As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

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The oxygen uptake ( &VO2 ), gill ventilation ( G V& ) breathing frequency (fR), ventilation volume (VT) and the O2 extraction from the ventilatory current (EO2) were obtained for specimens of jeju (Wt = 209,7 ± 5 g) by flow-trough respirometry. The air-breathing frequency (fRA) and time spent in air-breathing (TRA) were determined by means of an experimental chamber specially constructed for this purpose. Independently of the acclimation temperature, jeju responded to hypoxia as an oxyregulator, i. e., the species was able to keep constant &VO2 in response to graded hypoxia until reach a critical oxygen tension (PcO2). The mean &VO2 values at each acclimation temperature, before reaching the PcO2, were: 47 ± 0,8 mlO2.kg-1h-1 (15°C), 82 ± 0,3 mlO2.kg-1h-1 (20°C), 104 ± 2,6 mlO2.kg-1h-1 (25°C) and 112 mlO2.kg-1h-1 (30°C). The PcO2 for each acclimation temperature were 28, 33, 41 e 52 mmHg, respectively. The increased reductions on PcO2 as acclimation temperatures rose from 15 to 30oC showed that this species presents partial compensation (or type 3 compensation) to temperature increases. Jeju increased the G V& to compensate the graded hypoxia due to higher increments on VT than in fR. This kind of compensation, however, was not enough to keep a constant EO2, which decreased gradually in response to graded hypoxia in all acclimation temperature. At 25 and 30°C the fH were significantly higher than at 15 and 20oC. Hypoxic bradicardia was not recorded at 15 and 20oC and at 25 and 30°C it only occurred below the PcO2. The different PcO2 were also the threshold for the development of accessory air-breathing in all acclimation temperatures. Increases in both fRA and TRA were inversely proportional to the water PO2 reductions and directly proportional to the acclimation temperature. / Peixes de água doce tropical vivem em ambientes de altas temperaturas e baixas concentrações de O2. Isto resultou, ao longo do processo evolutivo, na necessidade da tomada do ar atmosférico em várias espécies de peixes, a fim de compensar seus requerimentos metabólicos, o que requereu modificações anatômicas, fisiológicas e bioquímicas. Estudos sobre o efeito da hipóxia e da variação da temperatura ambiental nos peixes devem envolver o conhecimento dos mecanismos de compensação cardiorespiratória. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar as respostas cardiorespiratórios e da respiração aérea de jeju (Hoplerythrinus unitaeniatus), que utiliza a bexiga natatória como órgão acessório de troca gasosa, após período de aclimatação nas temperaturas de 15, 20, 25 e 30°C e submetido à hipóxia gradual. As medidas do consumo de O2 ( &VO2 ), ventilação branquial ( G V& ), freqüência respiratória (fR), volume ventilatório (VT) e extração de O2 da corrente ventilatória (EO2) foram obtidas de exemplares de jeju (Wt = 209,7 ± 5 g) por meio de respirometria de fluxo constante. A freqüência (fRA) e o tempo da respiração aérea (TRA) também foram determinados utilizando-se de uma câmara especialmente desenvolvida para esta finalidade. Independentemente da temperatura de aclimatação, H. unitaeniatus comportou-se como um oxi-regulador, mantendo uma &VO2 constante por amplos intervalos de reduções de O2 até atingir a tensão crítica de O2 (PcO2). Nas diferentes temperaturas a &VO2 foi de 47 ± 0,8 mlO2.kg-1h-1 a 15°C, 82 ± 0,3 mlO2.kg-1h-1 a 20°C, 104 ± 2,6 mlO2.kg-1h-1 a 25°C e 112 mlO2.kg-1h-1 a 30°C. As PcO2 nas respectivas temperaturas foram de 28, 33, 41 e 52 mmHg. A redução crescente das PcO2 mostrou que esta espécie apresenta uma compensação parcial ou do tipo 3 aos aumentos crescentes na temperaturas de aclimatação. O jeju aumentou a G V& em resposta à hipóxia gradual valendo-se de maiores incrementos no VT do que na fR. Entretanto, este tipo de compensação não foi suficiente para manter uma constante EO2, a qual decresceu gradualmente em função da hipóxia. A fH a 25 e 30°C foi significativamente mais elevada do que a 15 e 20°C. A bradicardia hipóxica só foi registrada nas temperaturas de 25 e 30°C e somente ocorreu em tensão abaixo das respectivas PcO2. As PcO2 foram o limiar para o início da respiração aérea acessória em todas as temperaturas estudadas. Os aumentos na fRA, assim como da TRA foram inversamente proporcionais às reduções da PO2 da água e diretamente proporcionais às temperaturas de aclimatação.