Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La perche commune, Perca fluviatilis L. est un poisson maigre (moins de 2% de lipides dans le filet) mais dont les teneurs en acides gras polyinsaturés de la famille n-3 (AGPIn-3) et principalement en acide docosahexaènoque (DHA) sont très élevées (40% des AG totaux). L’objectif de ce travail est d’étudier les facteurs qui influent sur le métabolisme lipidique chez la perche et qui assurent ces taux élevés de DHA. Les hypothèses testées qui permettraient d’expliquer les fortes teneurs en DHA sont une incorporation préférentielle de cet AG ainsi qu’une capacité, typique des poissons d’eau douce, à bioconvertir le 18:3n-3 présent dans l’alimentation en AGPI n-3 supérieur, EPA et DHA. Pour tester ces hypothèses nous avons mis en place trois expérimentations. Dans un premier temps, nous avons caractérisé les lipides des différents tissus impliqués dans le métabolisme lipidique en observant leurs teneurs en lipides totaux, neutres et polaires et leur composition en acides gras. Dans un deuxième temps nous avons déterminé et hiérarchisé les facteurs ayant un effet sur la teneur en lipides et la composition en AG en utilisant un plan d’expérience multifactorielle. Enfin, nous avons étudié plus particulièrement l’effet de la composition en acides gras de la source alimentaire sur la composition en AGPI n-3 des tissus, l’activité enzymatique et l’expression des gènes codant pour les enzymes impliquées dans la bioconversion des AG. Le génome de la perche n’étant pas séquencé pour l’instant, le premier travail a été de mettre au point les protocoles de dosage d’activité enzymatique et d’expression génique chez cette espèce. La qualité nutritionnelle de la perche a été vérifiée, avec la mise en évidence de taux élevés de DHA dans tous les tissus. Dans le muscle la teneur en lipides est stable. La teneur en AGPI est élevée (40-60% des AG totaux), avec des teneurs élevées en DHA (35-45% des AG totaux) qui est l’AG majoritaire dans ce tissu. La teneur en lipides du foie et du tissu adipeux est variable en fonction de l’aliment. Le tissu adipeux est le lieu de stockage de l’énergie, il contient entre 85-90% de lipides dont 30-50% sont sous forme mono-insaturée, principalement représentés par le 18:1n-9. Le foie a une composition en AG intermédiaire entre celle du muscle et celle du tissu adipeux, le DHA étant là aussi l’AG majoritaire. Nos résultats ont complété ceux de la littérature en donnant des informations sur la répartition et la teneur en lipides neutres et polaires des tissus (Muscle LN/LP= 50/50 ; Foie LN/LP= 60/40 ; Tissu adipeux : LN/LP= 90/10), ainsi que sur leur profil en acides gras (les lipides polaires sont composés majoritairement d’AGPI alors que les lipides neutres sont plus riches en acides gras saturés). Ils ont permis de mettre en évidence une spécificité du profil en acides gras en fonction du tissu ou du type de lipides. L’hypothèse de bioconversion des AGPI a été vérifiée puisque la delta 6 désaturase a été détectée dans le foie, l’intestin, le cerveau. De plus, son activité a été mise en évidence dans le foie. L’hypothèse d’incorporation préférentielle de certains acides gras a également été vérifiée, avec une incorporation préférentielle d’AGMI dans le tissu adipeux et d’AGPI dans le filet et le foie. Concernant l’effet des facteurs étudiés, nos résultats ont montré qu’il existe un déterminisme différent en fonction de l’acide gras.. La nature des lipides alimentaires est le facteur le plus important, il a un effet direct ou en interaction avec d’autres facteurs sur le profil en AG des tissus. Nos résultats ont montré que si l’alimentation est le facteur principal de variation, dans des conditions de croissance limitée, sur un poisson de taille commerciale, une teneur de 3% de DHA et de 2% d’EPA dans l’aliment est suffisante chez la perche pour obtenir une composition en acides gras du filet de bonne qualité pour le consommateur avec une bioconversion des AGPI n-3 limitée / Perca fluviatilis L. (Eurasian perch) is characterized by a low intramuscular amount of lipids (<2%) and a high poly-unsatured fatty acid (PUFA) content. Docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) is present in a high proportion (40% of total fatty acid). The aims of this work are twofold: first to analyse the factors that could influence the lipid metabolism of Perca fluviatilis L. and second to identify factors that could explain the elevated contents of DHA in this fish. Assumptions, which have been tested to explain the high concentration of DHA, are a selective incorporation of this fatty acid and the ability of this fish to transform 18:3n-3 present in the diet into higher PUFA n-3, EPA and DHA; typical capacity of freshwater fish (bioconversion assumption). Three experiments have been conducted to test these assumptions. First, we described lipid composition of the different tissues, which play a role in lipid metabolism, by distinguishing total, neutral and polar lipids. Second, we identified and classified the factors influencing the lipid content and fatty acid composition by using a multifactorial approach. Third, we analysed the effect of diet fatty acid composition on PUFA n-3 tissues composition, enzymatic activity and genes expression, which code for enzymes implicated in fatty acid bioconversion. As Perca fluviatilis L. genome is not sequenced for the moment, the first work was to construct experiments for dosing enzymatic activity and gene expression in this species. Concentration of DHA was elevated in all the tissues we analysed, showing the good nutritional quality of Perca fluviatilis L. In the fillet, lipid content was stable. PUFA content was high (40-60% of total fatty acid), with elevated contents in DHA (35-45% of total fatty acid), which was the main fatty acid of this tissue. Lipid content in the liver and the fat tissue was variable according to the type of food. Adipose tissue, that is the lipid storage tissue in this species, was composed of 85-90% of lipid, of which 30-50% are mono-unsatured fatty acids (MUFA), mainly 18:1n-9. Liver fatty acid composition presented characteristics in an intermediate position between fatty acid composition of the fillet and the adipose tissue, but DHA was still the most abundant fatty acid. Our results were in accordance with literature. They added informations on the distribution and the concentration in neutral and polar lipids (NL and PL) of the tissues we studied (fillet NL/PL=50/50; Liver: NL/PL=60/40; adipose tissue: NL/PL=90/10), and on their composition in fatty acid (polar lipids are mainly composed of PUFA whereas neutral lipids are richer in saturated fat acids). Our results showed that the profile in fat acid depended on the tissue and the type of lipids. Our assumption of the ability of Perca fluviatilis L. to transform PUFA was verified because we were able to detect delta 6 desaturase in the liver, intestine, and brain. Moreover, the activity of this enzyme was put in evidence in the liver. Our assumption of selective incorporation of some fatty acids was also verified, MUFA being preferentially absorbed in the adipose tissue and PUFA in the fillet and the liver. Regarding the effect of factors we studied, our results showed that a differential determinism existed according to the type of fatty acid. The nature of lipids contained in the diet was the most important factor. This factor could influence the profile of fatty acid in the tissues through a direct effect or in interaction with other factors. Although the diet is the main factor of variation, our results showed that under condition of limited growth and for a fish with a commercial size, a content of 3% of DHA and 2% of EPA in the diet was sufficient to obtain, in the fillet, a composition in fatty acids of good quality for consumers with a limited bioconversion of PUFA

La capacité des microalgues à accumuler des quantités importantes de lipides de réserve font de ces organismes de bons candidats pour envisager une production durable de biocarburants (biodiesel). Cependant, des verrous d’ordre technologique et biologique persistent avant d’atteindre une production économiquement viable. Dans le but de mieux comprendre les mécanismes et biosynthèse et d’accumulation des lipides chez les microalgues et de proposer des voies d’amélioration biotechnologiques, nous avons développé deux approches expérimentales complémentaires en utilisant la microalgue Chlamydomonas reinhardtii comme modèle. La première a été de caractériser par des techniques de protéomique et de lipidomique la composition des gouttelettes lipidiques s’accumulant en réponse à une carence en azote. Les données de protéomique nous ont permis de montrer que les gouttelettes lipidiques étaient des structures cellulaires dynamiques impliquées non seulement dans le stockage, mais aussi dans la biosynthèse, la remobilisation et le « trafficking » des lipides. Les protéines identifiées au cours de cette étude nous fournissent des gènes cibles d’intérêt pour mieux comprendre les voies de biosynthèse des triacylglycérols et accroître l’accumulation d’huile. La seconde approche, de génétique formelle, a consisté à rechercher puis à caractériser des mutants isolés à partir d’une banque de mutants d’insertion de C. reinhardtii. Deux mutants d’intérêt, l’un affecté dans la composition en acides gras (crfad7) et l’autre capable d’accumuler des lipides en l’absence de stress (coa1, pour constitutive oil accumulator 1), ont été isolés. / The ability of microalgae to accumulate high amounts of reserve lipids makes these organisms good candidates for the production of sustainable biofuel (biodiesel). However, both technological and biological bottlenecks remain to be overcome before profitable production is reached. With the aim to better understand lipid metabolic pathways in microalgae and further propose new strategies for biotechnological improvement, we have developed two complementary experimental approaches in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii. As a first approach, we performed a proteomic and lipidomic characterization of oil bodies isolated from nitrogen-deprived cells. Based on proteomic data, we have concluded that oil bodies are dynamic structures involved not only in the storage, but also in oil biosynthesis, degradation and lipid homeostasis. The proteins identified in this study should provide useful targets for genetic studies aiming at increasing our understanding of triacylglycerol synthesis and further improve intracellular oil accumulation. The second approach, based on the development of a forward genetic screen, aimed at searching and further characterizing mutants isolated from a C. reinhardtii insertion library. Two mutants of interest, one affected in the fatty acid composition (crfad7), the other (coa1, for constitutive oil accumulator 1) able to accumulate reserve lipids in the absence of stress, have been isolated. The crfad7 mutant, affected in the expression of the unique ω3 fatty acid desaturase present in the C. reinhardtii genome, has been complemented and subjected to extensive phenotypical characterization.

Les récepteurs NMDA (rNMDAs) sont des récepteurs-canaux membranaires activés par le glutamate, neurotransmetteur excitateur, et impliqués dans diverses formes de plasticité synaptique et pathologies. Ces hétérotétramères obligatoires opèrent en dimère-de-dimères, associant généralement deux sous-unités GluN1 et deux GluN2A-D. Déterminer l'arrangement spatial des sous-unités d'un rNMDA est essentiel à la compréhension des mécanismes régissant son fonctionnement et du rôle joué par les interfaces entre sous-unités et entre domaines, notamment N-terminal (NTD) et de liaison des agonistes (ABD). En combinant modélisation moléculaire, mutagenèse dirigée, biochimie sur cystéines et électrophysiologie, nous montrons que ces sous-unités s'arrangent selon un ordre alterné, avec les sous-unités identiques diamétralement opposées, et révélons l'existence d'une interface inter-dimère entre les ABDs GluN1. Nous avons aussi implémenté dans les ovocytes de Xénope une technique innovante consistant à incorporer un acide-aminé non-naturel photo-réactif (UAA) dans un rNMDA. Cette approche, basée sur l'expansion du code génétique, a permis de créer un rNMDA sensible à la lumière. L'introduction d'UAAs aux interfaces entre sous-unités GluN1 et GluN2, révèle le rôle joué par deux de ces interfaces: (1) entre les lobes supérieurs des NTDs, dans le contrôle "sous-unité spécifique" de l'activité et (2) entre les lobes inférieurs des ABDs, dans l'inhibition allostérique par le zinc. Ces travaux apportent des informations sur l'architecture moléculaire des rNMDAs et révèlent l'importance des réarrangements structuraux aux interfaces entre sous-unités voisines dans les fonctions du récepteur. / NMDA receptors (NMDARs) are excitatory neurotransmitter receptors that form glutamate-gated ion channels and are essential mediator of synaptic plasticity and brain disorders. NMDARs are obligatory heterotetramers usually composed of two GluN1 and two GluN2 (A-D) subunits. Whereas it's well established that NMDARs operate as dimers of dimers, subunit arrangement around the central pore is still debated. This issue is fundamental to understand the mechanisms which govern NMDAR functions and the role of the interfaces between subunits and between domains, including the N-terminal domain (NTD) and the agonist-binding domain (ABD). By combining computational modeling, site-directed mutagenesis, electrophysiology, and cysteine cross-linking, we show that, in a full-length heterotetrameric NMDAR, the subunit arrangement is alternated, with identical subunits facing each other, and identify a new interdimer interface between the two GluN1 ABDs. We have also used a new technique, for which we demonstrated the feasibility in Xenopus oocytes, which consists in incorporating photoreactive unnatural amino-acids (UAAs) at different positions in NMDAR subunits. This genetic code expansion enabled us to create photosensitive NMDARs and probe new interfaces between GluN1 and GluN2 and their role in (1) subunit-specific channel activity (interface between GluN1 and GluN2A-B NTDs upper lobes) and (2) zinc allosteric inhibition (interface between GluN1 and GluN2A ABDs lower lobes). Our studies provide new information about molecular architecture of NMDARs and demonstrate the importance of some structural rearrangements between subunit interfaces for the receptor functions.

Le tissu adipeux périprostatique (TAPP) est potentiellement impliqué dans l’agressivité du cancer de la prostate (CaP). Nous avons identifié une association négative entre un taux élevé d’acide linoléique (AL) et d’acide eicosapentaénoïque (EPA) dans le TAPP, l’agressivité de la maladie et la migration des cellules cancéreuses in vitro. La migration des cellules tumorales est liée au phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), induit par des facteurs du microenvironnement, dont le TGFb et l’hypoxie. Nous avons démontré dans le CaP la signification clinique de la TEM et son facteur de transcription clé Zeb1, dont l’expression augmente lors de la progression du cancer avec un impact sur la survie. Nous avons ensuite montré que l’incorporation de l’AL et de l’EPA dans la membrane plasmique des cellules cancéreuses prostatiques inhibe la migration cellulaire et l’expression de Zeb1 induite par le TGFb et l’hypoxie, in vitro et ex vivo. Nous avons également démontré que l’expression de Zeb1 est dépendante d’une entrée SOCE, impliquant le canal SK3, et régulée par l’AL et l’EPA. Cette régulation de l’entrée calcique par l’AL et l’EPA a également été observée ex vivo dans des explants de CaP humains. / Periprostatic adipose tissue (PPAT) has been suggested to be involved in the modulation of prostate cancer (PCa) progression. We demonstrated herein that low contents of linoleic acid (LA) and eicosapentaenoic acid (EPA) in PPAT are associated with PCa aggressiveness and cancer cell migration in vitro. Cell migration is linked to the process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), induced by microenvironmental factors, such as TGFb and hypoxia. We demonstrated in PCa the clinical value of EMT and its key transcription factor Zeb1, which expression increases with the stages of PCa progression, with an impact on survival. Then we have shown, in vitro and ex vivo, that the incorporation of LA and EPA into the plasma membrane of PCa cells inhibits TGFb- and hypoxia-induced cell migration and Zeb1 expression. We also demonstrated that Zeb1 expression is dependent on SOCE influx, involving SK3 channel, and regulated by LA and EPA. This regulation of calcium entry by LA and EPA has also been observed ex vivo in human PCa slices.