Le rein est particulièrement exposé à de nombreux composés chimiques dont des médicaments, potentiellement néphrotoxiques. Parmi-eux, le Tacrolimus, un anti-calcineurine largement utilisé en transplantation rénale, est associé à l’apparition plus ou moins rapide de lésions histologique de toxicité conduisant à la fibrose rénale et, à terme, à la perte de fonction du greffon. Des systèmes enzymatiques et protéiques impliqués dans la prise en charge cellulaire des xénobiotiques, ainsi que des protéines aux propriétés anti-fibrosantes, telles que la cavéoline-1, lui permettent de se défendre contre ce type d’agression locale prolongée. La mesure de l’expression de 380 gènes impliqués dans la prise en charge des xénobiotiques dans des échantillons de tissu rénal humain sain nous a permis de confirmer que le rein possède un arsenal de défense important et complet. Ces différents systèmes de défense étant hautement polymorphes, le principal objectif de notre travail était de déterminer l’impact de certains polymorphismes génétiques sur la susceptibilité individuelle à la néphrotoxicité du Tacrolimus.Dans un premier temps, l’impact sur les paramètres pharmacocinétiques du Tacrolimus et le devenir du greffon de deux polymorphismes génétiques affectant les CYP3A5 et ABCB1, deux protéines participant au transport et au métabolisme du Tacrolimus, a été évalué dans une cohorte de 209 patients transplantés rénaux. Le génotypage a été réalisé à la fois sur l’ADN des receveurs et des donneurs. Les patients ont été suivis jusqu'à 2 ans après transplantation rénale. Cette étude a confirmé que les receveurs sous Tacrolimus (Prograf) porteurs d’au moins un allèle CYP3A5*1 fonctionnel nécessitent, quelque soit le moment de la greffe, des posologies de Tacrolimus plus élevées. Malgré ces doses, leur taux résiduel de Tacrolimus (C0) reste plus faible. Cependant, l’analyse de la distribution des rapports résiduelles/posologies de Tacrolimus montre qu’il existe une forte zone de chevauchement entre les deux populations *1/- vs *3/*3. Ainsi, certains patients ayant un CYP3A5 génétiquement déficitaire se comportent phénotypiquement comme des patients fonctionnels. D’autres polymorphismes génétiques sont probablement à l’origine de ce phénomène. En ce qui concerne le devenir du greffon, malgré son impact sur la pharmacocinétique du Tacrolimus, le polymorphisme génétique du CYP3A5 du donneur ou du receveur n’est statistiquement pas associé à la survenue de rejet, de retard de fonctionnement de greffon, ou n’a d’impact direct sur la fonction rénale (MDRD) et la survie du greffon. La mutation 3435C>T affectant le gène ABCB1 du donneur ou du receveur n’influence ni les paramètres pharmacocinétiques, ni le devenir clinique du greffon. Par ailleurs, le Tacrolimus est désormais disponible sous une forme à libération prolongée (Advagraf), permettant une prise unique journalière. Des pharmacocinétiques sur 24h ont été réalisées chez 32 patients (17 fonctionnels et 15 non fonctionnels pour le CYP3A5) avant conversion et quinze jours après conversion Prograf-Advagraf. Les résultats ont montré que, après conversion, l’exposition au Tacrolimus diminue de manière significative pour les patients CYP3A5 fonctionnelsEnfin, l’influence d’un polymorphisme génétique, rs4730751, affectant le gène CAV1 (codant la cavéoline-1, une protéine inhibitrice de la fibrose tissulaire) sur la survie du greffon rénal a récemment été rapporté. Nous avons confirmé dans une cohorte de 475 transplantés rénaux que les patients porteurs de ce polymorphisme génétique à l’état homozygote (ADN du greffon rénale) ont une altération de la fonction rénale significativement plus rapide. / Tacrolimus is highly effective in preventing acute rejection after renal transplantation, but displays a narrow therapeutic index and high inter-individual pharmacokinetic variations. As Tacrolimus is a substrate of CYP3A and ABCB1, the effect of potentially relevant genetic polymorphisms, CYP3A5 6986A>G and ABCB1 3435C>T, in both donors and recipients on Tacrolimus pharmacokinetics and clinical outcome was investigated in 209 kidney transplant patients. Methodology/Principal Findings:The mean duration follow-up was 21.8±9 months. Tacrolimus dose, trough blood levels (C0) and C0/dose ratio were statistically correlated with only the recipient CYP3A5 genotype. Concerning the allograft clinical outcome, CYP3A5 and ABCB1 genotypes exhibit no influence on the incidence of Biopsy Proven Acute Rejection and Delayed Graft Function. Renal function was not affected by CYP3A5 and ABCB1 genotypes. Histological evaluation of biopsies revealed also no significant association between Tacrolimus toxicity features and donor or recipient CYP3A5 and ABCB1 polymorphisms. Tacrolimus and steroids sparing was similar in groups of patients according to their genotypes. Conclusions/Significance: Recipient CYP3A5 6986A>G polymorphism explains part of the inter-individual variability in the pharmacokinetics of Tacrolimus. At two years, clinical outcome does not appear to be related to either donor’s or recipient’s CYP3A5 6986A>G and ABCB1 3435C>T polymorphisms. Interestingly, tapering of immunosuppressive therapy may be achieved even for patients experiencing extensive Tacrolimus metabolism, independently of CYP3A5 genotype.

Thesis (Ph. D.)--Indiana University, 2007. / Title from screen (viewed on November 16, 2007). Department of Pharmacology & Toxicology, Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI). Advisor(s): Stephen D. Hall, Lisa M. Kamendulis, Sherry F. Queener, Leonard C. Erickson, Steven A. Wrighton. Includes vitae. Includes bibliographical references (leaves 195-203).

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Vincristine is metabolized by the cytochrome P450 3A subfamily of enzymes possibly including CYP3A5, a genetically polymorphic enzyme. The contribution of CYP3A5 to the metabolism of vincristine was quantified by various in vitro models: cDNA-expressed enzymes, human liver microsomes, and human hepatocytes. With these models, the major CYP metabolite of vincristine, M1, was identified and extensively characterized. The rates of M1 formation in the cDNA-expressed enzyme models were at least 7-fold higher with CYP3A5 than CYP3A4; approximately 90% of the hepatic metabolism was predicted to be CYP3A5-mediated. For human liver microsomes with high CYP3A5 expression, the CYP3A5 contribution was substantial, approximately 80%. Human hepatocytes with at least one CYP3A5*1 allele also metabolized vincristine, albeit at a slower rate (10-fold) than human liver microsomes. The CYP3A5 low-expressing hepatocytes did not metabolize vincristine. We conclude that for high CYP3A5 expressers, the majority of the CYP metabolism is mediated by CYP3A5. By in vitro/in vivo scaling with microsomes, the hepatic clearances of high CYP3A5 expressers are predicted to have a 5-fold higher hepatic clearance than low expressers. However, the role of metabolism in the systemic clearance of vincristine is unknown. To study the disposition of vincristine in vivo, a sensitive and selective LC/MS/MS assay was validated for the quantification of vincristine and M1 quantification in human plasma. Vincristine and M1 were identified and quantified in select pediatric plasma and urine samples. For future large-scale clinical studies, the vincristine and M1 concentrations in plasma will be quantified to understand the role of CYP3A5 genotype in vincristine pharmacokinetics. For patients that are CYP3A5 high expressers, the systemic clearance of vincristine may be higher than that of low CYP3A5 expressers. Thus, CYP3A5 genotype may be an important determinant of inter-individual variability in clinical outcomes.

No description available.

Introdução: As CYP3A4 e CYP3A5 são enzimas do citocromo P450 responsáveis pela biotransformação de esteróides endógenos e vários fármacos, entre eles as estatinas. Polimorfismos nos genes CYP3A4 e CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) foram associados com diferenças na resposta hipolipemiante de indivíduos tratados com atorvastatina e sinvastatina. Neste estudo foram avaliados os efeitos de hipolipemiantes sobre a expressão e a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, em linhagens celulares HepG2 e Caco-2 e em CMSP de indivíduos hipercolesterolêmicos, e sua relação com variantes de CYP3A4 e CYP3A5. Métodos: Foram analisados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). A genotipagem das variantes CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foi feita por PCR-RFLP ou sequenciamento. A análise da expressão de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 foi avaliada por PCR em tempo real quantitativo (PCRq). As proteínas totais de HepG2 foram avaliadas por Western Blotting. A atividade de CYP3A4 e CYP3A5 in vivo foi avaliada pela relação entre cortisol e seu metabólito, 6&#946;-hidróxicortisol, na urina (razão 6&#946;OH-cortisol/cortisol), por CLAE. Resultados: O perfil de expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é diferente entre HepG2 e Caco-2. Caco-2 expressa 31 vezes mais CYP3A4 e 122 vezes mais CYP3A5 que HepG2. Em células HepG2 tratadas por 12 h, a atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão de CYP3A4 em 10 vezes, em relação ao controle (p=0,006). Após 24 h de tratamento, atorvastatina (1-20 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A4 em 5 a 8 vezes, nas HepG2 (p< 0,001). Para CYP3A5, a exposição por 12 h à atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão em 4 vezes em relação ao controle ( p<0,001). A exposição à sinvastatina 1,0 &#181;M por 24 h aumentou a expressão de CYP3A4, em 2 vezes (p<0,01), em HepG2. Também se observou que, nesse tempo de tratamento, a sinvastatina (0,1 &#181;M a 10 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A5 em 2 a 4 vezes (p<0,05). A linhagem HepG2 apresenta alelos funcionais (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A) em homozigose. A linhagem Caco-2 apresenta os alelos não funcionais CYP3A5*3C e CYP3A5*1D, em heterozigose. Também foi avaliada a expressão das proteínas CYP3A4 e CYP3A5 por Western Blotting, em células HepG2, após atorvastatina (0,1 a 20 &#181;M) e sinvastatina (0,01 a 10 &#181;M) por 12 e 24 h. O perfil de expressão das proteínas não diferiu com os tratamentos. Nas células mononucleares do sangue periférico (CMSP), a expressão de RNAm basal de CYP3A4 é cerca de 2,5 a 9,6 vezes maior que a expressão de CYP3A5 (p< 0,05). Observou-se correlação da expressão de CYP3A4 e CYP3A5 nessas células, antes (r2 = 0,22; p< 0,0001) e após o tratamento (r2 = 0,58; p<0,0001) com atorvastatina. A expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é maior nos indivíduos (NL) que nos indivíduos (HC) (p<0,05). A atorvastatina não influenciou a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 em CMSP (p> 0,05). Os indivíduos NL apresentam atividade de CYP3A4 e CYP3A5 basal maior que os indivíduos HC- (p<0,0001). O tratamento com atorvastatina não alterou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5 nos HC (p>0,05). As variantes gênicas estudadas (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) como grupos haplotípicos não afetaram a resposta ao tratamento, a expressão de RNAm ou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, embora o haplótipo AGT tenha expressão basal de RNAm de CYP3A5 menor que os portadores de haplótipos GAT e GAC (p<0,005). Conclusão: Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que a atorvastatina e a sinvastatina, mas não a ezetimiba, influenciam a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 in vitro, em linhagem derivada de hepatócitos (HepG2), e que este efeito não foi reproduzido em linhagem derivada de enterócitos (Caco-2). A expressão de CYP3A4 e CYP3A5 tem grande variabilidade interindividual, independente do grupo haplotípico de cada indivíduo, e que não é influenciada pela atorvastatina. / Background: CYP3A4 and CYP3A5 are enzymes from the cytochrome P450 resposible for the biotransformation of endogenous steroids and several drugs, e.g. statins. Polymorphisms in CYP3A4 and CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and CYP3A5*1D) have been associated with variation of lipid-lowering response in individuals treated with atorvastatin and simvastatin. In this study we evaluated the effect of hypolipemiants on expression and activity of CYP3A4 and CYP3A5, in HepG2 and Caco-2 cell lines as well as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in hypercholesterolemic individuals, and their relationship with CYP3A4 and CYP3A5 variants. Methods: We analyzed 99 normolipidemic individuals (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC). HC subjects were treated with atorvastatin (HC, 10 mg/day/4 weeks). Analysis of CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D variants was performed with PCR-RFLP or sequencing assays and mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) was performed . Total protein content was extracted from HepG2 for Western Blotting experiments. Activity of CYP3A4 and CYP3A5 in vivo was evaluated by 6&#946;OH-cortisol and cortisol ratio in urine samples, by HPLC-UV method. Results: Baseline mRNA expression is different for HepG2 and Caco-2. Caco-2 expresses 31 times more CYP3A4 and 122 times more CYP3A5 than HepG2. In HepG2 cells treated for 12h, atorvastatin 20 &#181;M increased CYP3A4 expression in 10 times, when compared to the control (p=0.006). After 24h treatment, atorvastatin (1-20 &#181;M) increased CYP3A4 mRNA expression in 5 to 8 times, in HepG2 (p< 0.001). To CYP3A5, exposure for 12h to atorvastatin 20 &#181;M increased expression in 4 times when compared to the control (p<0.001). Exposure to simvastatin 1.0 &#181;M for 24 h increased CYP3A4 expression in 2 times, (p<0.01), in HepG2. With the 24h treatment,simvastatin (0.1 &#181;M - 10 &#181;M) CYP3A5 showed increased mRNA expression in 2 to 4 times (p<0.05). HepG2 cell line carries homozygous functional alleles (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A). Caco-2 carries heterozygous CYP3A5*3C and CYP3A5*1D. We evaluated the protein expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Western Blotting in HepG2 cells, after atorvastatin (0.1 - 20 &#181;M) and simvastatin (0.01 - 10 &#181;M) for 12 and 24 h. The proteins profile did not change with statins treatment. In PBMC, baseline mRNA expression of CYP3A4 is approximately 2.6 to 9.5 times higher than CYP3A5 (p< 0.05). There was a correlation in expression between CYP3A4 and CYP3A5, before (r2 = 0.22; p< 0.0001) and after treatment (r2 = 0.58; p<0.0001) with atorvastatin. Baseline mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 is higher in (NL) than in (HC) (p<0.05). Atorvastatin treatment did not increase CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in PBMC (p>0.05). CYP3A4/5 activity was higher in NL subjects than in HC (p<0.0001). Atorvastatin treatment did not affect CYP3A4/5 activity in HC (p>0.05). The studied variants CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D analyzed as a haplotype block did not affect response to treatment, mRNA expression or activity of CYP3A4 and CYP3A5. However, AGT haplotype showed lower CYP3A5 mRNA expression levels when compared to GAC and GAT haplotypes at baseline (p<0.05). Conclusion: The results of this study allow us to conclude that atorvastatin and simvastatin, but not ezetimibe, influence the expression of CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in vitro in HepG2 cell line, but this effect was not reproduced in Caco-2 cell line or PBMC. CYP3A4 and CYP3A5 present great interindividual variability, despite the individual´s haplotype and is not influenced by atorvastatin.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:39:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NURIA ALONSO LOPEZ CID.pdf: 1461437 bytes, checksum: 7aabd2e9fb0164bdf7480906eadb35b7 (MD5) Previous issue date: 2016-04-14 / The advances in Anesthesiology took place at the same time as the development of drugs that ensured greater control over pain, patient comfort, and safety during surgical anesthetic procedures. Pharmacogenetics is the science that enables enhanced healthcare, by understanding the genetic variations that may affect the different responses to treatments. CYP3A are the most important enzymes involved in the metabolism of drugs prescribed in clinical practice, showing extensive genetic variability in their expression. CYP3A5 presents the highest number of functional variants, with significant differences in the frequencies observed among different population groups around the world and in Brazil. This study aimed and at assessing the frequency of CYP3A5*3 and CYP3A5*6 genotypic and allelic variants and to estimate the metabolizing profile according to these variants, as well as any potential implications on adverse events with drugs used in anesthesia. The sample used for this study included 166 subjects users of the Laboratório da Área de Saúde da PUCGoiás (PUC Healthcare Laboratory city of Goiás). They were all born in the Brazilian Midwest, over 18 years of age, and from both genders. The blood samples were obtained from each individual and genotyped for CYP3A5*3, A>G (rs 776746) and CYP3A5*6, G>A (rs 10264272) by real time Polymerase Chain Reaction using TaqMan assays. Data analysis of the allelic frequency was conducted by calculating the percentage for the established groups, according to color or race, compared to the total sample. In individuals from the Brazilian Midwest, assessed in this study, the frequency of the allelic variant CYP3A5*3 was 40% and 2% for CYP3A5*6. The frequency observed for the CYP3A5*3 allelic variant in subjects from the Midwest was lower than that from other Brazilian studies and also lower than the frequencies observed in Europeans and Asians, however, they were similar to the frequency seen in populations from East and West Africa. The frequency of the CYP3A5*6 allelic variant, in this study, was higher than that found in European studies and similar of the subjects in the North of Africa. Based on the results, one may infer that 72% would be poor metabolizers. The higher frequency of the poor metabolizer profile shows that there is potential for a greater occurrence of adverse events when using drugs metabolized by CYP3A5 in this population from the Brazilian Midwest. / O progresso da Anestesiologia junto com o desenvolvimento de drogas garantiram maior controle da dor, conforto ao paciente e segurança durante o ato anestésicocirúrgico. A Farmacogenética é uma ciência que permite a melhora da assistência à saúde, por meio do conhecimento das variações genéticas que podem estar envolvidas com as diferenças na resposta terapêutica. As CYP3A são as enzimas mais importantes envolvidas com o metabolismo de drogas prescritas na prática clínica, apresentando grande variabilidade genética na sua expressão. A CYP3A5 é a forma que apresenta mais variantes funcionais e com diferenças expressivas nas frequências observadas em diferentes grupos populacionais do mundo. Este estudo teve como objetivo avaliar a frequência das variantes genotípicas e alélicas do CYP3A5*3 e CYP3A5*6 e inferir sobre o perfil metabolizador dos indivíduos em função destas variantes em relação a drogas usadas em anestesia. O grupo avaliado incluiu 166 indivíduos usuários do Laboratório da Área de Saúde da PUCGoiás, nascidos na região Centro-Oeste do Brasil, maiores de 18 anos e de ambos os sexos. As amostras de sangue foram obtidas de cada indivíduo e genotipados para CYP3A5*3, A>G (rs 776746) and CYP3A5*6, G>A (rs 10264272) por Reação em Cadeia de Polimerase usando sondas TaqMan. A análise dos dados das frequências alélicas foi realizada através do cálculo das porcentagens para os grupos estabelecidos, segundo a cor ou raça, em relação a amostra total. Nos indivíduos da região Centro-Oeste do Brasil avaliados neste estudo, a frequência da variante alélica CYP3A5*3 foi de 40% e da CYP3A5*6 foi de 2%. A frequência observada para a variante alélica CYP3A5*3 em indivíduos da região Centro-Oeste foi menor que a de outros estudos brasileiros e também menor que as frequências verificadas em europeus e asiáticos, porém similar à observada na população do leste e oeste da África. A frequência da variante alélica CYP3A5*6, neste estudo, foi maior que a encontrada em estudos europeus e com valores mais próximos daqueles observados no norte da África. Com base nos resultados obtidos da amostra pode-se inferir que 72% dos indivíduos seriam fracos metabolizadores. A maior frequência do perfil de fraco metabolizador mostra que existe potencial de maior ocorrência de eventos adversos no uso de fármacos metabolizados pela CYP3A5 nesta população da região Centro-Oeste do Brasil.

A isoenzima citocromo P450 3A5 (CYP3A5) tem um papel importante na biotransformação de compostos endógenos e xenobióticos. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) do gene CYP3A5 foram associados com variações na expressão gênica e atividade enzimática que podem modificar o metabolismo de vários fármacos. Com a finalidade de investigar a influência de SNPs do CYP3A5 sobre a expressão de RNAm e a resposta a atorvastatina, foram selecionados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os pacientes HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). Amostras de sangue periférico foram coletadas antes e após o tratamento para análise do perfil lipídico sérico, e extração de DNA genômico e RNA total. Os SNPs CYP3A5*3C e CYP3A5*6 foram analisados por PCR-RFLP e o CYP3A5*1D por sequenciamento de DNA. A expressão de RNAm do CYP3A5 em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foi analisada por PCR em tempo real. No grupo HC, os alelos CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foram mais frequentes em brancos (*3C: 84,9% e *1D 84,8%) que em afro-descendentes (*3C: 47,8% e *1D: 55,2%, p<0,01). Os alelos *3C e *1D estavam em desequilíbrio de ligação. A frequência do alelo CYP3A5*6 foi maior em negros (6,8%) que em brancos (0,6%, p=0,002). Não houve associação entre os SNPs do CYP3A5 e o perfil lipídico basal nos grupos NL e HC. Os HC brancos portadores do haplótipo CYP3A5*3A/*3A (alelos *3C e *1D combinados) apresentaram menor redução de colesterol total e LDL-c após o tratamento com atorvastatina do que os portadores dos haplótipos não-CYP3A5*3A/*3A (p<0,05). A expressão de RNAm de CYP3A5 em CMSP aumentou em resposta a atorvastatina (p<0,05) somente nos portadores de haplótipo CYP3A5*3A/*3A. Esses resultados são sugestivos de que os SNPs CYP3A5*3C e CYP3A5*1D são associados com a expressão gênica do CYP3A5 e a resposta de redução de colesterol a atorvastatina. / The cytochrome P450 isoenzyme 3A5 (CYP3A5) has an important role on biotransformation of endogenous compounds and xenobiotics. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the CYP3A5 gene have been associated with variations on gene expression and enzyme activity that can modify the metabolism of several drugs. In order to evaluate the influence of CYP3A5 SNPs on RNAm expression and response to atorvastatin, 99 mormolipidemic (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC) individuals have been enrolled in this study. HC patients were treated with atorvastatin (10 mg/day/four weeks). Blood samples were collected before and after treatment for serum lipids analyses, genomic DNA and total RNA extraction. CYP3A5*3C, and CYP3A5*6 SNPs were analyzed by PCR-RFLP. CYP3A5*1D was analyzed by direct sequencing. CYP3A5 RNAm expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was evaluated by Real Time PCR. In HC group, the frequencies of CYP3A5*3C and CYP3A5*1D alleles were higher in white individuals (*3C: 84.9% and *1D 84.8%) that in blacks (*3C: 47.8% and *1D: 55.2%, p<0.01). CYP3A5*3C and *1D alleles were in linkage desequilibrium. CYP3A5*6 allelle frequency was higher in blacks (6.8%) that in white individuals (0.6%, p=0.002). There was no association between CYP3A5 SNPs and baseline lipid profile in NL and HC groups. White HC carriers of CYP3A5*3A/*3A haplotype (*3C and *1D combined alleles) have lower total cholesterol and LDL-c response to atorvastatin than non-CYP3A5*3A/*3A carriers (p<0.05). CYP3A5 RNAm expression on PBMC increased in response to atorvastatin (p<0.05) only in CYP3A5*3A/*3A haplotype carriers. These results are suggestive that CYP3A5*3C and CYP3A5*1D SNPs are associated with CYP3A5 gene expression and cholesterol-lowering response to atorvastatin.

Introdução: As CYP3A4 e CYP3A5 são enzimas do citocromo P450 responsáveis pela biotransformação de esteróides endógenos e vários fármacos, entre eles as estatinas. Polimorfismos nos genes CYP3A4 e CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) foram associados com diferenças na resposta hipolipemiante de indivíduos tratados com atorvastatina e sinvastatina. Neste estudo foram avaliados os efeitos de hipolipemiantes sobre a expressão e a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, em linhagens celulares HepG2 e Caco-2 e em CMSP de indivíduos hipercolesterolêmicos, e sua relação com variantes de CYP3A4 e CYP3A5. Métodos: Foram analisados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). A genotipagem das variantes CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foi feita por PCR-RFLP ou sequenciamento. A análise da expressão de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 foi avaliada por PCR em tempo real quantitativo (PCRq). As proteínas totais de HepG2 foram avaliadas por Western Blotting. A atividade de CYP3A4 e CYP3A5 in vivo foi avaliada pela relação entre cortisol e seu metabólito, 6&#946;-hidróxicortisol, na urina (razão 6&#946;OH-cortisol/cortisol), por CLAE. Resultados: O perfil de expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é diferente entre HepG2 e Caco-2. Caco-2 expressa 31 vezes mais CYP3A4 e 122 vezes mais CYP3A5 que HepG2. Em células HepG2 tratadas por 12 h, a atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão de CYP3A4 em 10 vezes, em relação ao controle (p=0,006). Após 24 h de tratamento, atorvastatina (1-20 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A4 em 5 a 8 vezes, nas HepG2 (p< 0,001). Para CYP3A5, a exposição por 12 h à atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão em 4 vezes em relação ao controle ( p<0,001). A exposição à sinvastatina 1,0 &#181;M por 24 h aumentou a expressão de CYP3A4, em 2 vezes (p<0,01), em HepG2. Também se observou que, nesse tempo de tratamento, a sinvastatina (0,1 &#181;M a 10 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A5 em 2 a 4 vezes (p<0,05). A linhagem HepG2 apresenta alelos funcionais (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A) em homozigose. A linhagem Caco-2 apresenta os alelos não funcionais CYP3A5*3C e CYP3A5*1D, em heterozigose. Também foi avaliada a expressão das proteínas CYP3A4 e CYP3A5 por Western Blotting, em células HepG2, após atorvastatina (0,1 a 20 &#181;M) e sinvastatina (0,01 a 10 &#181;M) por 12 e 24 h. O perfil de expressão das proteínas não diferiu com os tratamentos. Nas células mononucleares do sangue periférico (CMSP), a expressão de RNAm basal de CYP3A4 é cerca de 2,5 a 9,6 vezes maior que a expressão de CYP3A5 (p< 0,05). Observou-se correlação da expressão de CYP3A4 e CYP3A5 nessas células, antes (r2 = 0,22; p< 0,0001) e após o tratamento (r2 = 0,58; p<0,0001) com atorvastatina. A expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é maior nos indivíduos (NL) que nos indivíduos (HC) (p<0,05). A atorvastatina não influenciou a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 em CMSP (p> 0,05). Os indivíduos NL apresentam atividade de CYP3A4 e CYP3A5 basal maior que os indivíduos HC- (p<0,0001). O tratamento com atorvastatina não alterou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5 nos HC (p>0,05). As variantes gênicas estudadas (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) como grupos haplotípicos não afetaram a resposta ao tratamento, a expressão de RNAm ou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, embora o haplótipo AGT tenha expressão basal de RNAm de CYP3A5 menor que os portadores de haplótipos GAT e GAC (p<0,005). Conclusão: Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que a atorvastatina e a sinvastatina, mas não a ezetimiba, influenciam a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 in vitro, em linhagem derivada de hepatócitos (HepG2), e que este efeito não foi reproduzido em linhagem derivada de enterócitos (Caco-2). A expressão de CYP3A4 e CYP3A5 tem grande variabilidade interindividual, independente do grupo haplotípico de cada indivíduo, e que não é influenciada pela atorvastatina. / Background: CYP3A4 and CYP3A5 are enzymes from the cytochrome P450 resposible for the biotransformation of endogenous steroids and several drugs, e.g. statins. Polymorphisms in CYP3A4 and CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and CYP3A5*1D) have been associated with variation of lipid-lowering response in individuals treated with atorvastatin and simvastatin. In this study we evaluated the effect of hypolipemiants on expression and activity of CYP3A4 and CYP3A5, in HepG2 and Caco-2 cell lines as well as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in hypercholesterolemic individuals, and their relationship with CYP3A4 and CYP3A5 variants. Methods: We analyzed 99 normolipidemic individuals (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC). HC subjects were treated with atorvastatin (HC, 10 mg/day/4 weeks). Analysis of CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D variants was performed with PCR-RFLP or sequencing assays and mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) was performed . Total protein content was extracted from HepG2 for Western Blotting experiments. Activity of CYP3A4 and CYP3A5 in vivo was evaluated by 6&#946;OH-cortisol and cortisol ratio in urine samples, by HPLC-UV method. Results: Baseline mRNA expression is different for HepG2 and Caco-2. Caco-2 expresses 31 times more CYP3A4 and 122 times more CYP3A5 than HepG2. In HepG2 cells treated for 12h, atorvastatin 20 &#181;M increased CYP3A4 expression in 10 times, when compared to the control (p=0.006). After 24h treatment, atorvastatin (1-20 &#181;M) increased CYP3A4 mRNA expression in 5 to 8 times, in HepG2 (p< 0.001). To CYP3A5, exposure for 12h to atorvastatin 20 &#181;M increased expression in 4 times when compared to the control (p<0.001). Exposure to simvastatin 1.0 &#181;M for 24 h increased CYP3A4 expression in 2 times, (p<0.01), in HepG2. With the 24h treatment,simvastatin (0.1 &#181;M - 10 &#181;M) CYP3A5 showed increased mRNA expression in 2 to 4 times (p<0.05). HepG2 cell line carries homozygous functional alleles (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A). Caco-2 carries heterozygous CYP3A5*3C and CYP3A5*1D. We evaluated the protein expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Western Blotting in HepG2 cells, after atorvastatin (0.1 - 20 &#181;M) and simvastatin (0.01 - 10 &#181;M) for 12 and 24 h. The proteins profile did not change with statins treatment. In PBMC, baseline mRNA expression of CYP3A4 is approximately 2.6 to 9.5 times higher than CYP3A5 (p< 0.05). There was a correlation in expression between CYP3A4 and CYP3A5, before (r2 = 0.22; p< 0.0001) and after treatment (r2 = 0.58; p<0.0001) with atorvastatin. Baseline mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 is higher in (NL) than in (HC) (p<0.05). Atorvastatin treatment did not increase CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in PBMC (p>0.05). CYP3A4/5 activity was higher in NL subjects than in HC (p<0.0001). Atorvastatin treatment did not affect CYP3A4/5 activity in HC (p>0.05). The studied variants CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D analyzed as a haplotype block did not affect response to treatment, mRNA expression or activity of CYP3A4 and CYP3A5. However, AGT haplotype showed lower CYP3A5 mRNA expression levels when compared to GAC and GAT haplotypes at baseline (p<0.05). Conclusion: The results of this study allow us to conclude that atorvastatin and simvastatin, but not ezetimibe, influence the expression of CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in vitro in HepG2 cell line, but this effect was not reproduced in Caco-2 cell line or PBMC. CYP3A4 and CYP3A5 present great interindividual variability, despite the individual´s haplotype and is not influenced by atorvastatin.

A isoenzima citocromo P450 3A5 (CYP3A5) tem um papel importante na biotransformação de compostos endógenos e xenobióticos. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) do gene CYP3A5 foram associados com variações na expressão gênica e atividade enzimática que podem modificar o metabolismo de vários fármacos. Com a finalidade de investigar a influência de SNPs do CYP3A5 sobre a expressão de RNAm e a resposta a atorvastatina, foram selecionados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os pacientes HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). Amostras de sangue periférico foram coletadas antes e após o tratamento para análise do perfil lipídico sérico, e extração de DNA genômico e RNA total. Os SNPs CYP3A5*3C e CYP3A5*6 foram analisados por PCR-RFLP e o CYP3A5*1D por sequenciamento de DNA. A expressão de RNAm do CYP3A5 em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foi analisada por PCR em tempo real. No grupo HC, os alelos CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foram mais frequentes em brancos (*3C: 84,9% e *1D 84,8%) que em afro-descendentes (*3C: 47,8% e *1D: 55,2%, p<0,01). Os alelos *3C e *1D estavam em desequilíbrio de ligação. A frequência do alelo CYP3A5*6 foi maior em negros (6,8%) que em brancos (0,6%, p=0,002). Não houve associação entre os SNPs do CYP3A5 e o perfil lipídico basal nos grupos NL e HC. Os HC brancos portadores do haplótipo CYP3A5*3A/*3A (alelos *3C e *1D combinados) apresentaram menor redução de colesterol total e LDL-c após o tratamento com atorvastatina do que os portadores dos haplótipos não-CYP3A5*3A/*3A (p<0,05). A expressão de RNAm de CYP3A5 em CMSP aumentou em resposta a atorvastatina (p<0,05) somente nos portadores de haplótipo CYP3A5*3A/*3A. Esses resultados são sugestivos de que os SNPs CYP3A5*3C e CYP3A5*1D são associados com a expressão gênica do CYP3A5 e a resposta de redução de colesterol a atorvastatina. / The cytochrome P450 isoenzyme 3A5 (CYP3A5) has an important role on biotransformation of endogenous compounds and xenobiotics. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the CYP3A5 gene have been associated with variations on gene expression and enzyme activity that can modify the metabolism of several drugs. In order to evaluate the influence of CYP3A5 SNPs on RNAm expression and response to atorvastatin, 99 mormolipidemic (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC) individuals have been enrolled in this study. HC patients were treated with atorvastatin (10 mg/day/four weeks). Blood samples were collected before and after treatment for serum lipids analyses, genomic DNA and total RNA extraction. CYP3A5*3C, and CYP3A5*6 SNPs were analyzed by PCR-RFLP. CYP3A5*1D was analyzed by direct sequencing. CYP3A5 RNAm expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was evaluated by Real Time PCR. In HC group, the frequencies of CYP3A5*3C and CYP3A5*1D alleles were higher in white individuals (*3C: 84.9% and *1D 84.8%) that in blacks (*3C: 47.8% and *1D: 55.2%, p<0.01). CYP3A5*3C and *1D alleles were in linkage desequilibrium. CYP3A5*6 allelle frequency was higher in blacks (6.8%) that in white individuals (0.6%, p=0.002). There was no association between CYP3A5 SNPs and baseline lipid profile in NL and HC groups. White HC carriers of CYP3A5*3A/*3A haplotype (*3C and *1D combined alleles) have lower total cholesterol and LDL-c response to atorvastatin than non-CYP3A5*3A/*3A carriers (p<0.05). CYP3A5 RNAm expression on PBMC increased in response to atorvastatin (p<0.05) only in CYP3A5*3A/*3A haplotype carriers. These results are suggestive that CYP3A5*3C and CYP3A5*1D SNPs are associated with CYP3A5 gene expression and cholesterol-lowering response to atorvastatin.

Le rein est particulièrement exposé à de nombreux composés chimiques dont des médicaments, potentiellement néphrotoxiques. Parmi-eux, le Tacrolimus, un anti-calcineurine largement utilisé en transplantation rénale, est associé à l'apparition plus ou moins rapide de lésions histologique de toxicité conduisant à la fibrose rénale et, à terme, à la perte de fonction du greffon. Des systèmes enzymatiques et protéiques impliqués dans la prise en charge cellulaire des xénobiotiques, ainsi que des protéines aux propriétés anti-fibrosantes, telles que la cavéoline-1, lui permettent de se défendre contre ce type d'agression locale prolongée. La mesure de l'expression de 380 gènes impliqués dans la prise en charge des xénobiotiques dans des échantillons de tissu rénal humain sain nous a permis de confirmer que le rein possède un arsenal de défense important et complet. Ces différents systèmes de défense étant hautement polymorphes, le principal objectif de notre travail était de déterminer l'impact de certains polymorphismes génétiques sur la susceptibilité individuelle à la néphrotoxicité du Tacrolimus.Dans un premier temps, l'impact sur les paramètres pharmacocinétiques du Tacrolimus et le devenir du greffon de deux polymorphismes génétiques affectant les CYP3A5 et ABCB1, deux protéines participant au transport et au métabolisme du Tacrolimus, a été évalué dans une cohorte de 209 patients transplantés rénaux. Le génotypage a été réalisé à la fois sur l'ADN des receveurs et des donneurs. Les patients ont été suivis jusqu'à 2 ans après transplantation rénale. Cette étude a confirmé que les receveurs sous Tacrolimus (Prograf) porteurs d'au moins un allèle CYP3A5*1 fonctionnel nécessitent, quelque soit le moment de la greffe, des posologies de Tacrolimus plus élevées. Malgré ces doses, leur taux résiduel de Tacrolimus (C0) reste plus faible. Cependant, l'analyse de la distribution des rapports résiduelles/posologies de Tacrolimus montre qu'il existe une forte zone de chevauchement entre les deux populations *1/- vs *3/*3. Ainsi, certains patients ayant un CYP3A5 génétiquement déficitaire se comportent phénotypiquement comme des patients fonctionnels. D'autres polymorphismes génétiques sont probablement à l'origine de ce phénomène. En ce qui concerne le devenir du greffon, malgré son impact sur la pharmacocinétique du Tacrolimus, le polymorphisme génétique du CYP3A5 du donneur ou du receveur n'est statistiquement pas associé à la survenue de rejet, de retard de fonctionnement de greffon, ou n'a d'impact direct sur la fonction rénale (MDRD) et la survie du greffon. La mutation 3435C>T affectant le gène ABCB1 du donneur ou du receveur n'influence ni les paramètres pharmacocinétiques, ni le devenir clinique du greffon. Par ailleurs, le Tacrolimus est désormais disponible sous une forme à libération prolongée (Advagraf), permettant une prise unique journalière. Des pharmacocinétiques sur 24h ont été réalisées chez 32 patients (17 fonctionnels et 15 non fonctionnels pour le CYP3A5) avant conversion et quinze jours après conversion Prograf-Advagraf. Les résultats ont montré que, après conversion, l'exposition au Tacrolimus diminue de manière significative pour les patients CYP3A5 fonctionnelsEnfin, l'influence d'un polymorphisme génétique, rs4730751, affectant le gène CAV1 (codant la cavéoline-1, une protéine inhibitrice de la fibrose tissulaire) sur la survie du greffon rénal a récemment été rapporté. Nous avons confirmé dans une cohorte de 475 transplantés rénaux que les patients porteurs de ce polymorphisme génétique à l'état homozygote (ADN du greffon rénale) ont une altération de la fonction rénale significativement plus rapide.