Regensburg, Univ., Diss., 2008.

Cardanols are more and more used in the industry of polymers, resins, coatings, friction materials, etc. At right conditions, these lipid-like chemicals can undergo metathesis reaction. The main aim of the diploma thesis is an analysis of products of cardanol metathesis by HPLC-MS/MS. Standard 3,3'-hexadec-8-en-1,16-diyldiphenol, one of the main products of cardanol metathesis, was prepared for quantitative HPLC analysis. The standard was prepared in two steps. The first step was cardanol ethenolysis to give 3-(non-8-enyl)phenol. The second step was self-metathesis of 3-(non-8- enyl)phenol to give 3,3'-hexadec-8-en-1,16-diyldiphenol. The standard was characterised by HPLC/MS, MS/MS, EI-MS, UV/VIS, IR, Raman a NMR spectroscopy. The second part of the thesis is dedicated to the study of a mechanism of double-bond localization method in long chain hydrocarbons by acetonitrile APCI-MS. The formation of adducts [M + 55]+ , which are the key substances of this method, was studied using simple alkene models by MS and MS/MS. At the end, the structure and the mechanism of the formation of adducts [M + 55]+ were suggested. Key words: Cardanol, olefin metathesis, HPLC-MS, double-bond localization, APCI, acetonitrile

Halogenierte Verbindungen treten in der Natur in einer großen Vielzahl auf. Ihre Funktionen können sehr vielfältig sein und reichen von antimikrobiellen Aktivitäten bis hin zu pflanzlichen Wachstumsregulatoren. Vor allem in Pilzen und Bakterien gibt es eine Reihe halogenierter Substanzen. Die Synthesewege und beteiligten Enzyme dieser Verbindungen sind weitestgehend aufgeklärt. Bei einer Klasse von halogenierenden Enzymen handelt es sich um Flavin-abhängige Tryptophan-Halogenasen, welche die Aminosäure Tryptophan regioselektiv und substratspezifisch an bestimmten Positionen des Indolrings halogenieren können. Tryptophan ist eine essenzielle Aminosäure, welche sehr vielfältige Funktionen innerhalb der Zellen besitzt. So wird diese in Polypeptidketten von Enzymen und Proteinen eingebaut und dient als Vorstufe für viele verschiedene Stoffwechselprodukte. Das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IAA) leitet sich z. B. aus ebendieser Aminosäure ab. Pflanzenhormone haben sehr vielfältige Funktionen innerhalb der Pflanzen und spielen z. B. bei der Entwicklung, Differenzierung und Abwehr eine wichtige Rolle. In einigen Pflanzen konnte eine halogenierte Form von IAA, die 4-Chlorindol-3-Essigsäure, nachgewiesen werden. In verschiedenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung eine erhöhte Reaktivität gegenüber der nicht halogenierten Form aufweist. Die Wirkung dieser Substanz wurde in den letzten Jahrzehnten gut untersucht, über die an der Synthese beteiligten Enzyme dieses Pflanzenhormons ist jedoch kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Gene von drei bakteriellen Tryptophan-Halogenasen (pyrH, thiH und prnA) in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana exprimiert und die Bildung von chlorierten Substanzen genauer untersucht. Hauptaugenmerk wurde dabei auf mögliche chlorierte Metabolite gelegt, welche sich von der Aminosäure Tryptophan ableiten. Neben der Expression der bakteriellen Halogenasegene wurden diese zusätzlich für die Modellpflanze optimiert und unter der Kontrolle des 2× 35S-Promotors in Arabidopsis thaliana transformiert. Die heterologe Expression von AtpyrH, AtthiH, AtprnA, sowie der optimierten Gene AtpyrHopt, AtthiHopt und AtprnAopt konnte in verschiedenen transgenen Linien in den Pflanzen nachgewiesen werden. Die Expression der Halogenasegene variiert dabei in den untersuchten Linien. Durch die Optimierung konnte keine erhöhte Expression der Gene erzielt werden. Lediglich bei der Expression von AtpyrHopt zeigte sich ein erhöhtes Niveau der Genregulation im Vergleich zu AtpyrH. Der Nachweis, dass die transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen, welche eines der Halogenasegene exprimieren, in der Lage sind die Aminosäure an der entsprechenden Position (5, 6 oder 7) zu halogenieren konnte für alle stabil transformierten Gene erbracht werden. Zusätzlich gelang es, die Halogenase-Enzyme aus transgenen Pflanzen von AtpyrH und AtpyrHopt anzureichern und deren Funktionsfähigkeit in einem Enzym-Test nachzuweisen. Es konnten ebenfalls weitere chlorierte Intermediate detektiert werden, welche u. a. Vorläufermoleküle des Hormons IAA aber auch weiterer Substanzen wie z. B. Camalexin sind. Für Arabidopsis thaliana-Wildtyp konnte die Möglichkeit zur Bildung von Cl-IAA durch die Zugabe von chloriertem Tryptophan gezeigt werden. Die an der Biosynthese beteiligten Enzyme können das chlorierte Substrat verwenden und dem Stoffwechsel zuführen. Die Bildung der chlorierten Verbindungen erfolgte in den transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen ohne eine zusätzliche Expression einer Flavin-Reduktase. Das für die Halogenierungsreaktion notwendige FADH2 kann durch die Pflanzen selbst zur Verfügung gestellt werden. Die unterschiedliche Regulation der Gene führte bei den transgenen Linien nicht zu phänotypischen Unterschieden. Sowohl die Entwicklung der Pflanzen, als auch die Anzahl und Größe der Rosettenblätter entspricht dem Wildtyp und ist durch die Bildung chlorierter Verbindungen nicht beeinflusst. In verschiedenen Tests wurde die erhöhte Bioaktivität sowohl von chloriertem Tryptophan als auch chlorierter IAA in in vitro Experimenten mit verschiedenen Pflanzen bestätigt. Chlorierte IAA hemmte zusätzlich dazu das Wachstum des Bakteriums Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. In phytopathologischen Untersuchungen mit verschiedenen transgenen Pflanzen zeigte sich, dass Linien von AtthiHopt, AtprnA und AtprnAopt mitunter eine verbesserte Resistenz gegen bestimmte Pathogene aufweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Bildung von chloriertem Tryptophan und chloriertem Indol-3-Acetonitril durch die heterologe Expression von Flavin-abhängigen Tryptophan-Halogenasen in Arabidopsis thaliana sowohl durch die ursprünglichen bakteriellen, als auch die optimierten Gene möglich ist.

Vid Klinisk kemi och farmakologi, Specialkemi, vid Skånes universitetssjukhus, Lund, utförs kvantifiering med LC-MS/MS av antipsykotiska och antidepressiva läkemedelskoncentrationer i serum med acetonitril (ACN) som mobilfas. ACN är på grund av sin höga elueringsstyrka ett av de vanligaste organiska lösningsmedlen vid reversed phase (RP) kromatografi, men uppvisar samtidigt en hög toxicitet med risk för stora leveransproblem. I syfte att reducera mängden ACN undersöktes därför möjligheten till ett mobilfasbyte till metanol (MeOH). Ordinarie metod jämfördes med tre nyutvecklade metoder med MeOH-baserad mobilfas. I en av metoderna ändrades endast mobilfas och elueringsgradient, medan två av metoderna även använde andra sorters RP-kolonner med anpassade elueringsgradienter. Samtliga analyter uppvisade godkänd separation och retention vid eluering med MeOH, men stor fluktuation från referensmetod sågs vid kvantifieringen av flera analyter, däribland olanzapin, desmetylolaznapin och mirtazapin. Liknande avvikelser med avseende på regression och kvantifieringsdifferens observerades vid eluering med andra sorters RP-kolonner. Detta indikerar att vidare optimering av andra vätskekromatografiska och masspektrometriska parametrar bör utföras innan metoderna kan valideras. / The quantification of antipsychotics and antidepressants in human serum with LC-MS/MS is usually performed with acetonitrile (ACN) as mobile phase. ACN is one of the most common organic solvents in reversed phase (RP) chromatography thanks to its high elution strength but is also highly toxic and can at times suffer from major delivery problems. The present study investigated the possibility of replacing ACN with methanol (MeOH) as primary organic solvent with the purpose of reducing the total ACN-usage. Three newly developed methods for chromatographic analysis of antipsychotic and antidepressant drugs using MeOH as organic solvent as part of the mobile phase were compared to the routine method in regard to analyte separation and retention, as well as the relative quantification of substance. In one of the methods only the mobile phase and elution gradient was changed whereas different types of RP columns were applied in addition to the changed mobile phase in the other two. All substances showed acceptable separation and retention when eluted with MeOH but displayed large fluctuations in the quantification of the analyzed substances, more specifically olanzapine, desmethylolanzapine and mirtazapine, in comparison to the reference method. Similar deviations in terms of regression and quantification bias were observed when analytes were eluted with MeOH through other types of RP columns. This indicates that further optimization of other parameters relating to the chromatography and mass spectrometer should be performed before validation.