e 55,4% AA, 33,8% AC e 10,8% CC em controles (p=0,93). As freqüências genotípicas de IL-18 (-137) foram 5,2% CC, 42,7% CG e 52,1% GG em casos de PE; e 7,6% CC, 43% CG e 49,4% GG em controles (p=0,74). As freqüências genotípicas de IL-18 (-607) foram 41% CC, 52,7% CA e 6,3% AA em pacientes com PE; e 32,2% CC, 56,2% CA e 11,6% AA no grupo controle (p=0,22). As freqüências do polimorfismo do gene TLR-2 foram 84,6% GG e 15,4% GA em casos de PE; e 84,8% GG e 15,2% GA em controles (p=0,97). As freqüências do polimorfismo do gene TLR-4 foram 93,6% AA e 6,4% AG em casos de PE; e 87,6% AA, 11,7% AG e 0,7% GG em controles (p=0,23). Não houve diferenças significantes entre os grupos, quanto às freqüências genotípicas e alélicas. Conclusões: Não foi observada associação entre polimorfismos de genes codificadores de IL- 1R1, IL-12, IL-18, TLR-2 e TLR-4 e a ocorrência de pré-eclâmpsia. / Problem: Intense maternal inflammatory response is a central event in the pathogenesis of preeclampsia (PE) Our aim was to assess a possible relation between pro-inflammatory mediators: IL-1R1, IL-12, IL-18, IL-18, TLR-2 and TLR-4 gene polymorphisms and PE. Method of Study: This case-control study included 109 patients with PE and 174 healthy women (controls). Genotyping were performed by PCR-ARMS or PCR-RFLP techniques. Data were analyzed by Student´s t or Fischer´s exact tests, and significance was set at p<0.05. Results: Genotypic and allelic distribution for all six polymorphisms was similar between the study and control groups (p=0.82 for IL-1R1, p=0.93 for IL-12, p=0.74 for IL-18 -137, p=0.22 for IL-18 -607, p=0.97 for TLR-2 and p=0.23 for TLR-4 gene polymorphisms). Conclusions: Our findings suggest that the analyzed pro-inflammatory gene polymorphisms are not associated with the occurrence of PE. Further studies have to be done to confirm these results. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Os mecanismos imunológicos que governam a interação entre o fungo Paracoccidioides brasiliensis e o hospedeiro têm sido pouco estudados. Tanto os componentes do fungo como os receptores dos fagócitos envolvidos nesta interação são pouco conhecidos. Baseados nestes fatos, nosso trabalho teve por objetivo caracterizar in vitro e in vivo o envolvimento do receptor Toll Like-2 (TLR-2) e da proteína adaptadora MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) na infecção de camundongos pelo P. brasiliensis. O TLR-2 é um receptor da imunidade inata envolvido no reconhecimento de PAMPs (padrões moleculares associados aos patógenos), enquanto que MyD88 é uma molécula envolvida na sinalização celular induzida por muitos TLRs e que culmina com a ativação de vários fatores de transcrição, entre eles o NFB, envolvidos na ativação de genes ligados à resposta inflamatória. Para tanto, utilizamos camundongos C57Bl/6 deficientes e normais para TLR-2 e para MyD88. Demonstramos que, comparado ao grupo controle, animais TLR2-/- apresentavam uma infecção pulmonar menos grave associada com menor síntese de óxido nítrico (NO). Resultados equivalentes foram obtidos com macrófagos peritoneais e alveolares infectados in vitro. Inesperadamente, apesar das diferenças na carga fúngica, ambas as linhagens apresentavam tempo médio de sobrevida semelhante e lesões pulmonares de gravidade equivalente. Os estudos com leucócitos infiltrantes de pulmão revelaram um aumento de leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) nos animais TLR-2-/- associado com um menor número de linfócitos TCD4+ e TCD8+ ativados. Animais TLR-2-/- deficientes apresentaram uma discreta diferença quanto à síntese de citocinas pulmonares dos tipos Th1 e Th2, porém estes animais apresentaram maiores níveis de KC, uma quimiocina CXC envolvida na quimiotaxia de neutrófilos, assim com maiores níveis de citocinas Th17 (IL-6, IL-17, IL-23 e TGF-). Além disso, a resposta imune Th17 desenvolvida por animais TLR-2-/- esteve associada com menor expansão de células T regulatórias CD4+CD25+FoxP3+. Assim, o TLR-2 controla a imunidade inata e adaptativa frente ao P. brasiliensis e regula negativamente a resposta imune Th17 e a patologia pulmonar. Em relação aos estudos com animais deficientes para a proteína adaptadora MyD88 na paracoccidioimicose verificamos que sua ausência resultou numa produção deficiente in vitro e in vivo de NO, além de uma produção deficiente in vivo de citocinas do tipo Th1, Th2 e Th17. Animais MyD88-deficientes infectados desenvolveram uma resposta imune prejudicada, evidenciada pelo menor número de macrófagos ativados, assim como uma imunidade adaptativa menos eficiente, evidenciada pelo menor número de células T CD4 ativadas que afluíram aos pulmões. Este quadro culminou com uma carga fúngica maior nos pulmões dos animais MyD88- deficientes, como também permitiu uma exuberante disseminação do fungo para outros órgãos, como fígado e baço. Os pulmões e o fígado apresentaram graves lesões com a presença de granulomas coalescentes e ricos agregados fúngicos. Assim, camundongos MyD88-deficientes não foram capazes de controlar a doença e morreram em um tempo mais curto que os animais MyD88-competentes, como evidenciado em experimentos de sobrevida. Assim, nossos achados demonstram que a sinalização intracelular mediada pela proteína MyD88 é importante para a ativação dos mecanismos fungicidas, assim como para a ativação das respostas imunes inata e adaptativa contra o P. brasiliensis. Em conjunto, nosso trabalho demonstra que tanto o TLR-2 quanto a molécula adaptadora MyD88 desempenham um papel relevante no controle da infecção, assim como na indução da resposta imune contra este patógeno fúngico primário. / The immunological mechanisms that govern the interaction between hosts and the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis have been scarcely studied. Both, fungal and phagocyte receptors involved in this interaction are poorly understood. Based on these facts, the aim of our study was to characterize in vitro and in vivo the role played by Toll Like Receptor-2 (TLR-2) and the adaptor protein MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) in murine pulmonary paracoccidioidomycosis. The TLR-2 is a receptor of innate immunity involved in the recognition of PAMPs (pathogen associated molecular patterns), whereas MyD88 is a molecule involved in cell signaling induced by many TLRs . TLR-mediated activation results in the production of several nuclear transcription factors, including NFB, which activate important genes of the inflammatory response. Wild-type (WT) besides TLR- 2- and MyD88-deficient C57Bl/6 mice were used in our investigation. We showed that, compared to control animals, TLR2-/- mice developed a less severe pulmonary infection associated with reduced synthesis of nitric oxide (NO). Equivalent results were obtained with in vitro infected peritoneal and alveolar macrophages. Unexpectedly, despite the differences in fungal loads, TLR-2-/- and WT mice showed equivalent survival times and pulmonary lesions. Studies with lung infiltrating leukocytes revealed an increase of polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) in TLR-2-/- mice associated with a low number of activated T CD4 and T CD8+ lymphocytes. Compared with WT mice, the TLR-2-deficient mice showed slight differences in the production of pulmonary Th1 and Th2 cytokines, but presented higher levels of KC, a CXC chemokine involved in neutrophil chemotaxis, besides increased levels of Th17 cytokines ( IL-6, IL-17, IL-23 and TGF-). Furthermore, the prevalent Th17 immune response developed by TLR-2-/- mice was associated with lower expansion of regulatory T cells CD4+CD25+FoxP3+. Thus, TLR-2 controls the innate and adaptive immunity against the P. brasiliensis infection and negatively regulates Th17 immune response and pulmonary pathology. Studies with MyD88-deficient mice showed an impaired production of NO in vivo and in vitro, and a deficient in vivo production of Th1, Th2 and Th17 cytokines. In addition, infected MyD88-deficient mice developed an impaired immune response, evidenced by poorly activated macrophages, as well as by an inefficient adaptive immunity mediated by a diminished influx of activated CD4+ T cells to the lungs. These events led to increased fungal loads in the lungs of MyD88-deficient mice and allowed a marked dissemination of the fungus to other organs such as liver and spleen, which presented severe lesions composed by coalescent granulomas containing high numbers of fungal cells. As consequence, MyD88-deficient mice were unable to control fungal growth and presented a decreased survival time. Our findings demonstrate that MyD88 signaling is important to the activation of fungicidal mechanisms and to the induction of the innate and adaptive immunity against P. brasiliensis. Altogether, our work shows that both TLR-2 and the adapter molecule MyD88, play an important role in controlling of P. brasiliensis infection, as well as in the induction of immune responses against this primary fungal pathogen.

El NFAT5 es un factor de transcripción de la familia Rel, la cual incluye a los NFATc y los NF-[kappa]B. Hasta ahora, el NFAT5 había sido caracterizado principalmente como un factor de respuesta a estrés osmótico ya que regula la expresión de genes osmoprotectores y citoquinas en respuesta a hipertonicidad. En este trabajo hemos identificado y caracterizado una nueva función del NFAT5, la regulación de genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activados por la vía de los receptores de tipo Toll (TLR), importantes para la respuesta inmunitaria innata y adaptativa a una amplia variedad de estímulos patogénicos. Nuestros resultados muestran que el NFAT5 es un regulador importante en la ruta de los TLR, jugando un papel en la actividad de varios miembros de esta familia de receptores, tal y como lo hacen los factores de transcripción NF[kappa]B e IRF5. / NFAT5 is a transcription factor of the Rel family, which includes NFATc and NF-[kappa]B. NFAT5 has been mainly characterized as a hypertonicity responsive factor, since it regulates the expression of osmoprotective genes and cytokines in response to osmotic stress. In this work we have identified and characterized a novel role for NFAT5, the regulation of genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activated by the Toll-like receptor pathway (TLR), important for innate and adaptive immunity responses to a wide variety of pathogenic molecules. Our results show that NFAT5 is an important transcription factor of the TLR pathway, playing a role in the activity of several members of this receptor family, like other transcription factors such as NF-[kappa]B and IRF5.