Le parasite Echinococcus multilocularis cause l’échinococcose alvéolaire (EA), infection fatale si non prise en charge. Le traitement médical, pour les patients inopérables, est uniquement parasitostatique, et présente des effets secondaires. Néanmoins, chez certains patients, la viabilité du parasite régresserait suffisamment pour envisager un arrêt de ce traitement. Actuellement, les biomarqueurs pour estimer la viabilité parasitaire ne sont qu’indirects, évaluant la réponse immunitaire du patient. Trois études ont été menées, visant à évaluer des biomarqueurs, innovants ou déjà disponibles sur le marché.Nous avons étudié la présence d’ADN libre circulant (ADNlc), au moment du diagnostic, mais aussi quelques mois après la mise en place du traitement. Notre étude valide pour la première fois la présence d’ADNlc dans les cas d’EA, sur modèle animal puis sur des échantillons de patients. Même si la méthode n’est pas encore utilisable en diagnostic ou en suivi, c’est un point de départ vers l’utilisation de l’ADNlc pour la prise en charge de l’EA.De plus, nous avons mené une étude exploratoire sur des lésions parasitaires chez la souris et chez un patient ayant reçu un traitement médicamenteux très court. A partir d’un même échantillon, nous avons analysé l’ADN, afin d’estimer la proportion de cellules parasitaires, et nous avons quantifié différents transcrits parasitaires, afin d’estimer la viabilité du parasite de manière directe. Cet axe a permis de choisir la cible la plus transcrite : elle pourrait être utilisée sur une cohorte plus large, puis corrélée avec les biomarqueurs indirects utilisés aujourd’hui.Enfin, nous avons évalué un test de diagnostic rapide de l’échinococcose kystique, présentant de fortes réactions croisées en cas d’EA.Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives, principalement pour améliorer le suivi des patients atteints d’EA. / The parasite Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a fatal infection if not adequately managed. Medical treatment, for inoperable patients, is only parasitostatic, with many side effects. Nevertheless, in some patients, the viability of the parasite could regress sufficiently for treatment to be stopped. Currently, biomarkers for estimating parasite viability are only indirect, evaluating the immune response of the patient. Three studies were conducted to evaluate biomarkers that are innovative or already available on the market.We investigated the presence of circulating cell-free DNA (ccfDNA) at diagnosis, and after a few months of treatment. For the first time, our study identified the presence of ccfDNA in cases of AE, in an animal model and in human samples. Although the method cannot yet be used for diagnosis or follow-up, it is a starting-point for the use of ccfDNA in the management of AE.In addition, we conducted an exploratory study of parasitic lesions in mice, and in a patient who had only received medical treatment for a very short time. We analyzed DNA to estimate the proportion of parasite cells present in each sample. We then quantified different parasite transcripts from each sample, in order to directly estimate parasite viability. This approach allowed us to identify the most abundantly transcribed gene, which could potentially be used to study a larger cohort, in order to correlate results with the indirect biomarkers used today.Finally, we evaluated a rapid diagnostic test for cystic echinococcosis, which produces strong cross-reactions in the case of AE infection.This work opens new perspectives, mainly to improve the follow-up of patients with AE.

La carence en donneurs de méthyle est assez fréquente dans la période périnatale et au cours du vieillissement. Les donneurs de méthyle alimentaires, l'acide folique et la vitamine B12, influencent la teneur cellulaire en S-adénosylméthionine et S-adénosylhomocystéine et en homocystéine. Le lien entre les donneurs de méthyle et le métabolisme énergétique n'est pas connu, en dépit de leur rôle dans les voies liées à l'épigénétique et la synthèse de molécules méthylées. Nous avons évalué les conséquences d'un régime alimentaire déficient donneur de méthyle, dans le myocarde des ratons au moment du sevrage, soumis à une carence durant la gestation et la lactation. Le régime carencé augmente l'homocystéine plasmatique et S-adénosylhomocystéine myocardique. Les résultats mettent en évidence une cardiomyopathie hypertrophique et un déficit global de l'oxydation des acides gras avec acylcarnitines plasmatiques. Les liens entre le métabolisme des mono-carbones, l'oxydation mitochondriale des acides gras et de cardiomyopathie ont été constatées par des corrélations entre l'homocystéine et les acylcarnitines et le peptide natriurétique de type B. La carence en donneurs de méthyl peut être une condition aggravante de la cardiomyopathie en altérant l'oxydation des acides gras à travers une expression modifiée de PPAR[alpha] et ERR[alpha] et un déséquilibre de l'acétylation / méthylation de PGC1[alpha]. Nous avons montré que l'Hcy et Apo A-I ont été deux facteurs métaboliques déterminants de l'ABI dans une population ambulatoire de volontaires âgés d'une région rurale de la Sicile. L'influence négative de l'Hcy sur Apo A-I et sur le métabolisme des HDL ouvre des nouvelles perspectives sur l'implication de l'Hcy dans la physiopathologie de l'athérothrombose / The deficiency in methyl donors is prevalent in the perinatal period of life and in aging. Dietary methyl donors, folate and vitamin B12, influence the cellular content in Sadenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine and increases homocysteine. The link between methyl donors and energy metabolism is not known, despite their role in pathways related to epigenetics and synthesis of methylated molecules. We evaluated the consequences of a diet lacking methyl donors, in myocardium of weaning rats from dams subjected to deficiency during gestation and lactation. The deficient diet increased plasma homocysteine and myocardium Sadenosylhomocysteine. The results evidenced a hypertrophic cardiomyopathy with a global deficit in fatty acid oxidation with increased plasma acylcarnitines. The links between one-carbone metabolism, mitochondrial fatty acid oxidation and cardiomyopathy were ascertained by correlations between hyperhomocysteinemia, short-, medium- and long-chain acylcarnitines, and type-B natriuretic peptide. Methyl donor deficiency may be an aggravating condition of cardiomyopathy by impairing fatty acid oxidation through altered expression of PPAR[alpha] and ERR[alpha] and imbalanced acetylation/methylation of PGC1[alpha]. Finally, in a clinical study we sshowed that the Hcy and Apo A-I were two metabolic factors that influence the « anckle brachial index » in an ambulatory aged Sicilian population. The influence of homocysteine on Apo A-I and HDL metabolism provides new insights on its role on vascular diseases, at a cross-point between atherosclerosis and atherothrombosis

Les peroxyrédoxines (Prx) sont des peroxydases à thiol, ubiquitaires, qui jouent un rôle central dans la physiologie du peroxyde d’hydrogène. Une famille de Prx dite "2-Cys-Prx typique" possède une propriété unique de suroxydation de la Cys catalytique sous forme acide sulfinique, qui constitue un mécanisme de régulation des fonctions des 2-Cys-Prx typiques en tant que peroxydase, capteur de peroxyde ou protéine chaperon. La réduction des 2-Cys-Prx typiques suroxydées est catalysée par la Sulfirédoxine (Srx), une sulfinyl réductase ATP-dépendante dont la constante catalytique est de l’ordre de 1-2 min-1, une valeur faible qui doit être corrélée au rôle de Srx dans la régulation redox. L’objectif de ce travail était d’analyser l’enzymologie de la régulation du système Prx/Srx au niveau, du processus de suroxydation des 2-Cys-Prx typiques, de l’étape limitante de la Srx, et de son recyclage par les systèmes redox cellulaires. Dans un premier temps, nous avons caractérisé les deux étapes du cycle catalytique de la 2-Cys-Prx typique majeure de S. cerevisiae Tsa1, dont la compétition contrôle la sensibilité à la suroxydation, par une stratégie combinant cinétiques rapides, système enzymatique couplé et modélisation cinétique. Ces travaux suggèrent que cette compétition est contrôlée par une réorganisation conformationnelle au cours du cycle catalytique de la Tsa1. Dans un second temps, l’étude de la première étape du mécanisme catalytique de Srx, qui consiste en l’activation ATP-dépendante du groupement acide sulfinique de la 2 Cys-Prx a permis, i) de montrer que l’étape limitante de la réaction catalysée par Srx était associée au processus chimique de transfert de phosphate, et ii) de proposer un modèle d’assemblage du complexe Michaelien Prx/Srx/ATP formé lors de ce processus. Enfin, par une approche combinant cinétiques enzymatiques in vitro et génétique de la levure in vivo, nous avons établi que le mécanisme de recyclage des Srx à 1 Cys existant chez les plantes ou les mammifères implique le rôle du glutathion comme réducteur cellulaire, contrairement à la Srx de S. cerevisiae qui est recyclée par le système thiorédoxine. De façon inattendue, la spécificité du glutathion dans ce mécanisme est assurée par un événement de reconnaissance au sein du complexe Prx/Srx / The peroxiredoxins (Prx) are ubiquitous thiol peroxidases, which play a central role in the physiology of hydrogen peroxide. A subclass of Prx called "typical 2-Cys-Prx" has a unique property to hyperoxidize the catalytic Cys into the sulfinic acid form, which acts as a regulation mechanism of their functions, as peroxidase, peroxide sensor or protein chaperone. The reduction of the overoxidized form is catalyzed by sulfiredoxin (Srx), an ATP-dependent sulfinyl reductase whose catalytic constant is about 1-2 min-1, a low value that must be correlated to the role of Srx in redox regulation. The aim of this study was to analyze the enzymology of the regulation of the Prx/Srx system at three diffrents points of control: the hyper-oxidation process of typical 2-Cys-Prx, the rate-limiting step of the Srx mechanism and the recycling step of Srx by the cellular thiol redox systems. We have first characterized the competition mechanism between the two steps of the catalytic mechanism of the major typical 2-Cys-Prx of S. cerevisiae, Tsa1, through a strategy combining rapid kinetics, coupled enzyme system and kinetic modelling analysis. This work suggests that the sensitivity to hyper-oxidation is controlled by a conformational reorganization during the catalytic cycle of Tsa1. Next, the study of the first step of Srx catalytic mechanism, which involves the ATP-dependent activation of the sulfinic acid form of typical 2-Cys Prx i) has shown that the rate-limiting step is associated with the chemical phosphate transfer process, and ii) provided an assembly model of the Michaelien complex Prx/Srx/ATP, formed during this process. Finally, through the combination of in vitro enzyme kinetics and in vivo yeast genetic tools, we established that the recycling mechanism of one Cys Srx, existing in plants or mammals, involves the glutathione (GSH) as reducer in cells, contrary to the Srx from S. cerevisiae, which is recycled by the Thioredoxin system. Unexpectedly, our study suggests that GSH binds the thiolsulfinate complex, confirming the role of GSH as the primary reducing system of 1-Cys-Srx

Physiologiquement, l’ADN, séquestré dans les noyaux, n’est pas détecté par les récepteurs de danger du système immunitaire. En revanche, au cours d’inflammations chroniques, une rupture de la tolérance vis-à-vis de l’ADN du soi, consécutivement à sa libération dans le milieu extracellulaire par les cellules mortes, a été démontrée. L’accès de l’ADN extracellulaire aux récepteurs intracellulaires est médié par des molécules cargo capables de s’associer à l’ADN extracellulaire et d’induire sont internalisation.L’IL-26, qui est un membre de la famille de l’IL-10, a été décrite comme une cytokine pro-inflammatoire, dont les mécanismes moléculaires restent mal connus. Nous avons démontré que l’IL-26 se lie à l’ADN, permet son internalisation dans le cytosol des cellules myéloïdes et la sécrétion de cytokines pro inflammatoires via la voie STING et la voie des inflammasomes. La modélisation informatique de l’IL-26, basée sur la structure de l’IL-10,met en évidence des caractéristiques structurales similaires aux molécules cargo : un domaine de liaison à l’ADN, deux hélices amphipathiques et un motif d’ancrage à la membrane. De plus, des complexes circulants d’IL-26-ADN sont retrouvés dans les sérums de patients en poussée aigues de vascularite à ANCA,une pathologie inflammatoire chronique. L’IL-26 est détectée dans les lésions de glomérulonéphrite aigue nécrosante à croissants, ainsi qu’au niveau des cellules musculaires lisses artérielles de ces patients. Ces dernières sécrètent de l’IL-26 en présence de cytokinespro-inflammatoires. En conclusion, l’IL-26 établit d’une boucle d’autoamplification entre une mort cellulaire intense et l’inflammation. / In physiological conditions, self-DNA released by dying cells is not detected by intracellular DNA sensors. Inchronic inflammatory disorders, unabated inflammation has been associated with a break in innate immune tolerance to self-DNA. However, to gain access to intracellular DNA sensors, extracellular DNA has to complex with DNA-binding molecules. IL-26 is a member of the IL-10 cytokine family, overexpressed in numerous chronic inflammatory diseases, which biological activity remains unclear. We demonstrate here that IL-26 binds to DNA and shuttles it in the cytosol of human myeloid cells. As a consequence, IL-26 allows extracellular DNA to trigger proinflammatory cytokine secretion by monocytes, in a STING- and inflammasome-dependent manner. Supporting these biological properties, IL-10-based modelling predicts two DNA-binding domains, two amphipathic helices, and an in-plane membrane anchor in IL-26, structural features of cationic amphipathic cell penetrating peptides. In line with these properties, patients with active autoantibody-associated vasculitis, a chronic relapsing autoimmune inflammatory disease associated with extensive cell death, exhibit high levels of both circulating IL-26 and IL-26-DNA complexes. Moreover, in patients with crescentic glomerulonephritis, IL-26 is expressed by renal arterial smooth muscle cells and deposits in necrotizing lesions. Accordingly, human primary smooth cells secrete IL-26 in response to proinflammatory cytokines. In conclusion, IL-26 expressed in lesions confers proinflammatory properties to DNA released by dying cells, setting up a positive amplification loop between extensive cell death and unabated inflammation.

Les parasites Leishmania sont les agents responsables de la leishmaniose viscérale (LV), mucocutanée (LM) ou cutanée (LC) chez l'homme et de la leishmaniose canine (CanL). Ces parasites sont phagocytés par les macrophages humains et animaux où ils vont se transformer de promastigote en amastigote. Nous avons identifié et analysé les lipides impliqués dans le processus de transformation dans le complexe de Leishmania donovani et infantum. Quatre classes de lipides, les phospholipides, les acides gras libres, les triglycérides et les stérols ont été étudiés. De même, nous avons analysé la composition en acides gras des lipides totaux chez neuf espèces de Leishmania isolées en Tunisie, dont quatre souches de L. infantum, deux souches de L. major et deux souches de L. tropica et une souche de L. infantum de chien. Durant nos premiers travaux, la composition en acides gras des lipides totaux a été analysée et nos résultats montrent une augmentation des acides gras et du cholestérol et une diminution des triglycérides et de l'ergostérol durant la transition entre les promastigotes et les amastigotes. En ce qui concerne les classes de phospholipides, nous avons trouvé une proportion accrue de sphingomyéline et de phosphatidylsérine et une proportion réduite de phosphatidylinositol et de lysophosphatidyléthanolamine. Pour la composition en acides gras, une augmentation significative des acides gras n-7 a été observée chez les amastigotes, quant aux acides gras n-6 totaux, ils ont diminué chez les PL. Plusieurs changements ont également été observés au niveau des TG et des acides gras libres, en particulier, les acides gras n-7 et 20: 4n-6 ont été fortement augmentés, alors que les acides gras n-9 et les précurseurs n-6 ont diminué. Pour la deuxième étude, les résultats trouvés dans nos premiers travaux qui concernent la présence de proportions très élevés de 18 : 2n-6 contre de faible proportion de l’AA (20 :4n-6) ainsi que l’absence ou la très faible proportion de 18 :3n-3 ont été confirmés. De plus, L. major présentait une proportion plus élevée de 14 : 0 (acide myristique), 18: 3n-6 (acide gamma-linoléique) et une plus faible proportion de n-3, y compris 18: 3n-3 (acide alphalinoléique) et 22: 6n-3 (acide docosahexaénoïque) comparé à L. infantum et L. tropica. Après la supplémentation de l'acide oléique (AO), l'acide arachidonique (AA) et l’acide docosahexaénoïque (DHA) sur deux souches de L. infantum utilisées pour infecter les macrophages : un isotype MON-24 responsable de la leishmaniose cutanée et un MON-1 causant la leishmaniose viscérale ; nous avons constatés que les AA et DHA augmentaient la virulence du parasite, tandis que L’AO diminuait leur virulence / Leishmania parasites are the causative agents of visceral (LV), mucocutaneous (LM) or cutaneous (LC) leishmaniasis in humans, canine leishmaniasis in dogs (CanL), and leishmaniases in other mammals .The parasites are phagocytosed by human and animal macrophages where they will transform from promastigote to amastigote. We identified and analyzed the lipids involved in the transformation process in the Leishmania donovani complex. Four classes of lipids, phospholipids (PL), free fatty acids (FA), triglycerides (TG) and sterols were studied.Similarly, we analyzed the fatty acid composition of total lipids in nine Tunisian Leishmania isolates, including five strains of L. infantum (four human and one canine), two strains of L. major and two strains of L. tropica.In our early work, the fatty acid composition of total lipids was analyzed and our results show an increase in fatty acids and cholesterol and a decrease in triglycerides and ergosterol during the transformation of promastigotes into amastigotes. For phospholipid classes, we found an increase in sphingomyelin and phosphatidylserines and a decrease in phosphatidylinositols and lysophosphatidylethanolamines during processing. For the fatty acid composition, a significant increase of n-7 fatty acids was observed in amastigotes, as for n-6 total fatty acids, they decreased in PLs. Several changes have also been observed in TG and free fatty acids, in particular, n-7 and 20: 4n-6 fatty acids have been greatly increased, whereas n-9 fatty acids and n-6 ??precursors have been significantly increased. decreased.The study of the fatty acid composition of the 9 Tunisian strains of Leishmania confirmed, in the first place, our results found in our first works concerning the presencevery high proportions of 18: 2n-6 against low proportion of AA (20: 4n-6) as well as the absence or very low proportion of 18: 3n-3.In addition, the comparison of the fatty acid compositions of the three species studied: L. infantum, L. major and L. tropica showed that L. major had a higher proportion of 14: 0 (myristic acid), 18: 3n- 6 (gamma-linoleic acid) and a lower proportion of n-3, including18: 3n-3 (alpha-linoleic acid) and 22: 6n-3 (docosahexaenoic acid) compared to L. infantum and L. tropica. After supplementation of oleic acid (AO), arachidonic acid (AA) and docosahexaenoic acid (DHA) on two L. infantum strains used to infect macrophages: a MON-24 isotype responsible for cutaneous and a MON-1

Le rôle des acides biliaires a évolué ces dernières années passant de simples molécules solubilisatrices des lipides à des composés à activité métabolique. En plus de leur fonction dans l’absorption des lipides post-repas, ils ont été montrés comme stimulant de nombreuses voies de signalisation modulant l’expression de gènes clefs du métabolisme et de nombreux mécanismes physiologiques via l’activation de récepteurs spécifiques tels que les récepteurs « Farnesoid X receptor » (FXR) et le récepteur membranaire couplé à une protéine G, TGR5. La protéine TGR5 codée par le gène GPBAR1, aussi connue sous le nom de « G-protein-membrane-type receptor for bile acids » (M-BAR) est le premier récepteur couplé à une protéine G spécifique aux acides biliaires ayant été mis en évidence. Cette protéine est exprimée dans de nombreux tissus clefs du métabolisme énergétique tels que les cellules L intestinales, le tissu adipeux, les reins, le muscle squelettique et le pancréas. En réponse à la fixation des acides biliaires au récepteur TGR5, celui-ci va être internalisé et sa sous-unité GαS va être libérée. Ce mécanisme va ensuite activer l’adénylate cyclase et augmenter la production d’AMPc à l’origine de l’activation des voies de signalisations liées à la protéine kinase A (PKA). Une fois activée, la PKA va induire la phosphorylation des protéines « cAMP-response element-binding » (CREB) et permettre la modulation de l’expression de gènes cibles.Ces dernières années de nombreux travaux ont eu pour but d’étudier le rôle du récepteur TGR5 dans le métabolisme. Chez la souris, l’activation du récepteur TGR5 stimule la dépense énergétique dans le tissu adipeux brun et dans le muscle squelettique et prévient le développement de l’obésité et de l’insulino-résistance induites par un régime riche en graisses. Le récepteur TGR5 est également impliqué au niveau des cellules L intestinales sécrétrices du GLP-1. Il y joue un rôle essentiel dans l’homéostasie glucidique via la régulation de l’activité pancréatique, des sécrétions de l’insuline et du glucagon, de l’inhibition de la vidange gastrique ou encore de la modulation des messages de satiété via des voies neuroendocrines. TGR5 présente également des fonctions immunologiques avec une expression connue dans les cellules de l’immunité telles que les monocytes, les macrophages alvéolaires ou encore les cellules de Kupffer. TGR5 a également été mis en évidence comme régulateur des mécanismes d’inflammations via les macrophages avec une diminution de l’expression des cytokines pro-inflammatoires. A l’opposé, l’activation de TGR5 serait impliquée dans de nombreux processus pathologiques tels que, le développement de carcinomes gastro-intestinaux, les pancréatites, la lithiase biliaire, suggérant un rôle potentiel du récepteur TGR5 dans la régulation de voies de signalisation responsables de la prolifération et de la mort cellulaire [...] / Bile acids (BAs) have evolved over the years from being considered as simple lipid solubilizers to metabolically active molecules. In addition to their function in dietary lipid absorption, they have also been shown to activate farnesoid X receptor (FXR) and TGR5 receptors to initiate signaling pathways and regulate metabolic gene transcription. TGR5 (encoded by the GPBAR1 gene), also known as G-protein-membrane-type receptor for bile acids (M-BAR) or G-protein-coupled bile acid receptor 1 (GPBAR1), was the first identified G-protein coupled receptor specific for bile acids. In normal individuals, the highest level of GPBAR1 mRNA expression was reported in the gallbladder, placenta and spleen, followed by moderate expression in other tissues including lungs, liver, stomach, small intestine and adipose tissue, with a relatively low level of expression in kidney, skeletal muscles and pancreas. In response to binding of BAs to the ligand-binding pocket of the TGR5 protein, the TGR5 receptor is internalized and the GαS subunit is released. This mechanism leads to activation of adenylate cyclase and an increase in cAMP production resulting in induction of the protein kinase A (PKA) pathway. Subsequently, PKA phosphorylates the cAMP-response element-binding protein (CREB) and enhances the transcription of its target genes in response to extracellular signals.To date, extensive work has been done to investigate the role of TGR5 in metabolism. In rodents, BA-activated TGR5 receptor stimulates energy expenditure in brown adipose tissue and skeletal muscle and prevents obesity and insulin resistance induced by a high fat diet. TGR5 is also implicated in intestinal L-cells secreted GLP-1, which plays an essential role in glucose homeostasis through the stimulation of glucose-dependent-insulin-secretion and inhibition of glucagon secretion, inhibition of gastric emptying and increasing satiety through neuroendocrine pathways. In terms of the immunological function of TGR5, it is now known that TGR5 is expressed in several immune cells such as monocytes, alveolar macrophages and Kupffer cells. The beneficial effects of TGR5 on macrophage-driven inflammation include reduced proinflammatory cytokine expression, thus protecting against atherosclerosis and liver steatosis. On the contrary, TGR5 activation has also been implicated in itch and analgesia, gastrointestinal-tract cell carcinogenesis, pancreatitis, and cholelithiasis, suggesting a potential role for TGR5 as a regulator of signal transduction pathways responsible for cell proliferation and apoptosis. BAs may also influence islet function via both direct and indirect mechanisms as recent studies have shown that Farnesoid X receptor (FXR) is expressed by pancreatic beta cells, and regulates insulin signaling in cultured cell lines. Kumar et al., [14] also reported that the TGR5 agonists INT-777 + oleanolic acid (OA) stimulated glucose-mediated insulin release via TGR5 activation, also in cultured cells. Still, little is known about the regulation of TGR5 expression or its involvement in pancreatic hormone secretion in response to physiological or pathological conditions such as T2D, as these studies have been performed mainly in cultured cell lines. In these contexts, the biological function of TGR5 remains enigmatic. The aim of the present study was first to establish the specific expression of TGR5 in human pancreatic islet cell subtypes. Then, a cross-sectional cohort of human islets isolated from individuals with various degrees of insulin resistance was exploited to determine if TGR5 expression and function was modified in T2D. Finally to determine if targeting TGR5 is clinically relevant, human islets were treated in-vitro with a specific agonist of TGR5 or with siRNA directed against TGR5 and hormone secretion assessed to establish whether TGR5 activation or inhibition modulate pancreatic hormone secretion.

Un très grand nombre de travaux de recherche fait état de l’intérêt des oligonucléotides en tant qu’agents thérapeutiques. Les modes d’actions envisageables sont très variés (thérapie antisens, antigène, interférence ARN, etc.). Cependant, les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des oligonucléotides naturels ne permettent pas leurs utilisations in vivo. Leurs propriétés peuvent être améliorées par des modifications chimiques. Notre travail consiste à synthétiser une nouvelle génération d’oligoribonucléotides modifiés : les oligomères de nucléosides aminooxy acides. Dans ces oligomères, la liaison phosphodiester de l’ARN est remplacée par une liaison N-oxyamide -CONHO-. Cette liaison est stable vis-à-vis des hydrolyses chimiques et enzymatiques et est facilement engagée dans des liaisons hydrogène. La préparation de différents nucléosides aminooxy esters protégés à partir de l’uridine ou du D-(+)-glucose est présentée. Par ailleurs, les N-oxy PNA constituent une autre famille d’oligonucléotides modifiés présentant une liaison N-oxyamide. L’analyse structurale des monomères et des dimères de N-oxy PNA est détaillée.De plus, un projet en collaboration avec le LBPA s’intéresse à une méthode de détermination de la structure secondaire des ARN. Dans ce but, nous avons conçu, synthétisé et étudié des sondes chimiques ciblant le ribose des nucléotides non appariés d’ARN. L’emploi de catalyseurs nucléophiles comme la DMAP permet d’augmenter la réactivité des sondes. / A large number of researches report the interest of oligonucleotides as therapeutic agents. The modes of actions are very varied (antisense therapy, antigen therapy, RNA interference, etc.). However, the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of natural oligonucleotides do not allow their in vivo uses. Their properties can be improved by chemical modifications. Our work consists to synthesize a new generation of modified oligoribonucleotides: the oligomers of aminooxy acids nucleosides. In such oligomers, the phosphodiester bond of the RNA is replaced with a N-oxyamide bond -CONHO-. This linkage is stable to chemical and enzymatic hydrolysis and is easily engaged in hydrogen bondings. The preparation of different protected aminooxy esters nucleosides starting from uridine or D-(+)-glucose is presented. Furthermore, N-oxy PNA constitute another family of modified oligonucleotides having a N-oxyamide bond. Structural analysis of the monomers and the dimers of N-oxy PNA is detailed.In addition, a project in collaboration with the LBPA focuses on a method for determining the secondary structure of RNA. To this end, we designed, synthesized and studied chemical probes targeting ribose of unpaired nucleotides. The use of nucleophilic catalysts such as DMAP increases the reactivity of the probes.

Le PNA est un des mîmes d’ADN les plus prometteurs en biologie moléculaire et génomique fonctionnel, pour des applications en tant que biosenseur ou encore dans son utilisation pour du diagnostique et de la détection. Les PNAs sont résistants aux nucléases et aux protéases et s’apparient à leurs complémentaires ADN et ARN selon les règles de Watson Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen inverse. Cependant, les PNAs ont une faible solubilité et une pauvre absorption cellulaire qui leurs empêchent d’être utilisés dans des applications thérapeutiques. Différentes modifications ont été apportées pour améliorer ces propriétés. Notre travail consiste à synthétiser une nouvelle génération d’oligonucléotides modifiés : les N-oxy PNAs, avec un lien N-oxy amide au lieu du lien amide. Ce changement peut apporter de nouvelles liaisons hydrogène et donne la possibilité de fonctionnaliser l’azote de la fonction N-oxy amide, stable vis-à-vis des hydrolyses enzymatiques et chimiques. Différentes méthodes de synthèse de nucléoaminooxy esters protégés orthogonalement sont présentées depuis la L-sérine ou la L-méthionine. Les bases nucléiques sont liées au squelette par des liens N-oxy amide, amide ou triazole. Différents dinucléo N-oxy peptides ont également été préparés depuis la L-méthionine. Un deuxième projet en collaboration avec LBPA est entrepris pour déterminer la structure secondaire de l’ARN. Des sondes chimiques, des Ribosondes, ont été préparées afin d’identifier les nucléotides dont les bases nucléiques sont appariées et celles qui ne le sont pas. / The PNA is one of the most successful DNA mimics for molecular biology and functional genomics, DNA diagnostic and detection, and biosensor applications. PNAs, being resistant to nucleases and proteases, bind to complementary DNA and RNA obeying Watson-Crick, Hoogsteen or reverse Hoogsteen base pairing rules. However, PNA has poor water solubility and a lack of cell permeability which prevent its therapeutic application. Different modifications have been made to improve these properties. Our work consists to synthesize a new generation of modified oligonucleotides: the N-oxy PNA, with an N-oxy amide bond in place of amide one. This change could bring new hydrogen bonds and the possibility to functionalize the nitrogen of the N-oxy amide function which is stable to enzymes and chemical hydrolysis. Different practical methodologies are presented for the synthesis of different orthogonally protected nucleoaminooxy esters from L-serine or L-methionine, with nucleobase linked through N-oxy amide, amide or triazole. Some dinucleo N-oxy peptides have also been prepared from L-methionine. A second project with LBPA is undertaken to determine the secondary structure of RNA. Chemical probes, the Ribosondes, have been synthesized to identify nucleotides with nucleic bases paired and unpaired.

Mycobacterium tuberculosis (M.tb) l'agent étiologique de la tuberculose infecte un tiers de la population mondiale avec 9 millions de nouveaux cas et 1.5 millions de décès chaque année. La capacité de la bactérie à persister dans son hôte ainsi que l'apparition croissante de souches multi-résistantes voire totalement résistantes expliquent ces statistiques dramatiques. La découverte de nouveaux traitements à travers une meilleure connaissance de la physiologie et des programmes génétiques adaptatifs du pathogène est donc une priorité mondiale. M.tb est un bacille à Gram+ avec une enveloppe particulière caractérisée par une membrane externe (la mycomembrane) essentielle à sa viabilité et sa virulence. Cette membrane est constituée majoritairement d'acides mycoliques (AMs), des acides gras à très longues chaînes modifiés par l'introduction de groupements fonctionnels. Bien qu'à ce jour la biosynthèse des AMs est relativement bien caractérisée d'un point de vue biochimique, certaines données nécessitent d'être confirmées in vivo, de même qu'il existe peu d'information sur la régulation et la contribution des gènes de biosynthèse à la capacité adaptative des mycobactéries. Une trentaine de gènes sont impliqués dans la biosynthèse des AMs dont hadA, hadB et hadC codant pour une réaction de déshydratation essentielle. Il a été démontré biochimiquement que HadB porte l'activité catalytique et que HadA et HadC apportent la spécificité de substrats. Au cours de ma thèse, par une approche génétique, nous avons montré que seule HadB était essentielle à la viabilité mais que HadA et HadC bien que non essentielles jouaient un rôle majeur dans la physiologie, la capacité adaptative et la virulence des mycobactéries, en relation avec leur rôle dans la structure des AMs. Ces résultats avaient non seulement confirmé les données biochimiques quant au rôle de HadC dans la biosynthèse des AMs, mais également souligné l'intérêt d'une stratégie de lutte basée sur l'affaiblissement du fitness de M.tb, rendant ainsi le pathogène plus sensible aux traitements déjà existants ainsi qu'aux défenses naturelles de l'hôte. Une analyse phylogénétique couplée à une analyse expérimentale de l'expression des gènes nous a permis de retracer et de rationaliser le scénario évolutif qui a façonné le locus hadABC. En accord avec l'organisation génétique, j'ai ainsi montré que la carence en nutriments, un stress rencontré par la bactérie lors de l'infection, conduisait à la co-répression des gènes hadABC ainsi que de la plupart des gènes de biosynthèse des AMs avec des gènes impliqués dans le processus de traduction. Le potentiel de traduction est connu pour être contrôlé par la disponibilité en nutriments, à travers notamment la réponse stringente, une réponse adaptative universellement conservée chez les bactéries. Suite à ces résultats, un modèle a été proposé selon lequel au cours de la réponse stringente, les intermédiaires de synthèse des AMs, seraient détournés au profit de la synthèse de lipides alternatifs dont des lipides de stockage. L'analyse phylogénétique a également suggéré une relation fonctionnelle étroite entre l'activité des enzymes HadABC et des enzymes responsables de la modification des AMs. Afin d'avoir une vision intégrée de la régulation de la synthèse de la mycomembrane, nous avons analysé le rôle biologique du gène rv0081 codant pour un facteur de transcription global. Différentes approches systémiques suggéraient que Rv0081 jouerait un rôle central dans la capacité adaptative de M.tb en régulant de nombreux gènes impliqués dans différentes fonctions cellulaires dont les gènes hadABC. J'ai pu montrer qu'un mutant rv0081 était hypervirulent et que l'absence d'une régulation naturelle du gène affectait la capacité de survie de la bactérie à l'intérieur des macrophages. / Mycobacterium tuberculosis (M.tb), the causative agent of tuberculosis infects one third of the world population with 9 million new cases and 1.5 million deaths each year. The capability of the bacteria to persist in its host and the emergence of multi- and totally-drug resistant strains explain these dramatic statistics. Therefore, the discovery of new drugs through a better understanding of the physiology and of the adaptive genetic programs of the pathogen is a priority. Mtb is a Gram + bacilli with an unusual cell envelope characterized by an outer membrane (the mycomembrane) essential to its viability and virulence. This membrane is mainly composed of mycolic acids (MAs), a class of very long chain fatty acids which are modified by the introduction of functional groups. To date the biosynthesis of MAs is biochemically well characterized, but some data need to be confirmed in vivo, likewise there is little information about the regulation and the contribution of biosynthesis genes in the adaptive capacity of mycobacteria. Around thirty genes are involved in the biosynthesis of MAs including hadA, hadB and hadC which are required for an essential dehydration reaction. It has been shown biochemically that HadB bears the catalytic activity and that HadA and HadC bring about the substrate specificity. In this study, using a genetic approach, we have shown that only HadB was essential to the viability but that the non-essential HadA and HadC proteins played a major role in the physiology, the adaptive capacity and the virulence of mycobacteria. These results have not only confirmed the biochemical data on the role of HadC in the biosynthesis of MAs, but have also underlined the relevance of a strategy based on weakening the fitness of Mtb, making the pathogen more susceptible to existing therapy as well as to the natural host defenses. Phylogenetic and experimental analyses of gene expression allowed us to rationalize the evolutionary scenario that has shaped the hadABC locus. In agreement with the genetic organization, I have shown that starvation, a stress experienced by the bacterium upon infection, resulted into the co-repression of the genes hadABC as well as most of the MAs biosynthetic genes with genes involved in the translation process. The translation potential is known to be controlled by nutrient avaibility, especially through the stringent response, an adaptive response widely conserved in bacteria. Following these results a model was proposed stating that during the stringent response, the MAs intermediate products would be redirected toward the synthesis of alternate lipids including storage lipids. Phylogenetic analysis also suggested a close functional relationship between the activity of HadABC proteins and the enzymes involved in the modification of MAs. In order to get an integrated picture of the regulation of the biosynthesis of the mycomembrane, we analyzed the biological role of rv0081, a gene encoding a transcription factor. Various comprehensive approaches suggested that Rv0081 plays a key role in M.tb adaptive capacity through the regulation of many genes involved in various cellular functions including the hadABC genes. In my PhD work I have shown that an rv0081 deleted strain was hypervirulent and that the inability of the bacteria to properly regulate the gene had prevented the bacteria to survive within macrophages.

Au cours de ce travail, la génération de second harmonique optique des molécules biologiques a été étudiée. Cette technique optique non linéaire possède un caractère cohérent qui permet d'accéder aux propriétés de symétrie des molécules dont la taille est très inférieure aux longueurs d'onde optiques visibles utilisées et l'hyperpolarisabilité quadratique des acides aminés aromatiques a été mesurée en solution par diffusion non linéaire. L'hyperpolarisabilité des acides aminés non aromatiques a été obtenue de manière indirecte grâce à des mesures effectuées sur le collagène, une protéine ne contenant pas d'acide aminé aromatique. Le collagène possède en fait une très forte réponse non linéaire et fait l'objet d'études intenses en microscopie optique non linéaire. Par un modèle de sommation cohérente des champs harmoniques réémis, l'origine de la très forte efficacité non linéaire de cette protéine, liée à sa grande rigidité et à son organisation spatiale en triple hélice, a pu être obtenue. En parallèle, l'étude de plusieurs petits peptides synthétiques possédant de un à quatre tryptophanes a permis de comprendre la construction de la réponse optique non linéaire de ces objets à partir de motifs répétés. Par ailleurs, pour apporter des informations supplémentaires sur les nano systèmes, un nouveau montage expérimental a été développé. La grande sensibilité du montage a permis notamment d'atteindre la sensibilité d'une seule particule dans le volume sondé et de mettre en place un système de cartographie en trois dimensions par diffusion Hyper Rayleigh. La démonstration a été réalisée pour des nanoparticules métalliques uniques d'argent piégées dans une matrice de gélatine.