E3-Ubiquitin-Ligasen übertragen Ubiquitin auf die von ihnen gebundenen Substratproteine. Durch diese Ubiquitinierung werden Proteine für den kontrollierten Abbau im Ubiquitin-Proteasom-System markiert. Dieser Prozess beeinflusst aber auch die Aktivität verschiedener Signalwege, die Lokalisation von Proteinen oder die strukturelle Integrität zellulärer Komponenten. MuRF1, MuRF2 und MuRF3 sind E3-Ubiquitin-Ligasen, die hauptsächlich in quergestreifter Muskulatur exprimiert werden. Von MuRF1 ist bereits bekannt, dass es u. a. über die Ubiquitinierung von Myosinen und deren anschließender Degradation an der Entwicklung der Herz- und Skelettmuskelatrophie beteiligt ist. Da das Wissen über MuRF2 und MuRF3 in diesem Zusammenhang noch begrenzt ist, sollte die Auswirkung der kombinierten Keimbahndeletion von MuRF2 und MuRF3 in einem Mausmodell untersucht werden. Der Doppelknockout (DKO) von MuRF2 und MuRF3 führte zu Veränderungen der Morphologie und der Funktionsfähigkeit der Skelett- und Herzmuskulatur. In Skelettmuskelfasern kam es zur Ablagerung myosinhaltiger Proteinaggregate, zu einer Zunahme an langsam kontrahierenden Muskelfasern sowie zum Auftreten von Myozyten mit zentral gelegenen Nuclei als Anzeichen von Regenerationsprozessen. Isolierte Skelettmuskeln von DKO-Mäusen entwickelten eine geringere maximale spezifische Kraft als Muskeln aus Kontrolltieren. Ihre Herzen waren morphologisch unauffällig. Dennoch waren die Kontraktion des linken Ventrikels und das Schlagvolumen reduziert. Darüber hinaus zeigten isolierte Kardiomyozyten Beeinträchtigungen der Kontraktionsfähigkeit und der Kalziumströme in vitro. Eine massenspektrometrische Untersuchung ergab, dass in den Muskeln der MuRF2/3-DKO-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollmäusen 12 Proteine in erhöhter Menge vorhanden waren. Eine Anreicherung von MAPKAP-K3, einem dieser Proteine, und von MAPKAP-K2 konnte im Western Blot von Proteinlysaten aus Skelettmuskeln und dem Herz der MuRF2/3-DKO-Mäuse detektiert werden. / E3 ubiquitin ligases attach the small modifier ubiquitin to their substrate proteins. This ubiquitin-tag not only marks proteins for the proteasome dependent degradation, but also influences the activity of signalling pathways, the localisation of proteins or the structural integrity of cellular components. MuRF1, MuRF2, and MuRF3 are E3 ubiquitin ligases predominantly expressed in striated muscles. MuRF1 is involved in cardiac and skeletal muscle atrophy by mediating proteasome-dependent degradation of myosins. The knowledge about MuRF2 and MuRF3 in this context is limited. Therefore, a mouse model was used to analyse the impact of the combined deletion of MuRF2 and MuRF3. The double knockout (DKO) of MuRF2 and MuRF3 influenced the structure and function of skeletal and cardiac muscle. Skeletal muscle fibres exhibited myosin-containing protein aggregates, a fibre-type shift towards slow fibres, and myoycytes with central nuclei which is an indication of regeneration. Maximal force development was reduced in isolated hindlimb muscles M. soleus and M. extensor digitorum longus of MuRF2/3-DKO mice. Hearts were morphologically normal. No protein aggregates or signs of fibrosis were detected. However, heart performance was impaired. The contractibility of the left ventricle and the ejection fraction were reduced. Isolated cardiomyocytes showed a diminished contractibility. Furthermore, their speed of contraction and relaxation was reduced and they had impaired calcium transients. Mass spectrometric analysis of muscle lysates identified 12 enriched proteins in MuRF2/3-DKO muscles. Western Blot analysis confirmed that MAPKAP-K3, one of these proteins, and MAPKAP-K2 were enriched in lysates of skeletal muscles and left ventricles of MuRF2/3-DKO mice. Further investigations will show how MAPKAP-K2- and MAPKAP-K3-signalling pathways are involved in the development of the MuRF2/3-DKO-phenotype.

Cardiotrophin-1 ist ein Zytokin der Familie Interleukin-6-Familie, zu der auch IL-11, CNTF, OSM und LIF gehören. Diese Substanzen wirken über die gemeinsame Rezeptoruntereinheit gp130. CT-1 induziert die Hypertrophie von Kardiomyozyten und inhibiert die Apoptose kardialer und Zellen. In verschiedenen Tiermodellen der Herzinsuffizienz konnte eine gesteigerte myokardiale CT-1 Expression beobachtet werden. Kardiomyopathien sind wiederum kardiale Erkrankungen, die mit einer Hypertrophie und Apoptose einhergehen und zu einer Herzinsuffizienz führen können. Man geht davon aus, dass 25-50 Prozent der familiär sind. Hierbei handelt es sich um eine monogenetische Erkrankung, die überwiegend autosomal-dominant vererbt werden. Daneben konnten aber auch modifizierende Polymorphismen in neurohumoralen Faktoren identifiziert werden. Basierend auf diesen Ergebnissen war das Ziel dieser Arbeit die Analyse der möglichen Beteiligung genetischer Varianten der kodierenden sowie der regulatorischen Region an der Pathogenese der Hypertrophen bzw. Dilatativen Kardiomyopathie. Zusätzlich sollte die mRNA-Expression von CT-1 in Myokardbiopsien von Patienten mit Herzinsuffizienz quantifiziert werden. Hierfür musste zunächst die Sequenzen der 5´-flankierenden Region identifiziert und bezüglich ihrer regulatorischen Eigenschaften analysiert werden. Es konnten 1,1 kb der 5´-flankierenden Region sequenziert werden. Die anschließende Luciferase-Reportergen-Analyse wies regulatorische Aktivitäten für den gesamten Bereich nach. Diese Region enthält zahlreiche cis-aktive DANN-Sequenzen aber keine TATA-Box. Für die Mutationssuche wurden 64 Patienten mit DCM, 53 Patienten mit HCM sowie 100 Kontrollpersonen mittels PCR-SSCP-Analyse untersucht. Es konnte eine kodierende Variante A92T bei jeweils einem DCM- bzw. HCM-Patienten identifiziert werden. Diese Substitution liegt in einem Bereich, der zwischen verschiedenen Spezies (Ratte, Maus, Mensch) konserviert ist. Diese Mutation könnte eine Veränderung der Sekundärstruktur bewirken und liegt in einem möglichen funktionellen Bereich. Die Promotorregion wies eine Basenpaarsubstitution bei -130 (G/T) sowie eine Deletion der Basen CTTT zwischen -992 und -995 auf. Der Polymorphismus an Position -130 fand sich tendenziell häufiger bei Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie. Die CTTT-Deletion konnte nur bei einer Patientin mit HCM nachgewiesen werden. Für die Quantifizierung der CT-1 mRNA wurden rechtsventrikuläre Endomyokardbiopsien von 6 Patienten mit eingeschränkter LVEF (CHI), 5 Patienten nach Herztransplantation (TX) sowie 3 Kontrollpatienten (KO) eingesetzt. Es konnte ein relativer Anstieg der CT-1 Expression um 82% bei den Patienten mit eingeschränkter LVEF festgestellt werden. Interessanterweise besteht eine enge Korrelation zur Schwere der eingeschränkten Herzfunktion sowie zur Zunahme der Hypertrophie. / Cardiotrophin-1 is a cytokine, which belongs to the interleukin-6 family, which includes IL-11, CNTF, OSM and LIF. These factors act via the receptor subunit gp130. CT-1 induces the hypertrophy of cardiomyocytes and inhibits the apoptosis of cardiac cells. Studies in animal models of congestive heart failure showed an enhanced expression of CT-1 in the myocardium. Cardiomyopathies are cardiac diesorders, which are charakterized by hypertrophy and apoptosis and which can terminate with congestive heart failure. About 25-50 percent of all cases are familial. It is a monogenetic mendelian disorder with an autosomal-dominant inheritance in most cases. Beside this, modifying polymorphisms in neurohunoral factors could be identified. Based on these facts, the aim of this study was to identify genetic variants within the coding and regulatory region of the CT-1 gene, which could influence the pathogenesis of hypertrophic or dilated cardiomyopathy. Additionally, the mRNA-expression of CT-1 in myocardial biopsies of heart failure patients should be quantified. First, it was necessary to sequence the 5´-untranslated region and to analyse its regulatory function. We could sequence 1.1 kb of the 5´-UTR. The luciferase reportergene assay showed a significant promoter activity for the whole region. The region contains various cis-active DNA sequences but no TATA-box.The TRANSFAC-analysis identified different binding sites for transcription factors but no TATA-box. The genetic material of 64 DCM and 53 HCM patients and 100 controls was screened for mutaions by using a PCR-based SSCP-analysis. A coding variant A92T could be identified for a patient with DCM and for an HCM patient. This mutation lies within a region which is conserved between different species (rat, mouse, human). This variant could disturb the secondary structure and lies in a probable functional region. Within the promoter we could identify a basepair substitution at position -130 (G/T) and a 4-basepair deletion between -992 and -995 (CTTTdel). The polymorphism at -130 showed a tendency for a higher occurrence in DCM patients. One HCM patient was heterozygous for the CTTT-deletion. To quantify the CT-1 mRNA we used endomyocardial biopsies of 6 patients with reduced LVEF (CHI), 5 patients after heart transplantation (TX) and 3 controls (KO). We performed a semiquantitative analysis by using HPLC and an external standard (PDH mRNA). We found an increased expression of CT-1 by 82% for patients with heart failure. Interestingly, we saw a tight correlation with to the reduction in LV function and to the degree of hypertrophy.