Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 63-66 [40 réf.].

Les modèles climatiques indiquent qu’il est très probable que les végétaux soient de plus en plus exposés à deux facteurs de stress environnementaux : l’ozone troposphérique (O3) et le déficit hydrique du sol, tous deux pouvant provoquer un stress oxydant pour le végétal. Dans des conditions naturelles, ces deux facteurs peuvent être concomitants ou se succéder. L’impact de l’O3 et de la sécheresse nécessite donc une attention particulière. Afin de déterminer les réponses de défense mises en place par les arbres, deux génotypes de Populus nigra x deltoides (Carpaccio et Robusta) ont été exposés aux contraintes séparées ou à leur combinaison en conditions contrôlées dans des chambres de culture. Pour explorer les effets des stress et l’interaction entre les deux contraintes, nous avons ciblé les deux premiers niveaux de défense des plantes que sont le contrôle de l’ouverture/fermeture des stomates et les processus de détoxication cellulaire. Nos résultats montrent que Carpaccio et Robusta sont tous deux relativement tolérants à une sécheresse modérée grâce à un contrôle efficient des stomates. Face à l’O3, cependant, les deux génotypes adoptent des stratégies de réponse différentes : un évitement important pour Carpaccio et une maximisation de l’assimilation au détriment des feuilles pour Robusta. Cela se traduit par une différence de fermeture des stomates. Les deux génotypes ne font alors pas face au même flux d’O3 entrant dans les feuilles, ce qui impacte la détoxication cellulaire, dans laquelle le glutathion semble jouer un rôle majeur. En lien avec les modifications de capacité antioxydante, l’activité des enzymes du cycle ascorbate-glutathion (MDHAR, DHAR et GR) et/ou l’expression des gènes codant pour ces protéines sont modifiées. En combinaison de stress, le déficit hydrique protège le végétal du stress oxydant induit par l’O3 en amplifiant la fermeture des stomates. En revanche, la croissance de l’arbre est impactée par l’effet additif des deux contraintes. De plus, l’induction de voies de régulation hormonales différentes par les deux contraintes pourrait modifier le « cross-talk » complexe régulant la réponse au stress combiné. Enfin, dans le cas d’une succession de stress, l’exposition à l’O3 avant un épisode de sécheresse impacte faiblement la réponse de l’arbre. Cependant, un ralentissement de la fermeture des stomates induit par l’O3 est observé malgré l’arrêt de la fumigation. Il est donc nécessaire de prendre en compte le ralentissement et la fermeture des stomates induit par l’O3 et le déficit hydrique dans les modèles de conductance stomatique utilisés pour calculer l’indicateur du flux d’O3 entrant, le PODy (Phytotoxic Ozone Dose above a threshold of y nmol O3 m-2.s-1). / Climate models indicate that it is very likely that plants will be more and more exposed to two environmental stressors: ground-level ozone (O3) and soil water deficit, both causing oxidative stress to the plant. Under natural conditions, these two factors can be concomitant or successive. Therefore, the impact of O3 and drought requires special attention. In order to determine the defensive responses adopted by trees, two genotypes of Populus nigra x deltoides (Carpaccio and Robusta) were exposed to separate or combined stresses under controlled conditions in growing chambers. To explore the effects of stresses and their interaction, we targeted the plant’s first two levels of defence: i) the control of stomatal opening and closing, ii) the cellular detoxification processes. Our results show that both Carpaccio and Robusta are relatively tolerant to moderate drought thanks to an efficient stomatal control. However, different response strategies were adopted by the two genotypes to cope with O3. For Carpaccio, the strategy is avoidance, and for Robusta, the strategy is maximization of net CO2 assimilation at the expense of leaves. This results in a difference in the stomatal closure. The two genotypes do not face the same flow of O3 entering the leaves. This impacts cellular detoxification in which glutathione seems to play a major role. Also, the activity of ascorbate-glutathione cycle enzymes (MDHAR, DHAR and GR) and/or the expression of genes encoding these proteins are modified. Under combined stresses, the water deficit protects the plant from the O3-induced oxidative stress by amplifying the stomatal closure. Nevertheless, the tree growth is impacted by the additive effect of the two stresses. Furthermore, the induction of different hormonal regulatory pathways by the two stressors could modify the complex "cross-talk" regulating the response to combined stress. Finally, in the case of a succession of stresses, exposure to O3 prior to a drought episode has a weak impact on the tree's response. However, O3 induced a stomatal sluggishness in closure despite the cessation of fumigation. It is therefore necessary to take into account stomatal closure and sluggishness induced by O3 and water deficit in the stomatal conductance models used to calculate the indicator of O3 flux inside the leaves, PODy (Phytotoxic Ozone Dose above a threshold of y nmol O3 m-2.s-1).

L'acide ascorbique (AA) a longtemps été décrit comme un agent antiprolifératif, mais la molécule doit être utilisée à très fortes doses, nécessitant des injections intraveineuses. La régulation stricte et complexe des concentrations sanguines et cellulaires rendent impossible le maintien des concentrations élevées sur une longue période.Avec la société KaïronKem, nous avons créé une chimiothèque de dérivés de l'AA. Le but de ce travail thèse était d'identifier des molécules dérivées dont l'action antiproliférative est supérieure à celle de l'AA. Parmi elles, nous avons sélectionné la plus prometteuse, K873, qui a montré des effets cytotoxiques et antiprolifératifs sur différentes cellules tumorales humaines à une dizaine de micromolaires, tout en étant non-toxique pour les cellules saines. Nous avons ensuite testé son efficacité in vivo grâce à des injections quotidiennes chez des souris immunodéficientes xénogreffées avec des cellules cancéreuses humaines. K873 a montré une action antiproliférative sur la progression tumorale équivalente à l'AA à des doses 100 à 200 fois inférieures.Nous avons étudié le mécanisme d'action de K873. Tout comme l'AA, il diminue l'expression de deux familles de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire : facteurs d'initiation de la traduction et ARNt synthétases. Nos résultats montrent que le transporteur intracellulaire de l'AA (SVCT2) n'est pas utilisé pour l'entrée de K873 dans la cellule, bypassant ainsi sa saturation. De la même façon que l'AA, K873 diminue le niveau intracellulaire d'AMPc mais en n'ayant aucune activité antioxydante. Les dérivés de l'AA pourraient être une nouvelle classe de médicaments anticancéreux. / Ascorbic acid (AA) was long described as an antiproliferative agent. However, the molecule has to be used at very high concentrations, which necessitates intravenous injections. In addition, the tight regulation of in-blood and in-cell AA concentrations makes it impossible to hold very high concentrations for any substantial length of time.In collaboration with KaironKem, we undertook the creation of a focused chemical library of AA derivatives. The aim of this work was therefore to identify derivatives molecules with antiproliferative action higher than AA. Among these new molecules, we selected K873 that has cytotoxic and antiproliferative effects on different human tumor cells at tenth micromolar concentration, without being toxic for normal cells. We then tested in vivo the effect of treatment with K873's daily injections in xenografted immunodeficient mice with human cancer cells. K873 showed an antiproliferative effect on tumor growth similar to AA but at doses 100 to 200 times lower.Finally we studied the mechanism of action of K873. As AA, it decreases the expression of two genes families involved in cell cycle progression, i.e. initiation factor of translation and tRNA synthetases. Our results also showed that the specific intracellular transporter of AA (SVCT2) is not used for K873 entry in cells, thus bypassing saturation. Finally, as AA, K873 reduced cAMP intracellular level but without antioxidant activity. Our findings suggest that AA derivatives could be a promising new class of anti-cancer drugs.

L'acide ascorbique (AsA, vitamine C) est l'un des composés parmi les plus importants chez les eucaryotes. En raison de son potentiel antioxydant élevé, l'AsA représente un trait important de la qualité nutritionnelle des végétaux. Au-delà de sa valeur bénéfique pour la santé, une augmentation de la teneur en AsA des fruits bénéficierait probablement à la qualité post-récolte et à la résistance aux pathogènes. Pour mieux comprendre ces régulations chez les plantes et leurs impacts sur la qualité des fruits, une collection de tomates EMS hautement mutée (cv. Micro-Tom) a été criblée pour identifier des mutants dont les fruits sont enrichis en AsA. Cette stratégie de génétique directe associant le criblage à une approche de cartographie par séquençage devait permettre d’identifier de nouveaux gènes liés au caractère AsA+. L'un des mutants, noté P21H6, présentait un enrichissement en AsA de 2 à 4 fois supérieur à celui du WT, et fut le premier à être génétiquement caractérisé. Cette étude a permis de mettre en évidence une nouvelle classe de photorécepteurs impliqués dans la détection de la lumière bleue, appelée SlPLP, en tant que régulateur négatif de l'accumulation d'AsA dans la tomate. Le rôle de PLP dans le phénotype AsA+ du fruit a été confirmé par une stratégie de mutagenèse dirigée, avant d’entreprendre sa caractérisation fonctionnelle. Nous avons démontré que SlPLP interagit avec SlGGP (GDP-L-galactose phosphorylase), une enzyme clé de la voie du L-Galactose, sous contrôle de la lumière bleue et que cette interaction a lieu dans le cytoplasme et le noyau. Nos résultats renforcent le rôle central du GGP dans la biosynthèse de l'AsA et suggèrent un nouveau mécanisme de régulation par la lumière bleue de la fonction du GGP, en plus de son activité métabolique. Parallèlement, nous avons entrepris la caractérisation d’un autre mutant, le P17C5-3, qui présentait le plus fort taux d'AsA (jusqu'à 10 fois le WT). Outre le phénotype AsA+, le mutant P17C5 présentait de fortes altérations morphologiques, notamment l’absence de graines, rendant la mise en place de la stratégie de cartographie difficile. Grâce à un croisement avec la variété commerciale M82, la mutation causale pu être identifiée dans un ORF cis-régulateur en amont de GGP. Ce résultat confirme le rôle clé de GGP dans la voie L-Galactose. Des études préliminaires liées au phénotype parthénocarpique suggèrent un problème de stérilité mâle associé aux processus de développement du pollen. Enfin, dans l’étude de la qualité des fruits après la récolte, des expériences de stress froid effectuées avec les fruits P21H6 semblent démontrer que l’augmentation de la teneur en AsA améliore la durée de conservation et la capacité de maturation des fruits. Dans l'ensemble, nos résultats confirment la position clé de la protéine GGP dans la voie de biosynthèse de l'AsA, et fournissent des outils et du matériel végétal précieux pour décortiquer la régulation de l'AsA et son rôle physiologique dans la qualité des fruits et les caractères post-récolte. / Ascorbic acid (AsA, vitamin C) is one of the most important biochemical in living organisms. Due to its high antioxidant potential, AsA represents an important trait of nutritional quality in fruits and vegetables. In addition to its beneficial health value in fruit consumption, increasing fruit AsA content would likely affect postharvest quality and resistance to pathogens. Thus, understanding the regulation of AsA accumulation in order to improve crop species of agronomical interest is an important issue in plant breeding for many fleshy fruit species. To get a better understanding of the regulation of AsA level in plants and its impact on fruit quality, a highly mutagenized EMS tomato collection (cv. Micro-Tom) was screened for AsA+ fruit mutants. This forward genetic strategy combined with a mapping-by-sequencing approach, had allowed identifying new genes related to the AsA+ trait. One of the mutant line named P21H6, displayed an AsA-enrichment 2 to 4 fold that of the WT, and was the first to be genetically characterized. It allowed highlighting a new class of photoreceptor involved in blue light sensing named SlPLP as a negative regulator of AsA accumulation in tomato. We confirmed the role of the PLP in the fruit AsA+ phenotype using a directed mutagenesis strategy, undertaking its functional characterization. We demonstrate that PLP interacts with GGP (GDP-L-galactose phosphorylase), a key enzyme of the L-Galactose pathway, under blue light control and that this interaction takes place in the cytoplasm and the nucleus. Our results strengthen the central role of GGP in the AsA biosynthesis and suggest a new regulation mechanism by blue light of the GGP function in addition to its metabolic activity. Besides we started the characterization another mutant, the P17C5-3, which displayed the highest level of AsA (up to 10 times the WT). Beyond its AsA+ content, the P17C5 mutant showed strong morphological alterations including a seedless phenotype making the mapping difficult at first. Thanks to the crossing with the commercial M82 tomato cultivar, the causal mutation was identified in a cis-acting ORF, upstream of the GGP gene. This result confirmed the key role of GGP in the L-Galactose pathway. Preliminary studies related to the parthenocarpic phenotype suggest a problem of male sterility associated with pollen development processes. Finally, in the study of the post-harvest fruit quality, chilling stress experiments carried out with the P21H6 fruits seem to demonstrate that increasing AsA content improve the fruit shelf life and its maturation capacity. Taken as a whole, our results confirmed the key position of the GGP protein in the AsA biosynthesis pathway and they provided precious tools and plant material for deciphering the regulation of AsA and its physiological role in fruit quality and post-harvest traits.

Au cours des procédés d’appertisation, qui impliquent des traitements thermiques généralement pratiqués à hautes températures, la qualité nutritionnelle des produits alimentaires est souvent altérée. En effet, certaines vitamines, telles que la vitamine C, sont très thermolabiles.L’objectif du projet PREDINUT était de proposer un outil d’aide à la décision afin de prévoir la quantité de vitamine C (marqueur de qualité nutritionnelle) détruite dans des conditions données de durée/température, afin de pouvoir optimiser les procédés.Un thermorésistomètre Mastia®, a été utilisé pour établir des conditions de température et pression représentatives des procédés d‘appertisation. L’impact de la variation de paramètres physico-chimiques tels que le pH, la concentration initiale en acide ascorbique ou encore la pression partielle en oxygène dans l’espace de tête, sur la dégradation de l’acide ascorbique a été étudié en solution modèle. Des études ont également été menées dans des produits alimentaires (purée de pomme, purée de carotte et jus de carotte) afin d’établir un profil de destruction de la vitamine C dans des aliments concrets. Dans ce projet, la plage de température étudiée est de 95 à 125 °C, le pH fixé en solution modèle est de 2,5 à 5,5 en conditions d’anaérobiose stricte, et de 3,5 en conditions d’aérobiose (3,5 étant la valeur de pH de la majorité des fruits), les concentrations initiales en acide ascorbique varient de 15 à 90 mg/100mL, et la pression partielle en oxygène de 30000 à 100000 Pa. Dans les produits alimentaires, les expériences ont été réalisées par enrichissement en acide ascorbique à hauteur de 450 mg/L, la valeur du pH ne subissant pas d’ajustement.Des modèles ont été établis pour décrire le profil cinétique de la dégradation de la vitamine C en aérobiose et en anaérobiose. En l’absence d’oxygène la dégradation de la vitamine C suit une cinétique d’ordre 1 (sauf à pH = 4,5). En présence d’oxygène (conditions aérobies) la vitesse de dégradation croit avec la pression partielle d’oxygène, mais très peu avec la température. Des ordres apparents variant de 0,5 à 0,75 en fonction de la pression partielle en oxygène dans l’espace de tête, s’avèrent mieux ajuster les données que l’ordre 1.Dans les aliments, le mécanisme de dégradation de la vitamine C apparaît beaucoup plus complexe, et la vitesse de réaction n’évolue pas de façon continue avec le temps, avec des phases de plateau suivies de réaccélérations. Une connaissance fine des mécanismes et des espèces chimiques impliquées sera nécessaire pour comprendre cette évolution. / Canning involves thermal treatments performed at high temperatures, which may alter nutrional quality of food products. Indeed, some vitamins, like vitamin C, are very heat sensitive.The aim of the project PREDINUT was to propose a decision support tool that predicts vitamin C (as indicator of nutritional quality) degradation in given conditions of time/temperature, in order to optimise processes.A thermoresistometer Mastia® was used to reach the temperature and pressure conditions encountered during canning. The impact of the variation pH, initial concentration of ascorbic acid or again partial pressure of oxygen in headspace, on ascorbic acid degradation was studied in model solution. Studies were also performed in apple puree, carrot puree and carrot juice in order to obtain a destruction profile of vitamin C in real foods. . The temperature range studied was from 95 to 125 °C, the fixed pH in model solution was from 2.5 to 5.5 in strict anaerobic conditions, and 3.5 in aerobic conditions (3.5 being the pH value of common fruits), initial concentrations of ascorbic acid varied from 150 to 900 mg/100mL, and the partial pressure of oxygen from 30000 to 100000 Pa. Foods were enriched in ascorbic acid (up to 450 mg/mL), and the pH value was not adjusted.Models were established to describe the kinetics of vitamin C degradation in aerobiosis and anaerobiosis. En absence of oxygen ascorbic acid degradation was well described by a first order kinetics (except at pH = 4.5). In presence of oxygen the degradation speed increased with head-space oxygen’s partial pressure but very little with temperature. Apparent reaction orders varying from 0.5 to 0.75, depending on the partial pressure of oxygen in the headspace, fitted the data better than first-order.In foods, degradation kinetics of vitamin C appeared more complex, with eventual presence of plateaus followed by acceleration of the reaction. Definitely more knowledge on mechanisms is needed to predict ascorbic acid degradation in real foods.

L’acide ascorbique (AsA) est un antioxydant essentiel à la fois pour l’homme et les végétaux. L’AsA provenant des plantes représente la source principale de vitamine C dans l’alimentation quotidienne. Au-delà de son impact nutritionnel, augmenter la teneur en AsA dans le fruit de tomate serait susceptible d’influencer la qualité des fruits après la récolte, en termes de conservation mais également de résistance à des pathogènes. Bien que le métabolisme de l’AsA soit bien caractérisé, les mécanismes impliqués dans sa régulation restent jusqu'à présent peu compris. Des études récentes menées sur des feuilles d’Arabisdopsis thaliana montrent que certaines protéines seraient capables de réguler la teneur en AsA, en agissant au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. A ce jour, ce type de régulation n’a pas été encore décrit chez les fruits. Dans ce but, une approche de génétique directe a été développée afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la teneur en AsA et ceci dans le fruit de tomate (Solanum lycopersicum). L’analyse d’une population de mutants EMS de tomate Micro-Tom a permis l’identification de lignées de mutants présentant des teneurs en AsA de 2,5 à 4 fois plus importantes que celles observées dans les fruits de tomate sauvage. La caractérisation de ces lignées a conduit à des résultats prometteurs pour l’étude de la qualité des fruits après la récolte. Une stratégie de NGS-mapping a permis l’identification des mutations causales responsables du phénotype AsA observé. Ainsi, le criblage de mutants EMS a permis la découverte de nouvelles protéines inattendues, permettant de confirmer au niveau moléculaire l’existence d’une interaction directe en la signalisation lumineuse et la régulation de la voie de biosynthèse de l’AsA. / The ascorbic acid (AsA) is an essential antioxidant in both plants and humans. Plant-derived AsA is the major source of vitamin C in the human diet. In addition to its effect on tomato nutritional value, increasing tomato AsA content would likely affect postharvest storage and resistance to pathogens of the fruit. While AsA metabolism is well characterized, the mechanisms involved in its regulation remain poorly understood. Recent studies in Arabidopsis leaves indicate that few regulatory proteins can regulate this pathway at transcriptional and post-transcriptional levels. Still nothing equivalent has been described in fruits. In that aim, a forward genetic approach has been carried out to investigate the regulation of AsA in tomato (Solanum lycopersicum) fruit. The screening of an EMS tomato mutant population in the miniature cultivar Micro-Tom for identifying mutant lines with AsA-enriched fruits was done. Among the 500 M2 mutant families screened, four mutant lines with higher AsA content ranging from 2.5 to 4 fold were selected. These mutant lines have been characterized for postharvest traits quality and showed promising results. A method based on NGS-mapping allowed the identification of the putative AsA-enriched related gene. Thus, the screening of EMS mutants led to original findings such as the discovery of new unexpected proteins regulating AsA in plants, and particularly in fruits. Our work confirms at the molecular level the direct interaction between light signaling component and the regulation of the AsA biosynthesis pathway.

Parmi les maladies affectant les pommes, la moisissure bleue causée par Penicillium expansum est une préoccupation majeure. Elle cause des pertes de rendement et de qualité dues également à la production de mycotoxines telles que la patuline (PAT) et la citrinine (CIT). La PAT est la plus alarmante en raison de ses propriétés cytotoxiques, génotoxiques et immunosuppressives.L'Union européenne (UE) a établi des réglementations spécifiques pour protéger la santé des consommateurs et des niveaux maximaux de 50 g / kg sont fixés pour les jus de fruits et les produits dérivés, 25 g / kg pour les purées de pommes et les compotes et 10 g / kg pour les aliments destinés aux bébés et aux jeunes enfants. En dépit de ces mesures, la PAT continue à être présente dans les aliments et / ou les boissons commerciaux, dépassant parfois les limites maximales. Des recherches supplémentaires sont par conséquent nécessaires pour minimiser la contamination des produits alimentaires par cette mycotoxine et son champignon producteur. Bien que la plupart des études sur P. expansum soient essentiellement centrées sur la PAT, le génomede ce champignon présente d'autres clusters de métabolites secondaires (SM) prédits dont certains peuvent être associés à des métabolites potentiellement toxiques. Afin de contrôler la synthèse de SM, l'étude des facteurs de transcription globaux régulant leur production est essentielle. Dans une première partie, le gène veA, appartenant à la famille des protéines du complexe velvet, a été caractérisé et son impact sur le développement du champignon, sa virulence et son métabolisme secondaire a été élucidé. La délétion de ce gène a conduit à une réduction de la production de PAT et de CIT et à une diminution de l'expression de leurs clusters de gènes. VeA a également un impact global sur le métabolisme secondaire, puisque 15 des 35gènes de structure présentent une régulation différentielle sur les milieux testés. Dans une deuxième partie, l’influence de l’acide ascorbique (AA) sur la concentration de PAT dans le jus de pomme trouble a été étudiée à la fois en laboratoire et en milieu semi-industriel. Une méthodologie analytique séparant la PAT et d'autres composés générés au cours de la réaction aété optimisée. Les conditions optimales d'action de l’AA sur la PAT ont été analysées. De plus,nous avons identifié des produits de dégradation moins toxiques que la PAT et résultant du traitement par l’AA. Pour conclure, cette thèse se rattache à la gestion des risques de la PAT dans le secteur des fruits ; elle apporte des connaissances et des améliorations significatives tant sur le plan fondamental que sur le plan pratique. Ces avancées résident principalement dans la description d'une souche mutée de P. expansum moins toxique que celle naturellement retrouvée dans la nature, et décrivant un additif alimentaire améliorant les qualités de nombreux produits transformés et diminuant la concentration de PAT en générant des composés moins toxiques. / Among diseases affecting apples, blue mould caused by Penicillium expansum is a major concern. It causes yield and quality losses, as well as food safety issues due to the production of mycotoxins such as patulin (PAT) and citrinin (CIT). PAT is the most worrying one and has cytotoxic, genotoxic and immunosuppressive properties. The European Union (EU) has established specific regulations to protect the consumer’s health and maximum levels of PAT of 5 g/kg is set for fruit juices and derived products, 25 g/kg for apple purees and compotes and 10g/kg for food intended for babies and young children. However, PAT is still found in commercial food and/or beverage products, sometimes exceeding the maximum limits and more research is needed to minimize contamination of food products by this mycotoxin and its fungus. Even though most studies on P. expansum have focused on PAT itself, the genome of this fungus exhibits other predicted secondary metabolite (SM) clusters, some of which may be associated with potentially toxic metabolites. In order to control the synthesis of SMs, the study of global transcription factors regulating their production is essential. In a first part, the veA gene, belonging to the velvet family, was characterised and its impact on the development of the fungus, its virulence and its secondary metabolism was elucidated. The disruption of this gene led to the failure in PAT and CIT production and a decrease in the expression of their gene cluster. It also revealed a global impact on the secondary metabolism, as 15 of 35 backbone genes showed differential regulation on the media tested. In a second part, the influence of ascorbic acid (AA) on the concentration of PAT in cloudy apple juice was studied on both lab and semi-industrial scale. An analytical methodology separating PAT and other compounds generated during the reaction was optimized. Optimal conditions of action of AA on PAT were studied. In addition, degradation products less toxic than PAT and resulting from AA treatment were identified. To conclude, this thesis is part of the risk management of PAT in the fruit sector; it provides significant improvements at both fundamental and practical levels. These advances are mainly characterized by the description of a mutated strain of P. expansum that is less toxic than that naturally occurring in nature, and the description of a food additive that improves numerous products qualities and affects PAT concentration, thusgenerating less toxic compounds

Les protéines extraites des végétaux sont des matériaux relativement peu coûteux, non toxiques, biocompatibles et biodégradables. Elles représentent une bonne alternative aux protéines d’origine animale et aux polymères dérivés du pétrole. Dans le cadre de cette étude, les protéines extraites de graines de soja et de tournesol ont été utilisées en tant que matériaux enrobants pour la microencapsulation de la matière active hydrophobe (α-tocophérol) ou hydrophile (acide ascorbique) par le procédé d’atomisation. Les protéines de soja sont largement utilisées dans les applications alimentaires et non-alimentaires, notamment en microencapsulation. Elles sont donc étudiées dans ce travail comme matériau enrobant de référence. Les protéines de tournesol n’ont quant à elles pas d’application industrielle concrète, si ce n’est sous la forme de tourteaux dans l’alimentation animale. C’est pourquoi il nous semble pertinent de trouver des nouvelles voies de valorisation pour ce coproduit d’origine agricole. Plusieurs modifications des protéines, telles que l’hydrolyse enzymatique, l’acylation, la réticulation enzymatique et la cationisation ont été étudiées dans le but d’améliorer les propriétés encapsulantes du matériau enrobant. Dans le contexte de la chimie verte, toutes les modifications ont été effectuées sans utilisation de solvants organiques ni de catalyseurs chimiques. L’influence des modifications chimiques et enzymatiques des protéines, et des paramètres du procédé (pression d’homogénéisation, ratio matériau enrobant/matière active et concentration en protéines) sur les différentes caractéristiques des préparations liquides et des microparticules (viscosité, taille des gouttelettes dans le cas des émulsions, morphologie et taille des microparticules), ainsi que sur les paramètres liés au procédé d’atomisation (rendement et efficacité de microencapsulation) a été particulièrement étudiée au cours de ce travail. Les résultats obtenus confirment que l’extrait protéique de tournesol est tout à fait pertinent comme matériau enrobant et permet d’obtenir des efficacités de microencapsulation significativement plus élevées par rapport à celles obtenues avec l’extrait protéique de soja. / Proteins extracted from vegetables are relatively low-cost, non-toxic, biocompatible and biodegradable raw materials. They represent a good alternative to animal-based proteins and petroleum-extracted polymers. In this study, proteins derived from soybean and sunflower seeds were used as wall materials for microencapsulation of hydrophobic (-tocopherol) or hydrophilic (ascorbic acid) active material by spray-drying technique. Soybean proteins are widely used in food and non-food applications, especially in microencapsulation. They were studied in this work as wall material of reference. Sunflower proteins are not actually used in industrial application, but only in the form of oil-cake for animal feeding. That’s why new ways of valorization of this agricultural by-product should be investigated. Several proteins’ modifications such as enzymatic hydrolysis, acylation, cross-linking and cationization were studied in order to improve encapsulating properties of wall material. In the context of green chemistry, all the modifications and preparations were performed without use of organic solvents and chemical catalysts. The effect of protein chemical and enzymatic modifications, and process parameters (homogenization pressure, wall/core ratio and protein concentration) on different characteristics of liquid preparations and microparticles (viscosity, emulsion droplet size, microparticle size and morphology) and on parameters related to the spray-drying process (yield and efficiency of microencapsulation) was particularly investigated in this study. The obtained results confirmed that sunflower proteins are quite suitable as encapsulating agent and provide the microencapsulation efficiencies significantly higher compared to those obtained with soy proteins.

Nous démontrons qu'il est possible de former des bicouches fluides non phospholipides en milieu aqueux avec un mélange d'acide palmitique (PA), cholestérol (Chol) et sulfate de cholestérol (Schol) avec une proportion molaire de 30/28/42. Ces liposomes non phospholipidiques peuvent maintenir un gradient de pH (pHinterne 8 / pHexterne 6) sur une période 100 fois plus longue que les liposomes faits de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de cholestérol (60/40 mol/mol). De plus, ces LUV non phospholipidiques protègent l'acide ascorbique d'un milieu oxydant (1 mM de fer (III)). Une fois piégé dans les liposomes, l'acide ascorbique présente une vitesse de dégradation similaire à celle obtenue en l'absence de fer(III). Ces performances illustrent la perméabilité exceptionnellement limitée de ces liposomes, ce qui implique qu'ils peuvent présenter des avantages comme nanocontenants pour certaines applications. D'autre part, des vésicules unilamellaires géantes (GUV pour Giant Unilamellar Vesicles) ont été formées à partir d'un mélange d'acide palmitique et de cholestérol (30/70 mol/mol). Ces GUV sont stables sur l'échelle de temps de semaines, elles ne s'agrègent pas et elles sont sensibles au pH. Afin d'établir la formation des GUV, l'imagerie par microscopie confocale à balayage laser a été utilisée. Deux sondes fluorescentes ont été utilisées: le rouge du Nile, une sonde hydrophobe qui s'insère dans le cœur hydrophobe des bicouches lipidiques, et la calcéine, une sonde hydrophile qui a été emprisonné dans le réservoir interne des GUV. Cette approche a permis l'observation des parois des GUV ainsi que de leur contenu. Ces résultats montrent la possibilité de former de nouveaux microcontenants à partir d'un mélange d'un amphiphile monoalkylé et de stérol. / First, we demonstrate that it is possible to form non-phospholipid fluid bilayers in aqueous milieu with a mixture of palmitic acid (PA), cholesterol (Chol), and cholesterol sulfate (Schol) in a molar proportion of 30/28/42. These non-phospholipid liposomes can sustain a pH gradient (pHinternal 8 / pHexternal 6) 100 times longer than LUVs made of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and cholesterol (60/40 mol/mol). These non-phospholipid LUVs are shown to protect ascorbic acid from an oxidizing environment (1 mM Iron (III)). Once entrapped in these liposomes, ascorbic acid displays a degradation rate similar to that obtained in the absence of Iron (III). This ability illustrates the exceptionally limited permeability of these liposomes, indicating that they can present advantages as nanocontainers for some applications. Second, Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) were formed from a mixture of palmitic acid and cholesterol (30/70 mol/mol). These GUVs were stable over weeks, did not aggregate, and were pH-sensitive. In order to establish their formation, confocal laser scanning microscopy imaging was carried out. Two fluorescent probes were used: Nile Red, a hydrophobic probe that inserted in the hydrophobic core of lipid bilayers, and calcein, a hydrophilic probe that was trapped in the GUV internal pool. This approach allowed observation of both the walls of the GUVs as well as their entrapped content. These results show the possibility to form novel microcontainers from a mixture of a monoalkylated amphiphile and sterols.

Nous démontrons qu'il est possible de former des bicouches fluides non phospholipides en milieu aqueux avec un mélange d'acide palmitique (PA), cholestérol (Chol) et sulfate de cholestérol (Schol) avec une proportion molaire de 30/28/42. Ces liposomes non phospholipidiques peuvent maintenir un gradient de pH (pHinterne 8 / pHexterne 6) sur une période 100 fois plus longue que les liposomes faits de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de cholestérol (60/40 mol/mol). De plus, ces LUV non phospholipidiques protègent l'acide ascorbique d'un milieu oxydant (1 mM de fer (III)). Une fois piégé dans les liposomes, l'acide ascorbique présente une vitesse de dégradation similaire à celle obtenue en l'absence de fer(III). Ces performances illustrent la perméabilité exceptionnellement limitée de ces liposomes, ce qui implique qu'ils peuvent présenter des avantages comme nanocontenants pour certaines applications. D'autre part, des vésicules unilamellaires géantes (GUV pour Giant Unilamellar Vesicles) ont été formées à partir d'un mélange d'acide palmitique et de cholestérol (30/70 mol/mol). Ces GUV sont stables sur l'échelle de temps de semaines, elles ne s'agrègent pas et elles sont sensibles au pH. Afin d'établir la formation des GUV, l'imagerie par microscopie confocale à balayage laser a été utilisée. Deux sondes fluorescentes ont été utilisées: le rouge du Nile, une sonde hydrophobe qui s'insère dans le cœur hydrophobe des bicouches lipidiques, et la calcéine, une sonde hydrophile qui a été emprisonné dans le réservoir interne des GUV. Cette approche a permis l'observation des parois des GUV ainsi que de leur contenu. Ces résultats montrent la possibilité de former de nouveaux microcontenants à partir d'un mélange d'un amphiphile monoalkylé et de stérol. / First, we demonstrate that it is possible to form non-phospholipid fluid bilayers in aqueous milieu with a mixture of palmitic acid (PA), cholesterol (Chol), and cholesterol sulfate (Schol) in a molar proportion of 30/28/42. These non-phospholipid liposomes can sustain a pH gradient (pHinternal 8 / pHexternal 6) 100 times longer than LUVs made of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and cholesterol (60/40 mol/mol). These non-phospholipid LUVs are shown to protect ascorbic acid from an oxidizing environment (1 mM Iron (III)). Once entrapped in these liposomes, ascorbic acid displays a degradation rate similar to that obtained in the absence of Iron (III). This ability illustrates the exceptionally limited permeability of these liposomes, indicating that they can present advantages as nanocontainers for some applications. Second, Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) were formed from a mixture of palmitic acid and cholesterol (30/70 mol/mol). These GUVs were stable over weeks, did not aggregate, and were pH-sensitive. In order to establish their formation, confocal laser scanning microscopy imaging was carried out. Two fluorescent probes were used: Nile Red, a hydrophobic probe that inserted in the hydrophobic core of lipid bilayers, and calcein, a hydrophilic probe that was trapped in the GUV internal pool. This approach allowed observation of both the walls of the GUVs as well as their entrapped content. These results show the possibility to form novel microcontainers from a mixture of a monoalkylated amphiphile and sterols.