Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

Content: In this study, different acid proteases, which were produced from Aspergillus and Bacillus, were applied for wet-blue bating and their properties and bating effects were observed. The results showed that the acid protease produced Aspergillus had better bating effect and higher chromium tolerance than that of produced by Bacillus. Furthermore, how the acid protease influenced wet-blue microstructure was analyzed by SEM and Micro-CT. The enzymatic properties of acid protease was studied firstly.Zeta potential analysis showed that the isoelectric point (pI) of the protease was consistent with its pH value, which was at 3.0. By particle size analysis, it found that its particle size was 700 nm. In order to obtain the functional components, the molecular weight of the acidic protease was analyzed by Polyacrylamide gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Different molecular weight components were obtained by separating the acidic protease with Tangential Flow Filtration (TFF) Technology. The characteristics of these components were determined such as enzyme types and their proportion. Afterwards, these different molecular weight components were used for wet-blue bating. The bating effluent was collected, and then, contents of Hydroxyproline (Hyp), Hyaluronic acid (HA), Desmosine (Des) and Chondroitin sulfate (CS) were analysed, which could be directly corresponding with the degradation of different proteins in wet-blue. Therefore, by characterizing and comparing the bating effect influenced with these different molecular weight components, the functional components of protease could be identified and further be separated and purified. Based on these results, this research is helpful to the development and study of the action of acid protease in the wet-blue bating process. Take-Away: Micro-CT as a new way to characterize the microstructure of leather; Identification and Separation of Effective Components of Acid Protease； Degradation Analysis of Main Components of Wet-Blue during bating process.

Proteases ácidas pertencem a um importante grupo de enzimas industriais produzidas por fungos filamentosos, com aplicações na indústria de alimentos, de couro, farmacêutica e de cosméticos. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a produção de proteases ácidas extracelulares de fungos filamentosos isolados do solo do cerrado do centro-oeste brasileiro. Inicialmente, foi realizada uma triagem para avaliar a capacidade de 17 linhagens de fungos quanto à produção de protease em meio de cultura contendo Agar-leite. O fungo Aspergillus foetidus foi selecionado como melhor produtor de protease ácida extracelular. Visando à otimização da produção de proteases pelo fungo selecionado, avaliou-se a influência de diversos fatores no cultivo (pH, temperatura, agitação e diferentes fontes de nitrogênio e carbono). Após essa etapa, um planejamento experimental estatístico foi realizado com as variáveis independentes temperatura, pH inicial do meio e fonte de carbono e nitrogênio. A produção máxima de protease foi encontrada (63,7 U/mL) nas condições: pH inicial do meio igual a 7,0 a 28 ºC, 150 rpm em peptona 2% (p/v). Os estudos em biorreator demonstraram produção de protease nas condições de agitação e aeração iguais à 300 rpm e 1,0 vvm, após 120 h de cultivo. Os ensaios com diferentes temperaturas para a estimativa dos parâmetros termodinâmicos demonstraram que a protease ácida produzida pelo fungo é altamente estável apresentando máxima atividade em pH 5,0 e temperatura ótima igual a 55ºC. E, finalmente, para a purificação da enzima foi realizada cromatografia de gel-filtração. A enzima apresentou massa molecular de 50,6 kDa, e a análise do zimograma confirmou a atividade proteolítica. Além disso, a protease purificada foi inibida pelo composto pepstatina, indicando uma característica de protease ácida. Esses resultados obtidos demonstram um fungo filamentoso produtor de uma nova protease ácida com potencial aplicação para indústria farmacêutica e de cosméticos. / The acid proteases belong to the most important group of industrial enzymes produced by filamentous fungi, with applications in the food, leather, pharmaceutical and cosmetics industries. This study aimed the evaluation of extracellular acid proteases production from filamentous fungi isolated from different samples of the midwestern Brazil cerrado. Initially, a screening was performed to assess the ability of the 17 strains of yeast for production of protease-agar medium containing milk culture. The Aspergillus foetidus was selected as the best producer. Aimed at optimizing the production of proteases by the selected fungus, first evaluated the influence of various factors on the cultivation (pH, temperatura, agitation and different sources of nitrogen and carbon). After this step, a statistical experimental design was carried out with the independent variables temperatura, initial pH of the medium and source of carbon and nitrogen. The best conditions for protease production were (63.7 U / mL): initial pH values greater than 7.0, at 28 °C, 150 rpm peptone 2% (w/v). Aiming future production of this protease in industrial scale, studies have shown better in bioreactor protease production under the conditions of agitation and aeration equal to 300 rpm and 1.0 vvm, after 120 h of cultive. The tests at different temperaturas to estimate the thermodynamic parameters showed that the acid protease produced by the fungus is highly stable with maximum activity at pH 5.0 and optimum temperatura of 55 °C. And finally, for the purification of the enzyme were performed gel-filtration chromatography. The enzyme had a molecular mass of 50.6 kDa, and the analysis of the zymogram showed a proteolytic band. Furthermore, the purified protease was inhibited by pepstatin compound, indicating a feature of acid protease. These results demonstrate a new filamentous fungus producing acid protease with potential application to pharmaceuticals and cosmetics.

Proteases ácidas pertencem a um importante grupo de enzimas industriais produzidas por fungos filamentosos, com aplicações na indústria de alimentos, de couro, farmacêutica e de cosméticos. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a produção de proteases ácidas extracelulares de fungos filamentosos isolados do solo do cerrado do centro-oeste brasileiro. Inicialmente, foi realizada uma triagem para avaliar a capacidade de 17 linhagens de fungos quanto à produção de protease em meio de cultura contendo Agar-leite. O fungo Aspergillus foetidus foi selecionado como melhor produtor de protease ácida extracelular. Visando à otimização da produção de proteases pelo fungo selecionado, avaliou-se a influência de diversos fatores no cultivo (pH, temperatura, agitação e diferentes fontes de nitrogênio e carbono). Após essa etapa, um planejamento experimental estatístico foi realizado com as variáveis independentes temperatura, pH inicial do meio e fonte de carbono e nitrogênio. A produção máxima de protease foi encontrada (63,7 U/mL) nas condições: pH inicial do meio igual a 7,0 a 28 ºC, 150 rpm em peptona 2% (p/v). Os estudos em biorreator demonstraram produção de protease nas condições de agitação e aeração iguais à 300 rpm e 1,0 vvm, após 120 h de cultivo. Os ensaios com diferentes temperaturas para a estimativa dos parâmetros termodinâmicos demonstraram que a protease ácida produzida pelo fungo é altamente estável apresentando máxima atividade em pH 5,0 e temperatura ótima igual a 55ºC. E, finalmente, para a purificação da enzima foi realizada cromatografia de gel-filtração. A enzima apresentou massa molecular de 50,6 kDa, e a análise do zimograma confirmou a atividade proteolítica. Além disso, a protease purificada foi inibida pelo composto pepstatina, indicando uma característica de protease ácida. Esses resultados obtidos demonstram um fungo filamentoso produtor de uma nova protease ácida com potencial aplicação para indústria farmacêutica e de cosméticos. / The acid proteases belong to the most important group of industrial enzymes produced by filamentous fungi, with applications in the food, leather, pharmaceutical and cosmetics industries. This study aimed the evaluation of extracellular acid proteases production from filamentous fungi isolated from different samples of the midwestern Brazil cerrado. Initially, a screening was performed to assess the ability of the 17 strains of yeast for production of protease-agar medium containing milk culture. The Aspergillus foetidus was selected as the best producer. Aimed at optimizing the production of proteases by the selected fungus, first evaluated the influence of various factors on the cultivation (pH, temperatura, agitation and different sources of nitrogen and carbon). After this step, a statistical experimental design was carried out with the independent variables temperatura, initial pH of the medium and source of carbon and nitrogen. The best conditions for protease production were (63.7 U / mL): initial pH values greater than 7.0, at 28 °C, 150 rpm peptone 2% (w/v). Aiming future production of this protease in industrial scale, studies have shown better in bioreactor protease production under the conditions of agitation and aeration equal to 300 rpm and 1.0 vvm, after 120 h of cultive. The tests at different temperaturas to estimate the thermodynamic parameters showed that the acid protease produced by the fungus is highly stable with maximum activity at pH 5.0 and optimum temperatura of 55 °C. And finally, for the purification of the enzyme were performed gel-filtration chromatography. The enzyme had a molecular mass of 50.6 kDa, and the analysis of the zymogram showed a proteolytic band. Furthermore, the purified protease was inhibited by pepstatin compound, indicating a feature of acid protease. These results demonstrate a new filamentous fungus producing acid protease with potential application to pharmaceuticals and cosmetics.