NFAT5 is the main regulator of an osmoprotective gene program that is switched on by osmotic stress. Hypertonicity causes a harmful increase in the intracellular concentration of inorganic ions and NFAT5-regulated genes allow the accumulation of organic osmolytes and chaperones in order to protect the cells. However, little is known about the physiopathologic tonicity thresholds that trigger NFAT5 transcriptional activity, and which signaling pathways are involved, in primary cells. We have studied the regulation of NFAT5 transcriptional activity in several types of primary cells obtained from transgenic mice carrying the 9xNFAT-Luc reporter developed by the Molkentin laboratory. Our results indicate that NFAT5 is able to respond to pathological tonicity levels in primary cells and it requires a combination of signaling mediators, some of which are more relevant in specific cell types.

La sécheresse oculaire est une pathologie fréquente qui peut impacter fortement la qualité de vie des patients. D’origine multifactorielle complexe, elle présente de nombreuses étiologies et son diagnostic est difficile en raison de présentations cliniques variées, en termes de symptômes et de tests cliniques, et en l'absence d'un marqueur spécifique. En outre, elle ne bénéficie actuellement que d’une seule molécule thérapeutique, cependant non curative, la ciclosporine. Devenant un réel problème de santé publique, la recherche visant à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à son apparition reste indispensable. L'état actuel des connaissances sur la sécheresse oculaire reconnaît à l'inflammation et à l'hyperosmolarité un rôle central. Ce travail de thèse a eu pour objectif d'étudier le comportement pro-inflammatoire des cellules conjonctivales dans un modèle in vitro classique de sécheresse oculaire induite par une hyperosmolarité saline. Nous avons ainsi montré que les cellules conjonctivales sécrètent une chimiokine pro-inflammatoire majeure, CCL2/MCP-1, et que cette induction est totalement sous la dépendance du facteur de transcription osmoprotecteur NFAT5/TonEBP ainsi que partiellement liée à la voie des MAPKs et de NFκB. Nous avons également observé que cette induction était en partie inhibée par la ciclosporine et la dexaméthasone. Nous avons ensuite complété ce travail par l'étude de l'inflammasome à la fois sur ces cellules et sur des monocytes, type cellulaire majeur ciblé par CCL2, en utilisant différents activateurs classiques dans le modèle d’hyperosmolarité. Nos résultats ont montré l’absence d’activation de l’inflammasome par l'hyperosmolarité seule. En revanche, l'hyperosmolarité aurait un rôle inhibiteur de l’inflammasome dans les monocytes. Ces résultats ouvrent des pistes nouvelles d’exploration afin de mieux comprendre les relations entre monocytes et cellules épithéliales de la conjonctive. Ils nous ont permis d'identifier le rôle incontournable de cellules épithéliales conjonctivales dans l'apparition ou le maintien de l'inflammation dans la pathologie et de caractériser certaines voies intracellulaires impliquées dans ce processus, ouvrant de nouvelles perspectives en termes de thérapeutiques. / Dry eye disease is a common condition that significantly impacts the quality of life of patients. It is a complex multifactorial disease with many etiologies and a diagnosis recognized as difficult due to the multiple clinical presentations in terms of symptoms and clinical tests, and lacking of a reliable and specific marker. There is currently only one therapeutic molecule to treat this disease, cyclosporin. However it is not curative. Dry eye disease is becoming an important public health problem and it is necessary to focus research on its underlying mechanisms, as they remain largely unknown. The current state of knowledge in dry eye disease recognizes inflammation and hyperosmolarity as central elements in the pathology. This work aimed to study the pro-inflammatory behavior of conjunctival cells in an in vitro model of dry eye disease by NaCl-induced hyperosmolarity. We showed that conjunctival cells secrete a major pro-inflammatory chemokine known as CCL2/MCP-1. This induction depends entirely on the osmoprotectant transcription factor NFAT5/TonEBP and is partially related to the MAPKs and the NFκB pathways. We showed that the process could be partially inhibited by cyclosporin and dexamethasone. We also studied the inflammasome in conjunctival cells and monocytes, the major cell type targeted by CCL2, using various classical inflammasome activators in this hyperosmolarity model. We did not observe any inflammasome activation induced by hyperosmolarity alone. On the other hand, hyperosmolarity shows signs of inhibiting inflammasome activation in monocytes. These results open new ways of understanding the relations between monocytes and conjunctival epithelial cells. They highlight the crucial role of the conjunctival epithelial cell type in the inflammation process in dry eye disease and make it possible to characterize intracellular pathways involved in this process, opening new therapeutic prospects.

Die diabetische Retinopathie (DR) gilt als häufigste chronische mikrovaskuläre Komplikation bei Diabetes mellitus sowie als häufigste Erblindungsursache bei Erwachsenen im Arbeitsalter in Industrieländern. Die diabetische Stoffwechsellage führt langfristig zu Schädigungen des Gefäßendothels, was den Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke verursachen kann. Die Entwicklung eines diabetischen Makulaödems mit Ablagerung von harten Exsudaten steht ebenfalls in engem Zusammenhang mit Sehverlusten. Die wichtigsten Risikofaktoren der DR sind eine Hyperglykämie sowie systemische Hypertonie. Hauptursache für die diabetische Degeneration der Retina ist die Aktivierung des Polyolwegs, der bei erhöhter Glukose-Konzentration vermehrt abläuft. Im ersten Schritt entsteht durch die Aktivität der Aldosereduktase (AR) aus Glukose Sorbitol, das bei diabetischer Stoffwechsellage akkumuliert und toxisch auf die Retinazellen wirkt. Im zweiten Schritt des Polyolwegs wird durch die Sorbitoldehydrogenase Sorbitol in Fruktose umgewandelt. Durch diätetische Kochsalz (NaCl)-Aufnahme erhöht sich die extrazelluläre Osmolarität und bewirkt dadurch akute Blutdruck-Erhöhungen. Bluthochdruck führt über erhöhten Blutfluss und Endothelzellschäden zur Progression der DR. Als Therapie sind derzeit Anti-VEGF-Medikamente, Laserphotokoagulation und intravitreal applizierte Kortikosteroide bekannt. Das retinale Pigmentepithel (RPE) bildet die äußere Blut-Retina-Schranke (BRS) und hat vielfältige Funktionen für das Sehen. Es absorbiert Licht, phagozytiert Außensegmente der Fotorezeptoren, transportiert Nährstoffe und Ionen, trägt zur Ionenhomöostase und pH-Regulation bei, wandelt all-trans-Retinal für den Sehzyklus um und sezerniert verschiedene Signalmoleküle. Die Ruptur der BRS, die bei der DR beobachtet wird, kann zu erhöhter lokaler extrazellulärer Osmolarität durch Metabolit- und Ioneneinstrom und damit hyperosmolaren Stress im RPE führen. Die Plasmaosmolarität hängt vor allem vom NaCl-Spiegel im Blut ab. Reguliert wird die hohe extrazelluläre Ionenkonzentration durch organische Osmolyte, die den intrazellulären osmotischen Druck erhöhen. Dies führt zu einer Kompensation des osmotischen Gradienten über der Zellmembran und somit zu einer Stabilisierung des Zellvolumens. Unter anderem wird vermehrt Sorbitol produziert, welches in den RPE-Zellen akkumuliert. Durch Aktivierung des Polyolwegs kann es dadurch bei der DR zu Zellschädigungen kommen. Hyperosmolarer Stress verändert außerdem den transepithelialen Widerstand, das Netzhautpotenzial, die RPE-Zellzahl sowie die Proliferation und Zellzyklusphasen. Durch hohe NaCl-Spiegel werden vermehrt angiogene Wachstumsfaktoren exprimiert, die zu chorioidalen Neovaskularisationen beitragen. Schließlich kann der erhöhte osmotische Druck in der Retina zu einer exsudativen Netzhautablösung und zu retinalen Ödemen führen, wodurch das Sehen stark beeinträchtigt wird. NFAT5 ist der hauptsächliche Transkriptionsfaktor, der die Genexpression in Reaktion auf hyperosmotischen Stress reguliert. NFAT5 wird unter hypertonen Bedingungen aktiviert und führt zu einer gesteigerten AR-Expression, wodurch die Sorbitol-Produktion stimuliert wird. Es gibt Hinweise, dass eine erhöhte extrazelluläre Osmolarität über eine Aktivierung von NFAT5 die Pathogenese der DR fördert. Deshalb befasst sich diese Arbeit mit der Untersuchung der Wirkung hoher extrazellulärer NaCl-Konzentrationen auf die Gen- und Proteinexpression der Sorbitolproduzierenden und -umwandelnden Enzyme, Aldosereduktase und Sorbitol-dehydrogenase (SDH), sowie mit der Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 bei kultivierten humanen RPE-Zellen. Es ergaben sich folgende Ziele: • Regulation der Expression von AR und SDH unter verschiedenen pathogenen Bedingungen wie Hyperglykämie, Hypoxie, oxidativer Stress, extrazelluläre Hyperosmolarität • Funktion intra-und extrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren bei der AR- und SDH-Genexpression unter hyperosmolaren bzw. hypoxischen Bedingungen • Rolle der AR- und NFAT5-Aktivitäten für die Vitalität und das Proliferationsverhalten der RPE-Zellen unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen Zur Bestimmung der Genexpression der Enzyme wurden PCR-Experimente durchgeführt. Die AR-Genexpression in RPE-Zellen wurde durch hohe extrazelluläre Glukose (25 mM), CoCl2-induzierte chemische Hypoxie (150 μM), H2O2-induzierten oxidativen Stress (20 μM) und NaCl- oder Sucrose-induzierte extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Durch die gleichzeitige Stimulation mit NaCl und CoCl2 wurde die AR-Genexpression additiv erhöht, was dafür spricht, dass (teilweise) verschiedene intrazelluläre Signalwege die Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen vermitteln. Extrazelluläre Hyperosmolarität, aber nicht Hypoxie, erhöhte außerdem die AR-Proteinmenge, die mittels Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Um zu ermitteln, welche Signalwege und Transkriptionsfaktoren die Expressionen von AR und SDH vermitteln, wurden jeweils spezifische Inhibitoren eingesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass unter Kontroll- und hyperosmolaren Bedingungen die JNK-Aktivität die AR-Expression erhöht, was auf eine hemmende Funktion des Signalwegs hindeutet. Die Hemmung der p38-MAPK, ERK1/2 und PI3K-Signalwege reduzierten die Expression des AR-Gens bei extrazellulärer Hyperosmolarität und Hypoxie, was nahelegt, dass diese Signalwege die AR-Genexpression verstärken. Zudem ist die JNK-Aktivität unter hypoxischen Bedingungen an der Vermittlung der NaCl-induzierten AR-Genexpression beteiligt. Es ist bekannt, dass extrazelluläre Hyperosmolarität die Sekretion von angiogenen Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF und TGFβ aus RPE-Zellen induziert. Deshalb wurde untersucht, ob eine Aktivierung von Rezeptoren für diese Wachstumsfaktoren für die NaCl-induzierte AR-Genexpression in RPE-Zellen notwendig ist. Die Hemmung des VEGF-Rezeptors 2 erhöhte unter Kontrollbedingungen die AR-Genexpression. Dies deutet daraufhin, dass RPE-Zellen unter Kontrollbedingungen kontinuiertlich VEGF freisetzen. Unter hyperosmolaren Bedingungen wurde die Expression des AR-Gens durch einen Hemmer von Rezeptoren für TGFβ1 sowie einen Hemmer von MMPs vermindert. Die AR-mRNA wurde durch die Hemmung des VEGF Rezeptor-2 und der FGF-Rezeptortyrosinkinase vermehrt exprimiert. Dies deutet auf eine negative Regulation der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen durch auto- bzw. parakrine Aktivierung von VEGF- und FGF-Rezeptoren hin. Unter hypoxischen Bedingungen vermitteln die PDGF- und EGF-Rezeptortyrosinkinasen und die Kinaserezeptoren für TGFβ1 die AR-Genexpression. Für die Rolle von Transkriptionsfaktoren an der Regulation der AR wurde gezeigt, dass NFκB unter Kontrollbedingungen die AR-Expression hemmt. Unter hypoxischen Bedingungen konnte eine Rolle von HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der AR-Genexpression nachgewiesen werden. Die verwendeten Transkriptionsfaktorhemmer hatten unter hyperosmolaren Bedingungen keinen Effekt auf die AR-Expression. Für die Untersuchung der NFAT5-Aktivität wurde der Transkriptionsfaktor mit Hilfe einer siRNA ausgeschaltet. Die Transfektion mit der NFAT5-siRNA reduzierte unter hyperosmolaren sowie hypoxischen Bedingungen die NFAT5-Expression in den RPE-Zellen um etwa 60 %. Diese verringerte NFAT5-Aktivität bewirkte eine Reduktion der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen, aber nicht unter Hypoxie. Die AR-Genexpression scheint spezifisch unter hyperosmolaren Bedingungen durch NFAT5 reguliert zu werden. Um zu untersuchen, wie sich die NFAT5- bzw. die AR-Aktivität auf das Überleben und die Proliferation von RPE-Zellen auswirkt, wurde NFAT5 mittels siRNA ausgeschaltet und die AR-Aktivität mit dem spezifischen Inhibitor EBPC gehemmt. Die Herunterregulation der NFAT5-Expression oder die Inhibition der AR-Aktivität verminderte die Zellvitalität unter hyperosmolaren, aber nicht unter hypoxischen Bedingungen und verstärkte die hyperosmolare Hemmung der Zellproliferation. Dies deutet darauf hin, dass eine Herunterregulation der NFAT5-Expression den Zellzyklusarrest unter hyperosmolaren Bedingungen verstärkt, während die Aktivität der AR protektiv auf die Zellen wirkt. Die SDH-Genexpression wurde durch Hypoxie und oxidativen Stress, nicht aber durch extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Hyperosmolarität und Hypoxie veränderten die SDH-Proteinmenge in den Zellen nicht. Unter Kontrollbedingungen verringerte die Aktivität der JNK die SDH-Genexpression. Der PI3-Akt-Signalweg ist für die Vermittlung der Hypoxie-induzierten SDH-Genexpression von Bedeutung. Außerdem verringerte das entzündungshemmende Glukokortikoid Triamcinolon die hypoxische Expression des SDH-Gens. Weiterhin wurde eine erhöhte SDH-Genexpression durch den VEGF-Rezeptor-2-Hemmer unter Kontrollbedingungen nachgewiesen, was auf einen hemmenden Effekt der VEGF-Rezeptoraktivierung hindeutet. Die SDH-Expression wurde durch die Inhibitoren der PDGF- bzw. EGF-Rezeptortyrosinkinasen unter Hypoxie reduziert, was eine Funktion dieser Rezeptoren an der Induktion der SDH-Expression unter diesen Bedingungen nahelegt. Der Transkriptionsfaktor NFκB hemmte unter Kontrollbedingungen die SDH-Expression, während die Transkriptionsfaktoren HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der SDH-Expression unter hypoxischen Bedingungen eine Rolle spielen.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit / Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass Sorbitol in RPE-Zellen unter hyperosmolaren Bedingungen akkumuliert, während es unter hypoxischen Bedingungen oder bei oxidativem Stress zu keiner Sorbitolakkumulation kommt. Man kann annehmen, dass die NFAT5- und AR-vermittelte Sorbitolakkumulation die RPE-Zellen unter osmotischem Stress schützt, weil es die intrazelluläre Osmolarität erhöht. Es sollten zukünftig weitere Untersuchungen zur Vitalität der Zellen bei AR-Hemmung unter verschiedenen pathogenen Bedingungen durchgeführt werden. Derzeit befinden sich eine Vielzahl vielversprechender neuer Therapiemöglichkeiten der DR in der Entwicklung, die auf biochemische Signalwege abzielen, die mikrovaskulären Schaden verursachen. Wichtig ist zudem die weitere klinische Forschung, um die Rolle dieser neuen Therapien bei der Behandlung der DR zu ermitteln.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

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The transcription factor NFAT5/TonEBP belongs to the Rel family, which also comprises NF ÛB and NFATc proteins. NFAT5 only shares structural and functional homology with other Rel family members at the level of the DNA binding domain, and differs from them considerably in other regions. NFAT5 enables mammalian cells to adapt to and withstand hypertonicity by orchestrating an osmoprotective gene expression program whose products include chaperones as well as ransporters and enzymes that increase the intracellular concentration of compatible osmolytes. NFAT5-null mice suffer severe embryonic and perinatal lethality, and surviving adults manifest growth defects, pronounced renal atrophy and lymphocyte dysfunction associated with ineffective responses to hypertonicity. To circumvent the lethality of these mice and study the function of NFAT5 in specific cell types without the possible side effects of generalized defects in the organism, we have produced conditional knockout mice that allow the deletion of NFAT5 in specific cell types. Here we have investigated the hypertonic stress response in wild-type and NFAT5-/- lymphocytes. Proliferating lymphocytes exposed to hypertonic conditions exhibited an early, NFAT5- independent, genotoxic stress-like response with induction of p53, p21 and GADD45, downregulation of cyclins E1, A2 and B1 mRNA, and arrest in S and G2/M. This was followed by an NFAT5-dependent adaptive phase in wild-type cells, which induced osmoprotective gene products, downregulated stress markers, and resumed cyclin expression and cell cycle progression. NFAT5-/- cells, however, failed to induce osmoprotective genes and though they downregulated genotoxic stress markers, they displayed defective cell cycle progression associated with reduced expression of cyclins E1, A2, B1, and aurora B kinase. Finally, T cell receptor-induced expression of cyclins, aurora B kinase, and cell cycle progression were inhibited in NFAT5-/- lymphocytes exposed to hypertonicity levels in the range reported in plasma in patients and animal models of osmoregulatory disorders. Our results support the conclusion that the activation of an osmoprotective gene expression program by NFAT5 enables cells to proliferate under hypertonic stress conditions by maintaining the expression of S and G2/M cyclins and cell cycle progression.

Cytochrome P450 3A isozymes (CYP3A) metabolize approximately 50% of therapeutic drugs. It has recently been discovered that human CYP3A mRNA levels can be induced by hypertonicity; a physiological state not previously linked to its regulation. The osmosensitive transcription factor, Nuclear Factor of Activated T-Cells 5 (NFAT5), regulates multiple genes that restore osmolyte homeostasis and promote cell protection during osmotic stress. In silico examinations and in vitro experiments using reporters, knockdown and binding assays in the human intestinal cell line C2bbe1 have revealed an active tonicity-responsive enhancer (TonE) within CYP3A7 intron (+5417/+5427 from CYP3A7 transcriptional start site) that is responsible for NFAT5 binding and NFAT5-dependent regulation of CYP3A isoforms. In addition, hypertonicity-mediated CYP3A induction is also observed in both hepatic and intestinal cell lines. Effects of tonicity changes on in vivo CYP3A expression and function were examined in a humanized CYP3A transgenic mouse with similar tissue expression in humans. More specifically, intervention with prolonged dehydration involving alternating between 24-hour cycles of water-deprivation and water ad lib for 1 week (cyclic water-deprivation; four 24-hour water-deprivation and three 24-hour water ad lib periods), increased expression of NFAT5 target genes Slc6a12 in the liver and kidney (2.5 ± 0.6-fold over water ad lib, n = 14, p = 0.04; and 3.1 ± 0.6-fold, n = 10, p = 0.02, respectively), Akr1b3 in the liver, and Slc5a3 in the kidney. Immunofluorescent microscopy revealed an increase of nuclear-distributed mouse NFAT5 in cyclic water-deprived animals, consistent with NFAT5 activation. Most importantly, CYP3A4 mRNA levels were noted to be elevated in the liver and kidney (11.8 ± 4.8-fold over water ad lib, n = 14, p = 0.04 and 2.2 ± 0.4-fold, n = 9, p = 0.02, respectively), with concurrent CYP3A protein and activity increase. Localized hypertonic environment in the gut was simulated by providing animals with a week-long high-salt diet. The effects of high-salt diet in the gut were similar to those of cyclic water-deprivation in the liver and kidney; where NFAT5 showed nuclear distribution and NFAT5 target gene expression (Slc6a12; 20.5 ± 6.7-fold over a week-long low-salt diet, n = 8, p = 0.02 and Slc6a6; 3.2 ± 0.7-fold, n = 10, p < 0.01, in the duodenum). Furthermore, an increase of CYP3A4 mRNA was observed (2.6 ± 0.5-fold over a week-long low-salt diet, n = 14, p = 0.03), with a corresponding rise in protein expression and activity levels. In summary, increased expression of in vitro and in vivo human CYP3A was achieved using a hypertonic stimulus; concurrent NFAT5 activation and NFAT5 target gene expression were observed. These results suggested a possible binding of activated NFAT5 to CYP3A TonE situated within the intronic region of CYP3A7. It could be further concluded that NFAT5 may be responsible for the hypertonic induction of human CYP3A.

Cytochrome P450 3A isozymes (CYP3A) metabolize approximately 50% of therapeutic drugs. It has recently been discovered that human CYP3A mRNA levels can be induced by hypertonicity; a physiological state not previously linked to its regulation. The osmosensitive transcription factor, Nuclear Factor of Activated T-Cells 5 (NFAT5), regulates multiple genes that restore osmolyte homeostasis and promote cell protection during osmotic stress. In silico examinations and in vitro experiments using reporters, knockdown and binding assays in the human intestinal cell line C2bbe1 have revealed an active tonicity-responsive enhancer (TonE) within CYP3A7 intron (+5417/+5427 from CYP3A7 transcriptional start site) that is responsible for NFAT5 binding and NFAT5-dependent regulation of CYP3A isoforms. In addition, hypertonicity-mediated CYP3A induction is also observed in both hepatic and intestinal cell lines. Effects of tonicity changes on in vivo CYP3A expression and function were examined in a humanized CYP3A transgenic mouse with similar tissue expression in humans. More specifically, intervention with prolonged dehydration involving alternating between 24-hour cycles of water-deprivation and water ad lib for 1 week (cyclic water-deprivation; four 24-hour water-deprivation and three 24-hour water ad lib periods), increased expression of NFAT5 target genes Slc6a12 in the liver and kidney (2.5 ± 0.6-fold over water ad lib, n = 14, p = 0.04; and 3.1 ± 0.6-fold, n = 10, p = 0.02, respectively), Akr1b3 in the liver, and Slc5a3 in the kidney. Immunofluorescent microscopy revealed an increase of nuclear-distributed mouse NFAT5 in cyclic water-deprived animals, consistent with NFAT5 activation. Most importantly, CYP3A4 mRNA levels were noted to be elevated in the liver and kidney (11.8 ± 4.8-fold over water ad lib, n = 14, p = 0.04 and 2.2 ± 0.4-fold, n = 9, p = 0.02, respectively), with concurrent CYP3A protein and activity increase. Localized hypertonic environment in the gut was simulated by providing animals with a week-long high-salt diet. The effects of high-salt diet in the gut were similar to those of cyclic water-deprivation in the liver and kidney; where NFAT5 showed nuclear distribution and NFAT5 target gene expression (Slc6a12; 20.5 ± 6.7-fold over a week-long low-salt diet, n = 8, p = 0.02 and Slc6a6; 3.2 ± 0.7-fold, n = 10, p < 0.01, in the duodenum). Furthermore, an increase of CYP3A4 mRNA was observed (2.6 ± 0.5-fold over a week-long low-salt diet, n = 14, p = 0.03), with a corresponding rise in protein expression and activity levels. In summary, increased expression of in vitro and in vivo human CYP3A was achieved using a hypertonic stimulus; concurrent NFAT5 activation and NFAT5 target gene expression were observed. These results suggested a possible binding of activated NFAT5 to CYP3A TonE situated within the intronic region of CYP3A7. It could be further concluded that NFAT5 may be responsible for the hypertonic induction of human CYP3A.

El NFAT5 es un factor de transcripción de la familia Rel, la cual incluye a los NFATc y los NF-[kappa]B. Hasta ahora, el NFAT5 había sido caracterizado principalmente como un factor de respuesta a estrés osmótico ya que regula la expresión de genes osmoprotectores y citoquinas en respuesta a hipertonicidad. En este trabajo hemos identificado y caracterizado una nueva función del NFAT5, la regulación de genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activados por la vía de los receptores de tipo Toll (TLR), importantes para la respuesta inmunitaria innata y adaptativa a una amplia variedad de estímulos patogénicos. Nuestros resultados muestran que el NFAT5 es un regulador importante en la ruta de los TLR, jugando un papel en la actividad de varios miembros de esta familia de receptores, tal y como lo hacen los factores de transcripción NF[kappa]B e IRF5. / NFAT5 is a transcription factor of the Rel family, which includes NFATc and NF-[kappa]B. NFAT5 has been mainly characterized as a hypertonicity responsive factor, since it regulates the expression of osmoprotective genes and cytokines in response to osmotic stress. In this work we have identified and characterized a novel role for NFAT5, the regulation of genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activated by the Toll-like receptor pathway (TLR), important for innate and adaptive immunity responses to a wide variety of pathogenic molecules. Our results show that NFAT5 is an important transcription factor of the TLR pathway, playing a role in the activity of several members of this receptor family, like other transcription factors such as NF-[kappa]B and IRF5.

Adaptive responses allow cells to maintain their growth as well as their proliferative potential under diverse stress conditions. It is known that, growth and proliferation can be suppressed by intense stress, but maintained under tolerable stress conditions under which cells can induce compensatory responses. The kinase mTOR is a central regulator of proliferative and growing capacity in mammalian cells, and has been shown to be sensitive to diverse stressors. However, little is known about the role played by mTOR in the adaptive responses that cells utilize to resist stress and maintain their growth capacity. We addressed this question in the context of osmotic stress, to which cells can adapt by inducing the transcription of specialized genes. We showed that mTOR is active under moderate osmostress conditions and regulates the induction of a set of genes by mechanisms dependent and independent of NFAT5, the main transcription factor involved in the transcription of genes upon hypertonic stress. In addition, we observed that the overall set of genes whose induction was sensitive to mTOR activity is enriched in regulators of growth and proliferation. We also have identified REDD1 and REDD2 as two osmostress and mTOR-dependent induced genes, which previously had been characterized in other stress contexts acting as negative regulators of the mTORC1 pathway. We observed that mTOR promoted changes in chromatin predisposing it towards a transcriptional permissive configuration, with higher levels of acetylated histone H4 and increased recruitment of active RNA-pol II to promoters as well as transcribed regions. Altogether, the results described in this thesis reveal a new role for the mTOR kinase in the regulation of gene expression to facilitate the cellular adaptive response upon osmostress. / Las respuestas adaptativas frente al estrés permiten a las células mantener su crecimiento así como su potencial proliferativo. Aunque se ha establecido que el crecimiento y la proliferación celular pueden inhibirse en respuesta a un estrés intenso, en situaciones de estrés tolerable las células pueden mantener su crecimiento y proliferación mediante la inducción de respuestas compensatorias. La quinasa mTOR es una proteína clave para el mantenimiento de la capacidad proliferativa y del crecimiento en las células de mamífero; además se ha descrito que es sensible a varios estreses. Sin embargo, poco se sabe acerca del papel que juega en las respuestas de adaptación que son utilizadas por las células para resistir el estrés y mantener así su capaciad de crecimiento. Nuestro trabajo se ha centrado en el ámbito del estrés osmótico, en cuyo caso las células pueden adaptarse mediante la transcripción de diversos genes especializados. Nuestro estudio demuestra que mTOR se encuentra activo en condiciones moderadas de estrés osmótico y regula la indución de un conjunto de genes mediante mecanismos dependientes e independientes de NFAT5, el principal factor de transcripción responsable de la transcripción de genes en respuesta a un estrés hipertónico. Además, observamos que la mayoría de los genes cuya inducción es sensible a la actividad de mTOR tienen funciones en la regulación del crecimiento y de la proliferación. También hemos identificado a REDD1 y REDD2 como genes que se inducen en respuesta a estrés osmótico dependientes de mTOR, y que con anterioridad se habían caracterizado en otros escenarios de estrés actuando como reguladores negativos de la ruta de señalización de mTORC1. Por último hemos observado que mTOR origina cambios en la cromatina, promoviendo una configuración permisiva para la transcripción, con un incremento de la acetilación de la histona H4 y un aumento en el reclutamiento de la forma activa de la RNA-polimerasa II en los promotores y regiones transcritas de ciertos genes. En resumen, los resultados descritos en esta tesis muestran un nuevo papel de la quinasa mTOR en la regulación de la expresión génica facilitando así la respuesta de adaptación celular frente al estrés osmótico.