Les cellules souches embryonnaires (ES) murines peuvent être différenciées in vitro en une population homogène de neurones glutamatergiques semblables aux neurones présents dans le cortex in vivo, suite à un traitement par l’acide rétinoïque (AR). Bien que le rôle de l’AR soit bien étudié, les facteurs qui spécifient le destin neuronal ne sont pas connus. Nous montrons ici que Pou3f2 (Brn2) est un facteur essentiel à la différenciation neuronale des cellules ES in vitro. L’utilisation de l’approche de différenciation in vitro associée à des techniques de génomique à haut débit (RNA-seq, ChIP-seq) a permis d’identifier des gènes régulés directement ou indirectement par Brn2. Parmi ces gènes se trouvent Ascl1, Hes5 ou Pou6f1, qui sont des gènes clés dans la neurogenèse. La comparaison de nos données avec des expériences précédemment publiées nous a permis d’identifier un nombre restreint de gènes cibles de Brn2 quelque soit le protocole de différenciation utilisé. Parmi ces gènes se trouve Zic1. Nous montrons que Zic1 coopère avec Brn2 pour spécifier le destin neuronal des cellules ES in vitro. / Mouse embryonic stem (ES) cells can be differentiated in vitro into a highly homogenous population of glutamatergic neurons, similar to those present in the cerebellar cortex by treatment with retinoic acid (RA). While the role of RA in differentiation is well studied, the downstream factors that specify the neural fate of the ES cells are not known. Here we show that Pou3f2 (Brn2), with a known role in neuronal differentiation in vivo, is essential for neuronal differentiation of ES cells in vitro. Using our in vitro differentiation protocol combined with high throughput techniques (RNA-seq, ChIP-seq) we show that Brn2 directly and indirectly regulates a set of target genes with essential roles in neurogenesis such as Ascl1, Hes5 or Pou6f1. Integration of these results with previously published datasets allowed us to identify a core set of Brn2 target genes common to each differentiation model. Amongst these is transcription factor Zic1. We show that Zic1 and Brn2 cooperate to specify the neural fate of RA-treated ES cells in vitro.

Au courant du demi-siècle dernier, le déclin des espèces et des populations d'amphibiens est devenu un problème bien réel. Aujourd'hui, la science propose de nombreux facteurs tant environnementaux qu'anthropiques pour expliquer ce phénomène. Parmi ceux-ci, la contamination des milieux aquatiques par les pesticides et fertilisants agricoles semble corréler tout particulièrement. D'ailleurs, plusieurs cas de malformations aux membres ont été répertoriés chez des grenouilles vivant en zones agricoles. Ce phénomène pourrait compromettre, entre autres, le succès reproductif des populations et par conséquent la survie des espèces dans le milieu. Le type d'anomalie rapporté rappelle fortement celui provoqué lors d'un débalancement dans l'homéostasie de l'acide rétinoïque (AR). Les rétinoïdes sont des molécules endogènes responsables d'un grand nombre de processus physiologiques d'importance, et parmi ces molécules, l'AR joue un rôle crucial au moment de la morphogenèse. Ses effets sont assurés par sa liaison à des récepteurs nucléaires spécifiques. La synthèse et le catabolisme de l'AR sont finement régulés étant donné la forte activité nucléaire de la molécule. Un léger déséquilibre dans le métabolisme de l'AR peut donner lieu à de graves conséquences sur le développement embryonnaire d'un organisme. Certains pesticides sont connus pour interférer dans le métabolisme et les voies de signalisation de l'AR. L'hypothèse de départ du projet postule que le mélange de pesticides et de fertilisants auquel les amphibiens sont exposés dans les plans d'eau avoisinant les terres agricoles provoque une perturbation du métabolisme des rétinoïdes en altérant le travail d'enzymes-clefs. C'est ainsi que des concentrations anormales d'AR seraient à la base des effets tératogènes observés sur le terrain. Pour vérifier cette hypothèse, des essais enzymatiques ont été effectués pour juger l'efficacité enzymatique des cytochromes P450 à cataboliser l'AR en un métabolite secondaire majeur, l'acide tout-trans-4-oxo-rétinoïque (tt-4-oxo-AR), sur des animaux provenant d'habitats contaminés selon un gradient d'activité agricole. Le choix du modèle amphibien s'est arrêté sur le ouaouaron (Rana catesbeiana). En effet, la présente étude s'inscrit dans le « Projet Amphibien », une grande étude toxicologique portant sur la santé du ouaouaron vivant en milieu agricole, dans le bassin versant de la rivière Yamaska, au Québec. La caractérisation partielle de l'activité catabolique des microsomes hépatiques de ouaouaron sur l'AR a permis, pour la première fois, la mise en évidence d'un substrat préférentiel, la détermination de valeurs de Km et Vmax et la démonstration de l'implication des enzymes du CYP450 dans cette réaction. De façon générale, l'activité d'oxydation chez les mâles était plus importante que chez les femelles, malgré un poids du foie et des concentrations en protéines microsomales plus faibles et ce, pour les deux années d'échantillonnage. Les résultats suggèrent aussi une stimulation du catabolisme hépatique de l'AR par les microsomes hépatiques des ouaouarons provenant des sites les plus contaminés. Aussi, ayant une taille significativement plus faible, les grenouilles des sites fortement contaminés semblaient connaître certains problèmes de croissance. L'étude comparative de l'efficacité d'oxydation de l'AR chez le ouaouaron de la rivière Yamaska aura donc permis de cerner davantage l'un des mécanismes impliqués dans la tératogénie associée à un débalancement dans les concentrations effectives d'AR. Dans la seconde partie du projet, le catabolisme de l'AR a été tenté sur un modèle cellulaire choisi, les cellules P19. Cette exploration avait pour objectif de reproduire et maximiser un protocole d'oxydation de l'AR sur des cellules répondant à cette molécule, de façon à l'utiliser ultérieurement pour étudier les bases moléculaires derrière le métabolisme de l'AR. La culture des cellules P19, l'extraction de microsomes à partir de ces cellules et l'activité catabolique de l'AR en essais enzymatiques ont été investigués selon un protocole déjà établi. Les premières expériences n'ayant pas fonctionné, un prétraitement des cultures à l'AR a été expérimenté. Le taux de mortalité dans les cultures suite à cette pré-exposition s'est vu augmenter. De plus, bien que quantifiable, les concentrations de produits formés (tt-4-oco-AR) étaient très faibles et les résultats rarement reproductibles. Suite à ces constatations, une mise au point de la méthode d'extraction des microsomes dans le but d'augmenter le rendement des protéines microsomales à partir des cellules a été suggérée pour de futures tentatives. Aussi, des essais sur les homogénats cellulaires seraient à prévoir pour tenter de maximiser la réponse enzymatique. Malgré tout, l'utilisation des cellules P19 pour l'étude des mécanismes sous-jacents à l'émergence des malformations associées à l'AR observées chez les amphibiens en milieu agricole s'avère une avenue prometteuse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acide rétinoïque, CYP450, acide 4-oxo-rétinoïque, microsomes hépatiques, Rana catesbeiana, contaminants agricoles, cellules P19.

Les maladies cardiovasculaires sont une des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés. L'infarctus du myocarde provoque la mort d'un grand nombre de cellules cardiaques, diminuant la qualité de vie des gens qui survivent à une telle attaque. La transplantation d'un organe entier présente des limites telles que la faible quantité de donneurs et la possibilité de rejet par l'organisme du receveur. Le cœur possède une capacité de se régénérer mais le nombre de cellules souches résidentes pouvant accomplir cette tâche apparaît être insuffisant. Afin d'aider à la régénération, des approches thérapeutiques tentent l'implantation de cellules fonctionnelles dans la zone infarcie. Les cellules implantées sont, entre autres, des myoblastes squelettiques, des cellules souches embryonnaires ou adultes (cellules souches mésenchymateuses) indifférenciées, des cardiomyocytes fœtaux. Les résultats positifs parfois obtenus ont vite fait passer ces études des animaux à l'humain. La mise au point de thérapies cellulaires efficaces pour le cœur nécessite la compréhension des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation et la morphogénèse cardiaques, et l'habileté à manipuler ces mécanismes. Les cellules de carcinome embryonnaire P19, un modèle de cellules souches embryonnaires (ES), peuvent se différencier en cardiomyocytes lorsqu'elles sont traitées avec l'acide rétinoïque (AR) ou l'ocytocine (OT). Des cellules de muscle squelettique sont aussi générées. D'autre part, l'AR permet la différenciation de cellules ES en adipocytes et l'OT inhibe la maturation finale de pré-adipocytes. Nous avons émis l'hypothèse que l'AR et l'OT peuvent induire les cellules P19 à générer, de façon concomitante mais dans des rapports différents, des adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. De plus, des analogues de l'AR capables d'activer préférentiellement les récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR) ou les récepteurs de rétinoïdes-X (RXR) pourraient influencer les rapports mésodermiques. Enfin, les kinases ERK1/2 et P38, des protéines-kinases activées par des mitogènes (MAPK), pourraient avoir un rôle dans la différenciation mésodermique induite par l'AR et l'OT. Des marqueurs ont servi à identifier les phénotypes cellulaires : PPARy, aP2, lipoprotéines-lipase et gouttelettes lipidiques colorables à l'huile rouge pour les adipocytes; MyoD et α-actinine sarcomérique pour les cellules de muscle squelettique; troponine I cardiaque (cTpnI), chaîne légère de la myosine cardiaque-2v et α-actinine sarcomérique pour les cardiomyocytes. La culture en agrégats de cellules P19 pendant sept jours, avec une induction à l'AR entre les jours deux (J2) et J5, suivie d'une période de maturation de 20 jours en présence d'insuline et de l'hormone thyroïdienne T3 permet d'obtenir des adipocytes. Des cellules battantes exprimant l'α-actinine sarcomérique sont aussi générées. Une importante proportion de ces cellules montre la forme allongée ou fibrillaire caractéristique de myocytes squelettiques. Une faible proportion a une forme arrondie et exprime la cTpnI, indiquant la génération de cardiomyocytes. L'induction des cellules P19 avec l'AR, à J2, a donc un effet mésodermique large. L'ajout d'OT au milieu de maturation n'augmente pas la proportion de cellules cardiaques par rapport aux cellules musculaires squelettiques ou aux adipocytes. L'AR agit principalement en se liant aux RAR et RXR. Pour activer de façon spécifique chacune de ces deux familles de récepteurs, nous avons remplacé l'AR comme agent inducteur par le LG100268, un agoniste spécifique des RXR, ou par le TTNPB, un agoniste spécifique des RAR. Le LG100268 génère des adipocytes et des myocytes aussi efficacement que l'AR. Le TTNPB est un agent adipogénique plus efficace que l'AR mais inhibe la myogenèse. Les influences mésodermiques différentes des trois agents sont associées à des actions différentes sur ERK1/2 et P38. Ainsi, l'AR et le LG100268 diminuent similairement phospho-ERK1/2 et augmentent similairement phospho-P38. Par contre, le TTNPB, le rétinoïde le plus efficace à diminuer phospho-ERK.1/2, n'a pas stimulé la phosphorylation de P38. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 ou de P38 pendant le traitement des cellules avec l'AR a augmenté le rendement myogénique, et l'inhibition de P38 a, de plus, augmenté le rendement adipogénique. La voie des RXR est permissive à la fois à l'adipogenèse et à la myogenèse alors que celle des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse. P38 serait un régulateur négatif de l'adipogénèse. La différenciation à base d'OT produit des cardiomyocytes et, dans une moindre mesure, des cellules de muscle squelettique. L'OT est ajouté durant les quatre jours de l'agrégation et la période de maturation est de dix jours. Les rendements myogéniques sont faibles et nous avons pensé que l'ajout d'AR à l'OT pouvait les augmenter. Lorsqu'il est ajouté dès le J0 du traitement des cellules avec l'OT (addition précoce), l'AR inhibe la myogenèse. Cette inhibition est reliée aux RAR puisqu'elle est reproduite par le TTNPB et non le LG100268. Étonnamment, l'AR ajouté au J2 du traitement avec l'OT (addition tardive) fait plus que doubler le rendement des cellules musculaires, spécialement celui des cellules de muscle squelettique. L'AR a donc un effet dual, temporellement régulé, sur l'action myogénique de l'OT. Un tel effet est aussi observé sur la phosphorylation d'ERK1/2. OT stimule cette phosphorylation, et la stimulation est fortement inhibée par l'addition précoce mais non tardive d'AR. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 abolit l'action myogénique d'OT. Par contre, l'ajout d'un activateur indirect d'ERK2 à la combinaison "OT + AR tardif" augmente la phosphmylation d'ERK1/2 ainsi que le rendement en cardiomyocytes. Des niveaux de phospho-ERK1/2 sont critiques pour la myogénèse et pour les rendements respectifs en cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. En conclusion, les cellules P19 génèrent adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique de façon concomitante lorsqu'elles sont induites avec l'AR. Dans ce processus, l'activation des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse alors que celle des RXR permet l'adipogenèse et la myogenèse. L'action antimyogénique de l'activation des RAR est aussi observée en présence d'OT, cependant cette action ne se manifeste que si l'activation est faite tôt (J0). AR et OT influencent chacun la phosphorylation de MAPK et, réciproquement, leur action mésodermique est influencée par des modulateurs pharmacologiques de ces kinases. Le sens des influences peut cependant différer. Ainsi, les meilleurs rendements myogéniques ont été observés pour les traitements suivants : "AR + inhibiteur d'ERK (J2 à J5)", "AR + inhibiteur de P38 (J2 à J5)", "OT (J0 à J4) + AR (J2 à J4)", "OT + activateur d'ERK (J0 à J4) + AR (J2 à J4)". La modulation de l'activité des voies RAR, RXR et MAPK a une influence sur les rendements myogéniques et adipogéniques ainsi que sur les rendements en cardiomyocytes et en cellules de muscle squelettique. Le sens de l'influence dépend de la fenêtre temporelle de la modulation et de la présence ou non de l'OT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cardiomyocytes, Cellules de muscle squelettique, Adipocytes, Acide rétinoïque, Ocytocine, Rétinoïdes, MAPK, ERK, P38, PCR, Immunobuvardage, Cytofluorescence, Cytochimie

L'acide rétinoïque (AR) joue un rôle important dans plusieurs processus cellulaires à travers la régulation de la différentiation cellulaire, de la prolifération et de l'apoptose. Ces propriétés sont à la base de l'utilisation de l'AR dans le traitement de plusieurs cancers dont la leucémie aiguë promyélocytaire. Décrypter comment l'AR contrôle l'expression de gènes spécifiques est un défi permanent pour l'étude des cancers. Les effets de l'AR sont médiés in vivo principalement par les récepteurs à l'acide rétinoïque (RARs). Il a été récemment démontré que la phosphorylation des RARs par différentes kinases est une étape nécessaire dans la régulation de leurs fonctions. Dans ce contexte, ma thèse a porté sur l’étude des mécanismes moléculaires de la régulation par phosphorylation des RARs. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux aspects : l’effet de la phosphorylation sur le domaine de liaison au ligand (LBD) et sur le domaine N-terminal (NTD). Dans le cas du LBD, la phosphorylation induit la fixation de la Cycline H qui est une sous-unité du facteur de transcription TFIIH, alors que la phosphorylation du NTD induit une diminution d’affinité de liaison à la Vinexine beta qui est un co-répresseur. Nous avons étudié les effets de la phosphorylation par des simulations de dynamique moléculaire. Cette technique permet de caractériser la dynamique structurale et de quantifier les interactions qui stabilisent les états phosphorylés et non phosphorylés. Ce projet a permis de définir les bases moléculaires de la communication entre le RA et les cascades de phosphorylation et d’obtenir des informations originales sur des mécanismes régulateurs d’une grande importance. / Retinoic Acid (RA) plays a critical role in many cellular processus through regulatory effects on cellular differentiation, proliferation and apoptosis. This proprety is at the basis of RA therapy in the treatment of several diseases and cancers such as Acute Promyelocytic Leukemia. Deciphering how RA controls the expression of specific subsets of genes is therefore a permanent challenge in oncology. The effects of RA are mediated in vivo by the retinoic acid receptor (RAR), which consistsof three subtypes. A new concept has recently emerged according to which phosphorylation of RARs by different kinases is a necessary step in the regulation of their function. In this context, the specific aim of this thesis was the elucidation of the molecular mechanisms of the regulation of RAR mediated by phosphorylation. In particular, we focused on two aspects, the effects of phosphorylation of the ligand binding domain (LBD) and the effects on the N-terminal domain (NTD). In the case of the LBD, phosphorylation enhanced binding to cyclin H, a component of the TFIIH transcription factor, while phosphorylation of the NTD decreased binding to vinexinB, a corepressor protein. We used molecular dynamics simulations to characterize the structural dynamics of these proteins in both phosphorylated and unphosphorylated states and to quantify theirinteractions. From this project, we were able to define the molecular basis of the communication between RA-induced phosphorylation cascades and regulatory mechanisms of high importance.

Le système nerveux est responsable de l’interconnexion interne des animaux multicellulaires. Il leur permet en effet d’intégrer les activités physiologiques de leurs différentes composantes en une seule entité fonctionnelle, capable d’interagir avec son environnement. L’évolution et le développement des systèmes nerveux complexes comptent parmi les questions les plus fascinantes de la recherche en biologie. Afin de mettre en place une diversité de types de cellules neurales et de connexions neurales, les animaux métazoaires ne déploient qu’un nombre étonnamment réduit de signaux développementaux. C’est l’intermodulation dynamique de ces signaux qui va pouvoir induire un patron spatial d’identités et de comportements cellulaires distincts. L’acide rétinoïque (AR) est une petite molécule diffusible dérivée de la vitamine A qui contribue à la mise en place des axes du système nerveux central des vertébrés et est un régulateur crucial de la différentiation neuronale. D’autre part, il a été montré que les signaux à l’AR affectaient le phénotype de neurotransmetteurs exhibé par des sous-populations neuronales et jouent des rôles divers dans la morphogenèse du système nerveux périphérique issu des placodes crâniennes et des cellules des crêtes neurales. Néanmoins, bien que le rôle de l’AR dans la régionalisation du système nerveux central ait été étudié de manière extensive, nous en savons beaucoup moins au sujet de l’action de l’AR sur le développement du système nerveux périphérique, sur l’établissement des différentes identités de neurotransmetteurs, ou quant à comment ces fonctions ont évolué. Bien qu’initialement considéré comme spécifique aux vertébrés, un volume croissant de données indique désormais que l’AR serait impliqué dans le développement du système nerveux de divers taxons, tels que les cnidaires, les mollusques gastropodes ainsi que les cordés invertébrés. En particulier, l’amphioxus, céphalocordé dont l’évolution est lente, est connu pour posséder un système de signalisation à l’AR semblable à celui des vertébrés. Le génome de l’amphioxus présente un haut degré de conservation de sa synténie par rapport à celui des vertébrés et exhibe relativement peu de pertes ou de duplications indépendantes de ses gènes développementaux. Par conséquent, l’embryogenèse ainsi que la morphologie de l’amphioxus ressemble par bien des points à celles des vertébrés, ce qui facilite l’identification des traits ancestraux et dérivés et en fait donc un modèle approprié à la recherche comparative. Cette étude vise à fournir une description détaillée de différentes populations neurales au sein du système nerveux périphérique de l’amphioxus et d’explorer les rôles joués par l’AR dans ce processus. À cette fin, des analyses d’expression de gènes et d’immunohistochimie ont été utilisées, en vue d’identifier les différentes sous-populations de progéniteurs et les différents types de cellules neurales. De plus, les niveaux de signaux à l’AR ont été altérés pharmacologiquement à différents stades de développement de l’amphioxus, pour déterminer leurs effets sur la formation des populations neurales identifiées, ainsi que sur les patrons de prolifération et d’apoptose. Les résultats inclus dans ce travail révèlent la présence de différentes populations de cellules neurales chez l’amphioxus et mettent en lumière leur vraisemblable relation phylogénétique avec les structures leur correspondant chez les vertébrés. Par ailleurs, différents rôles contexte-dépendants de la signalisation à l’AR on été documentés, incluant la mise en place de frontières discrètes dans le système nerveux central et l’ectoderme de l’embryon d’amphioxus, et la régulation du développement des progéniteurs neuraux tardifs dans le système nerveux périphérique de manière spécifique à leur type cellulaire. / The nervous system provides internal interconnection to multi-cellular animals. It enables them to integrate the physiological activities of their different components into one functional entity that can successfully interact with its environment. The evolution and development of complex nervous systems is one of the most fascinating questions of biological research. In order to generate a diversity of neural cell types and neural connections, metazoan animals deploy a surprisingly small number of instructive developmental signals, which crosstalk in a dynamic manner to induce a spatial pattern of cell identities and behaviors.Retinoic acid (RA) is a small diffusible signaling molecule derived from vitamin A that contributes to the axial patterning of the vertebrate central nervous system and functions as a crucial regulator of neuronal differentiation. Moreover, RA signals have been shown to affect the neurotransmitter phenotype of specific neuronal subsets and play distinct roles during the morphogenesis of the peripheral nervous system from cranial placodes and neural crest. However, while the role of RA signaling in the regionalization of the central nervous system has been extensively studied, much less is known about its actions in cranial placodes and neural crest derivatives, in the establishment of different neurotransmitter identities, or how these functions might have evolved.Albeit initially believed to be vertebrate-specific, a growing body of evidence now implicates RA signaling in the nervous system development of various distant taxa, such as cnidarians, gastropod mollusks and invertebrate chordates. In particular, the slow evolving cephalochordates, commonly called amphioxus, are known to possess a vertebrate-like RA signaling system. The amphioxus genome has retained a high degree of synteny with vertebrate genomes and exhibits relatively little losses or independent duplications of developmental genes. Accordingly, amphioxus embryogenesis and morphology also display remarkable similarity with vertebrates, which allows the identification of ancestral as well as newly derived traits and makes these animals attractive models for comparative research.This study aims at providing a detailed description of the development of different neural cell populations in the central and peripheral nervous system of amphioxus and explores the roles played by RA signaling during this process. To this end, gene expression analyses and immunohistochemistry were used, in order to identify distinct subsets of neural progenitors and neural cell types. Furthermore, RA signaling levels were manipulated pharmacologically at different stages of amphioxus development, to assess their effects on the formation of identified neural cell populations as well as on proliferation and apoptosis patterns. The results presented in this work reveal the presence of distinct neural cell populations in amphioxus and highlight their likely phylogenetic relationships with corresponding structures in other chordates. In addition, several context-dependent functions of RA signaling were documented, which include the generation of discrete boundaries in the central nervous system and ectoderm of amphioxus embryos as well as the cell type-specific regulation of late neural progenitor development in the peripheral nervous system. The observed roles of RA signaling in the amphioxus neural tube and peripheral nervous system correspond well to those reported for the vertebrate hindbrain and cranial placodes, supporting the current hypothesis of a close evolutionary relationship between these structures and suggesting that the involvement of RA signals in their development is a conserved feature of chordates.

Les cellules satellites sont considérées comme de véritables cellules souches du muscle squelettique. Une fois transplantées dans un muscle hôte, les myoblastes, cellules filles des cellules satellites, sont capables de fusionner avec les fibres musculaires existantes, permettant ainsi de modifier de façon permanente le muscle receveur. La greffe des cellules satellites est donc une des thérapies dans la lutte contre les maladies musculaires dégénératives ou myopathies. Malheureusement les premiers essais cliniques sont décevants compte tenu en partie d’une mortalité massive au sein des myoblastes implantés. Plusieurs approches ont été développées pour réduire la mortalité des myoblastes. Notre approche a été de sélectionner et de purifier une population de cellules plus aptes à résister au stress cytotoxique. Les aldéhydes déhydrogenases (ALDH) sont une famille d’enzymes capables de détoxiquer efficacement les résidus aldéhydes générés par les espèces réactives de l’oxygène. Nous avons montré récemment que l’activité ALDH est élevée dans une majorité des myoblastes humains. Cette activité est associée à une augmentation de la survie cellulaire, ex vivo, suite à un stress oxydant induit au peroxyde d’hydrogène (H2O2) et, in vivo, lorsque les myoblastes ALDHhigh sont implantés dans des souris immunodéprimées scid. De plus, nous avons montré que la protéine Aldh1a1 est responsable de la totalité de l’activité ALDH dans les myoblastes humains. La protéine Aldh1a1 fait partie d’un sous groupe des ALDH appelées rétinaldehydes. Ces enzymes catalysent l’oxydation de la vitamine A en acide rétinoïque qui se lie et active les récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque. Dans ce projet, je vais chercher à savoir si l’activité anti-apoptotique de l’ALDH dans les myoblastes humains est dépendante de la synthèse d’acide rétinoïque. Au cours de mon stage M2R dans le laboratoire, j’ai montré que les myoblastes humains exposés à un stress oxydatif perdent leur intégrité cellulaire. Le traitement par l'acide rétinoïque protège les myoblastes humains de ce stress cytotoxique. L'analyse des transcriptomes des myoblastes traités à l’acide rétinoïque a révélé que la glutathione péroxydase 3 et la superoxyde dismutase 2, gènes codant pour des enzymes antioxydantes, sont des gènes cibles potentiels de l’acide rétinoïque. Dans ce projet, objectif 1, je propose d'étendre ces résultats aux myoblastes provenant de patients atteints de dystrophie Facioscapulohumeral (FSHD), une maladie musculaire dégénérative. Puisque l’équipe de Winokur et notre équipe ont démontré la présence d’une susceptibilité au stress oxydant dans ces myoblastes FSHD, nous postulons que la voie de signalisation des rétinoïdes pourrait stabiliser ce stress oxydatif et protègerait les myoblastes FSHD durant le processus de transplantation. Dans l’objectif 2, je vais inactiver l’expression de GPx3 et de SOD-2 en utilisant des shRNA afin de déterminer si GPX3 et SOD-2 sont responsables des effets anti-apoptotiques de l'acide rétinoïque. L’objectif 3 aura pour but de déterminer si l'acide rétinoïque améliore la survie des myoblastes sains et FSHD dans des essais de transplantation chez des souris immunodéficientes. Enfin, dans un projet à plus long terme, objectif 4, je testerais l'hypothèse que le statut en vitamine A (le précurseur de l'acide rétinoïque) est important pour la survie des cellules satellites et leur expansion chez l’adulte. Par conséquent, améliorer la survie des cellules souches musculaires afin d'augmenter la masse musculaire pourrait s'avérer être une stratégie thérapeutique importante pour contrecarrer l’évolution des dystrophies musculaires. / Mouse and human satellite cells have been shown to be functional muscle stem cells. Since myoblasts, the progeny of satellite cells can be transplanted and fuse with endogenous muscle fibers to form hybrid cells, myoblast transplantation represents a potential approach for the treatment of muscle diseases. Although other limitations, such as immune rejection or limited spread into the host tissue are also important, failure of myoblast transfer in the initial clinical trials was at least partly related to poor survival rate of transplanted myoblasts. Several approaches have been developed to reduce early loss of injected myoblasts. The approach in the laboratory was to select and purify a pool of myoblasts characterized by an improved survival response. Aldehyde dehydrogenases (ALDH) are a family of enzymes that efficiently detoxify aldehydic products generated by reactive oxygen species and might therefore participate in cell survival. Their findings indicate that high ALDH activity is present in a majority of human myoblasts. This activity is correlated ex vivo to resistance to hydrogen peroxide (H2O2)-induced cytotoxic effect and in vivo to improved cell viability when ALDHhigh myoblasts were transplanted into host muscle of immune deficient scid mice. They demonstrated that Aldh1a1 protein contributes to most if not all ALDH activity in human myoblasts. Aldh1a1 catalyzes the irreversible oxidation of vitamin A (retinol) to retinoic acid (RA) which binds and activates nuclear retinoic acid receptor (RAR)/Retinoic X receptor (RXR) heterodimers. Since high ALDH activity is correlated to improved cell viability, we will ask whether part of this biological activity is mediated by retinoic acid synthesis. In this project, we propose to determine whether retinoids (vitamin A and retinoic acid) protect human muscle precursor cells from cytotoxic damages and improved cell survival in transplantation assays. During my M2R training, I showed that human myoblasts exposed to an oxidative stress lost their integrity. Treatment with retinoic acid impaired these cytotoxic damages ex vivo. Microarray analysis of retinoic acid treated myoblasts revealed glutathione peroxidase 3 and superoxide dismutase 2, genes encoding antioxidant enzymes, as a potential RA target genes. In this project, aim 1, I propose to extend these results to myoblasts derived from patients with Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD), a muscle degenerative disease. Since the team of Winokur and our team found that FSHD myoblasts were highly susceptible to an induced oxidative stress, we postulate that retinoid signalling pathway may stabilise this oxidative stress and protect FSHD myoblasts during the process of transplantation. In aim2, I will inactivate Gpx-3 and SOD2 using shRNA to determine whether SOD-2 and GPx3 mediate the anti-apoptotic effects of retinoic acid. In the aim 3, I will determine whether retinoic acid improves myoblast survival in transplantation assays in animals. Finally, in a more long-term project, aim 4, I will test the hypothesis that vitamin A status (the precursor of retinoic acid) is important for satellite cell survival and expansion in the offspring. Therefore, manipulating cell survival in order to increase the mass of muscle produced from a pool of muscle precursor cells could be an important therapeutic strategy to counteract the course of muscular dystrophy.

Le but de toute étude en biologie évolutive du développement est l’étude des mécanismes développementaux à l’origine des diversifications morphologiques. Dans ce contexte, j’ai décidé de me focaliser sur l’émergence des Vertébrés au cours de l’évolution, par la mise en œuvre d’études comparatives entre différents modèles de Deutérostomiens. Le travail réalisé durant ma thèse est subdivisé en trois projets: (i) j’ai abordé le lien entre l’évolution du cerveau chez les Chordés et les modifications de la signalisation à l’acide rétinoïque (AR) au cours du développement. En particulier, j’ai examiné les rôles de l’AR au cours du développement du cerveau chez la lamproie Lampetra fluviatilis, et j’ai comparé les résultats obtenus chez cette espèce aux mécanismes développementaux agissant chez l’amphioxus, un Chordé invertébré, et chez les modèles gnathostomes classiques. Les données obtenues lors de ces analyses comparatives ont permis une meilleure compréhension de l’évolution de la régionalisation cérébrale chez les Vertébrés. (ii) j’ai étudié l’évolution des séquences régulatrices présentes au sein des clusters de gènes hox, connus pour agir dans la régionalisation du système nerveux des Chordés. L’identification d’éléments non-codants conservés ainsi que d’éléments de réponse à l’AR (RARE) potentiels dans des clusters hox de Chordés, combinée à la caractérisation de RAREs in vivo en cellules murines a permis une vision intégrée de l’évolution du contrôle des gènes hox par l’AR, chez les Chordés. (iii) j’ai analysé l’évolution des microARNs chez les Chordés en comparant les répertoires microARN chez plusieurs espèces de Deutérostomiens. Cette étude a permis d’émettre de nouvelles hypothèses quant à l’émergence des microARNs chez les animaux. Toutes ces analyses ont abordé différents aspects de l’évolution des Chordés avec pour objectif la proposition d’une vision intégrée des mécanismes moléculaires à l’origine de l’émergence des Vertébrés. / The aim of the evolutionary developmental biology is to study the developmental mechanisms at the base of morphological diversification. In this context, I decided to focus my attention on the emergence of vertebrates during evolution by carrying out comparative analyses in several deuterostome models. The work carried out during of my thesis can be subdivided into three major projects: (i) I addressed the link between brain evolution and modifications in retinoic acid (RA) signaling during chordate development. In particular, I investigated the roles of RA signaling in brain development in a jawless vertebrate, the lamprey Lampetra fluviatilis, and compared the results with developmental mechanisms in the invertebrate chordate amphioxus and classical developmental model systems in jawed vertebrates. Data obtained from these comparative studies provided insights into the evolution of brain patterning in vertebrate evolution. (ii) I investigated the evolution of the regulatory landscape of hox gene clusters that are known to be fundamental for the patterning of the chordate central nervous system. The identification of conserved non-coding elements and putative RA response elements (RAREs) in hox clusters of different chordate species combined with the in vivo characterization of functional RAREs in mouse F9 cells provided an integrated view of the evolution of RA-dependent hox cluster regulation in chordates. (iii) I studied the roles of microRNAs (miRNAs) in chordate evolution by comparing the miRNA complements of different deuterostome species. This analysis provided novel insights about the general mechanisms of miRNA emergence in animals and highlighted species-specific miRNA complement amplifications in different deuterostome lineages. In sum, these studies have tackled different aspects of chordate evolution from an evo-devo perspective, aiming at an integrated view of the molecular mechanisms underlying vertebrate diversification.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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