O Acridina Laranja é um corante catiônico da família de Acridinas. Além de ser utilizado como um agente fototóxico contra bactérias e parasitas, devido a sua alta afinidade por estruturas biológicas, ele pode ser usado como um marcador fluorescente de compartimentos biológicos. Esta sua propriedade é também útil para o desenvolvimento de novos elementos micro e nanoeletrônicos. Ao ser irradiado, o corante pode sofrer fototransformação, causando uma série de transtornos, devido à perda da atividade ou o aumento de sua toxicidade, por exemplo. Por outro lado, a interação com estruturas nanoorganizadas pode alterar os mecanismos e as velocidades das fotoreações do fotossensibilizador. Isto torna importante o estudo da fototransformação do Acridina Laranja na sua interação com estruturas biológicas ou seus modelos. Neste trabalho foi realizado um estudo da dinâmica de fototransformação do corante Acridina Laranja na sua interação com DNA e micelas de SDS sob a ação da luz visível. O objetivo principal do trabalho foi avaliar o processo de fototransformação do Acridina Laranja na sua interação com sistemas micro/nanoorganizados de grande interesse biológico e médico, tendo em vista a sua possível aplicação prática. Para este estudo, utilizamos espectroscopia de absorção ótica UV-visível, espectroscopia de fluorescência estática e resolvida no tempo e espalhamento de ressonância de luz. Nos experimentos de fotólise do corante em soluções aquosas, observa-se que o Acridina Laranja sofre fototransformação sob a ação da luz visível. Os estudos mostraram que o Acridina Laranja se transforma mais rapidamente quando sua concentração é menor. Este efeito foi associado à formação de agregados em altas concentrações do composto. Na sua interação com DNA e micelas de SDS o Acridina Laranja também sofre fototransformação, sendo a velocidade de fotodecomposição mais baixa se compararmos com as soluções aquosas. Os experimentos na presença e na ausência de oxigênio mostraram que as moléculas excitadas do Acridina Laranja transferem sua energia para oxigênio molecular formando o oxigênio singleto que, por sua vez, pode atacar as ligações duplas do sistema de conjugação da estrutura do corante, contribuindo assim na sua fototransformação. De forma geral, podemos dizer que tanto as micelas de SDS como o DNA podem dificultar o contato do Acridina Laranja e o oxigênio molecular, provavelmente, devido à alta viscosidade do ambiente onde o Acridina Laranja se encontra nesses sistemas ou devido à localização separada das moléculas de Acridina Laranja e do oxigênio dentro da estrutura de micelas e DNA. / Acridine Orange is a cationic dye of the Acridine family. Besides it being used as a phototoxic agent against bacteria and parasites it can be used as a fluorescent tag of biological compartments due to its high affinity for biological structures. This property appears also useful for the development of new micro and nano-electronic elements. Under visible light irradiation Acridine Orange is phototransformed, causing a lot of inconvenience due to the loss of activity or the increased toxicity, for example. On the other hand the interaction with nanoorganized structures can change the mechanisms and rates photoreactions of a photosensitizer. This makes important the study of phototransformation of Acridine Orange at its interaction with biological structures or their models. This work represents a study of the dynamics of Acridine Orange phototransformation at its interaction with DNA and SDS micelles under the action of visible light. The main objective of this study was to evaluate the process of Acridine Orange phototransformation at its interaction with micro/nanoorganized of great biological and medical interest in view of their possible practical application. In this study we used optical absorption UV-visible spectroscopy, static fluorescence and time resolved spectroscopies and resonance light scattering. In the experiments in aqueous solutions, it was observed that the Acridine Orange suffers phototransformation under the visible light. It was shown that Acridine Orange becomes faster when its concentration is lower. This effect was associated with the formation of aggregates at high concentrations of the compound. Acridine Orange at its interaction with DNA and SDS micelles, also is phototransformated, the phototransformation rate being lower as compared with aqueous solutions. Experiments in the presence and absence of oxygen showed that excited molecules of Acridine Orange transfer their energy to molecular oxygen, generating singlet oxygen, which can attack the double bonds of the dye conjugation system, thereby contributing in its phototransformation. In general, we can say that both the SDS micelles as DNA can block the contact of Acridine Orange and molecular oxygen, probably due to the high viscosity of the environment, where Acridine Orange appears in these systems, and/or due to the separate location of Acridine Orange and oxygen molecules within the structure of micelles and DNA.

Esse trabalho apresenta um estudo experimental de agregação da Acridina Laranja (AL) em solução aquosa homogênea e na sua interação com o surfactante Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Este estudo foi realizado com o objetivo de definir estruturas e características temporais de formação de agregados de compostos orgânicos com sistema desenvolvido de conjugação-, usados como fotossensibilizadores e marcadores de estruturas biológicas, em sua interação com nanoestruturas heterogêneas. A informação sobre as características de agregação de fotossensibilizadores é importante devido à influência deste processo na eficácia de suas aplicações práticas, em particular na biologia e medicina. A AL foi escolhida como modelo devido aos seguintes motivos: AL é um composto bem conhecido e várias de suas características já estão bem estabelecidas na literatura; Possui alto rendimento quântico de fluorescência, alta fotoatividade, alta afinidade com estruturas biológicas (membrana celular, DNA e RNA, em particular), por isso a AL é amplamente usada como marcador fluorescente e fotossensibilizador em fototerapia; AL possui a tendência de formar agregados em solução aquosa; A agregação da AL modifica seus espectros de absorção e de fluorescência, diminui o tempo de vida e o rendimento quântico de seus estados excitados. Isso a torna um modelo útil para o estudo do fenômeno da agregação. Foram analisados os espectros de absorção óptica, de fluorescência e de espalhamento ressonante da luz em regime estático e em função do tempo, como também o espalhamento dinâmico da luz para várias concentrações de AL e de SDS. Observamos que: em soluções aquosas a AL forma agregados tipo H; O aumento da concentração de AL em soluções homogêneas induz o aumento do número de agregação; A presença do sal estimula a agregação devido à diminuição da repulsão eletrostática entre as moléculas de AL; O SDS em concentrações acima de 60uM estimula a agregação da AL induzindo a formação de agregados mistos nAL+mSDS; A estrutura dos agregados nAL+mSDS é flexível e instável; Os agregados mistos possuem uma dinâmica de transformações caracterizada por quatro componentes, a primeira com tempo característico < 36 s e os outros três com tempos que variam de minutos até algumas horas; A agregação diminui a intensidade da fluorescência da AL e aumenta a intensidade do ERL; Em altas concentrações o SDS diminui o número de agregação da AL chegando finalmente à sua forma monomérica ligada com os agregados e/ou micelas de SDS; Se comparado com a AL em solução aquosa homogênea, a ligação de monômeros da AL com micelas de SDS aumenta a intensidade da sua fluorescência; O estudo demonstra que a agregação afeta a eficácia dos fotossensibilizadores em aplicações. Tal fato deve ser tomado em consideração, especialmente devido à sua dinâmica prolongada, pois as características dos fotossensibilizadores se modificam continuamente durante o seu uso. / In this work we present an experimental study of Acridine Orange (AO) aggregation in homogeneous aqueous solutions and its interaction with a surfactant Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). The objective of this study was to define the structure and temporal characteristics of aggregates of organic compounds with developed-conjugated system, used as photosensitizers and probes of biological structures, in its interaction with heterogeneous nano-structures. The information on photosensitizer aggregation characteristics is important as this process would affect its efficiency in practical applications, in biology and medicine, in particular. AO was chosen as a model for the following reasons: AO is a known compound with various characteristics well described in literature; AO has a high fluorescence quantum yield, high photoactivity, high affinity to biological structures (cell membrane, DNA and RNA, in particular), therefore, AO is widely used as a fluorescent marker and a photosensitizer in phototherapy; AO possesses a tendency to aggregate in aqueous solution. The aggregation of AO modifies essentially its absorption and fluorescence spectra, decreases the lifetime and quantum yield of its excited states. This makes AO a suitable model for studying the aggregation phenomenon. We have analyzed optical absorption, fluorescence and resonant light scattering spectra in the static mode and as a function of time as well as the dynamic light scattering for various AL and SDS concentrations. It was found that: in aqueous solutions AO forms H aggregates; The increase in concentration of AO in homogeneous solutions induces an increase in its aggregation number; The presence of salt stimulates aggregation due to decrease of electrostatic repulsion between AO molecules; The SDS concentrations above 60 M stimulate AO aggregation inducing the formation of mixed nAL + mSDS aggregates; Mixed nAL + mSDS aggregates are characterized by flexibility and instability; Transformation dynamics of the mixed aggregates is characterized by four components, the first one with a characteristic time <36 and the other three with times ranging from minutes to several hours; AO aggregation in a solution decreases its fluorescence and increases the resonant light scattering intensities; SDS at high concentrations reduces AO aggregation number until its monomeric form bound with SDS aggregates and / or micelles; AO monomers bound with SDS micelles possess higher fluorescence intensity as compared with that in homogeneous aqueous solutions. Our research shows that aggregation modifies efficacy of photosensitizers at their application. This has always to be considered especially due to its prolonged dynamics as the photosensitizer characteristics are modifying continuously during its application.

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2016-06-22T12:24:34Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2016-06-22T12:24:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O teste de frequência de micronúcleos (FMN) in vitro é uma das metodologias de escolha no desenvolvimento de testes de segurança toxicológica. Para o seu desenvolvimento no trabalho foram realizadas modificações da técnica convencional, relativas ao substrato de cultivo das células e à sua coloração. As culturas celulares foram desenvolvidas diretamente nas lâminas e a coloração foi realizada com laranja de acridina (AO) ao invés da coloração segundo Giemsa. Foram utilizados controles positivos com potenciais clastogênico (mitomicina C, benzo[a]pireno) e aneugênico (colchicina), recomendados pela OCDE (Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico). Como moléculas-teste, foram utilizados compostos cuja associação a isótopos radioativos compõem radiofármacos produzidos pelo IPEN. DOTATATO e Ubiquicidina foram testados em diferentes concentrações proporcionais às concentrações máximas utilizadas em pacientes adultos. Para tanto, foram realizadas diluições correspondentes às concentrações 0,1X, 1X e 10X e culturas de células CHO-KI foram expostas a estas concentrações para ensaios de citotoxicidade e FMN. Nenhuma das concentrações induziu citotoxicidade significativa. Para análise de FMN, foram contabilizadas todas as células mononucleadas e multinucleadas até atingir a contagem de 1000 células binucleadas, com ou sem micronúcleos. Desta maneira foi possível analisar a frequência de micronúcleos e o índice de proliferação (CBPI). As concentrações dos fármacos em teste (0,1X, 1X e 10X) não induziram agressão às células. Nenhuma das concentrações revelou citotoxicidade ou genotoxicidade, ou ainda qualquer alteração no ciclo celular em comparação aos controles, comprovando sua segurança conforme os parâmetros exigidos pelas normas internacionais. Os resultados mostraram também uma boa concordância entre a comparação das leituras realizadas por analistas independentes, com pequenas discrepâncias discutíveis, e boa correlação com resultados obtidos com a coloração convencional. Desta maneira as modificações realizadas na técnica de FMN mostraram potencial para cumprir todos os quesitos como teste pré-clínico. / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

This diploma thesis deals with the possibilities of stress resistance analysis of the Cupriavidus necator H16 and PHB-4 bacterial cells by spectroscopic methods and by testing the suitability of acridine orange as a viable dye. Based on research in literature, suitable analytical methods have been proposed, namely flow cytometer and fluorescence microscope. The first part of the experimental work was focused on the fluorescence microscope, which confirmed the basic character of acridine orange. Three stress factors, 50% and 70% ethanol, and acidic pH (pH = 1) were selected for viability monitoring. The bacteria fluoresced with green color after exposure to ethanol and red spots were found next to the cells, indicating their loss of integrity. In an acidic environment, the bacteria fluoresced red because of a partial DNA breakdown. The results were verified by the combination of propidium iodide with SYTO9 and the acridine orange suitability proved to be useful in this method. Image records were processed using image analysis. In the second part, acridine orange was used to monitor fluorescence using a flow cytometer. The result of the measurement was fluorescence expressed as histograms for individual channels, where fluorescence was characterized by median and mean intensity. By comparing the methods used, the acridine orange appears to be a more suitable fluorescent dye for the microscope than for a flow cytometer in which it was more difficult to obtain cell viability information. In the last part of the experimental work interesting photophysical properties of acridine orange were investigated.

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O óxido nítrico (NO) é biossintetizado em diferentes células do organismo animal, relacionando-se com inúmeros processos fisiológicos. Existe, aparentemente, uma relação entre os efeitos mediados pelo NO e o microambiente celular. Desta forma, a resposta observada depende da localização da molécula radicalar, da duração da exposição e da sua concentração. Assim, observa-se um efeito antagônico do NO no que tange a biologia de tumores, admitindo-se que baixas concentrações de NO estimulam a proliferação de células tumorais e altas concentrações propiciam a atividade tumoricida. Nesse sentido, o presente trabalho visou ao desenvolvimento de um novo complexo de rutênio doador de óxido nítrico coordenado ao ligante fluorescente Alaranjado de Acridina. A coordenação do rutênio ao ligante heterocíclico de nitrogênio permitiu a obtenção do composto fluorescente [Ru(NO2)(bpy)(AO)2NO](PF6)2, em que bpy = 2,2\'bipiridina e AO = Alaranjado de Acridina. O complexo foi caracterizado por UV-vis, FITR e espectrometria de massas. Experimentos fotoquímicos revelaram que o complexo [Ru(NO2)(bpy)(AO)2NO](PF6)2 apresentou um valor de rendimento quântico de fluorescência em etanol inferior ao do ligante livre. No entanto, o rendimento quântico de produção de oxigênio singleto em água foi maior em relação ao Alaranjado de Acridina. Avaliações de fotoestabilidade por espectroscopia de emissão e absorção no UV-vis demonstraram que [Ru(NO2)(bpy)(AO)2NO](PF6)2 é mais fotoestável nas condições avaliadas e a fluorescência apresenta menor redução, quando irradiado em 470 nm comparado ao Alaranjado de Acridina. Ensaios de avaliação do potencial citotóxico dos compostos com irradiação em 470 nm, na dose de 5 J cm-², demonstraram que o corante Alaranjado de Acridina apresenta maior citotoxicidade frente à linhagem celular tumoral metastática estudada (B16/F10). Isso se relaciona, possivelmente, ao fato de o Alaranjado de Acridina livre direcionar-se para o núcleo e promover intercalação com os pares de base do DNA. A avaliação por microscopia de fluorescência revelou a predileção do complexo [Ru(NO2)(bpy)(AO)2NO](PF6) pelo núcleo. Os dados obtidos enfatizam a importância do grupo ligante para a localização do complexo, bem como para a atividade antitumoral do mesmo. / Nitric Oxide is biosynthesized in different cells of the animal organism. It is related to numerous physiological processes. There is apparently a relationship between the effects mediated by NO and the microenvironment. Thus, the cellular response observed depends on the location of the radical molecule, the duration of exposure and its concentration. Thus, an antagonistic effect of NO is observed with respect to the biology of tumors, admitting that low concentrations of NO stimulate the proliferation of tumor cells and high concentrations promote the tumoricidal activity. In this sense, the present work aimed the development of a new ruthenium complex donor of nitric oxide coordinated to the fluorescent ligand of Acridine. The coordination of Ruthenium to the nitrogen heterocyclic ligand allowed to obtain the fluorescent compound [Ru(NO2)(bpy)(AO)2NO](PF6)2, where bpy = 2,2\' bipyridine and AO = Acridine Orange, which was characterized by UV-Vis, FITR and mass spectrometry. Photochemical experiments revealed that the [Ru(NO2)(bpy) (AO)2NO](PF6) 2 complex presented a fluorescence quantum yield value, in ethanol, about 20 % lower than the free binder. However, the quantum yield of singlet oxygen in water was approximately 40 % higher compared to Acridine Orange. UV-vis emission spectroscopy and UV-vis absorption spectroscopy have shown that [Ru (NO2)(bpy)(AO)2NO](PF6) 2 is apparently more photostable and suffers less fluorescence suppression when irradiated at 470 nm compared with Acridine Orange. Cell cytotoxicity assays with irradiation using dose of 5 J cm-2 demonstrated that the coordination of Acridine Orange dye to the complex decreases its cytotoxicity against the metastatic tumor cell line studied, possibly by preventing the mechanism of intercalation of the planar ligand to DNA. Monitoring by fluorescence microscopy revealed the preferential localization of the compound [Ru(NO2)(bpy) (AO)2NO] (PF6) by the cell nucleus possibly due to coordinated Acridine Orange, which has a tropism by DNA. These results emphasize the importance of the ligand group for the localization of the complex, as well as for the cytotoxic activity of the same

Prokaryotic cells such as Escherichia coli use glucose as their preferred carbon source. In the absence of glucose, these cells resort to other sources to generate glucose and this process of de novo synthesis of glucose is termed gluconeogenesis. Phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck) is one of the three enzymes important in regulating gluconeogenesis. It converts oxaloacetic acid (OAA) from the Krebs cycle to phosphoenolpyruvate (PEP), a glycolytic intermediate. The Pck structural gene (pckA) is regulated by catabolite repression. There is a 100-fold induction of pckA-lacZ fusions at the onset of stationary phase concurrent with induction of glycogen synthesis. Mutants affecting the expression of pckA were analysed to shed some light on the mechanism of its genetic regulation.<p>Spontaneous mutants isolated with Pck- (lack of PEP carboxykinase activity) and Suc- (inability to utilise succinate as carbon source) phenotypes were previously characterised as atpG mutants defective in the ã subunit of ATP synthase.<p>In this work we find by reverse transcriptase and real time quantitative PCR that levels of pckA mRNA are normal in the atpG mutants and that the defects in expression of pckA are therefore likely at the level of translation, protein assembly and/or protein degradation. As expected, ATP synthase activity and proton pumping in inside-out membrane vesicles were defective in these atpG mutants. It is likely that one of these defects is affecting regulation or expression of the pckA gene. It was observed that atpG mutants were defective in calcium-dependent transformation although they could be made competent for electroporation. The atpG mutants were also defective for growth of P1 bacteriophage although they could serve as recipients for P1-dependent generalised transduction. These latter phenotypes are also likely due to defects in energy metabolism.

Prokaryotic cells such as Escherichia coli use glucose as their preferred carbon source. In the absence of glucose, these cells resort to other sources to generate glucose and this process of de novo synthesis of glucose is termed gluconeogenesis. Phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck) is one of the three enzymes important in regulating gluconeogenesis. It converts oxaloacetic acid (OAA) from the Krebs cycle to phosphoenolpyruvate (PEP), a glycolytic intermediate. The Pck structural gene (pckA) is regulated by catabolite repression. There is a 100-fold induction of pckA-lacZ fusions at the onset of stationary phase concurrent with induction of glycogen synthesis. Mutants affecting the expression of pckA were analysed to shed some light on the mechanism of its genetic regulation.<p>Spontaneous mutants isolated with Pck- (lack of PEP carboxykinase activity) and Suc- (inability to utilise succinate as carbon source) phenotypes were previously characterised as atpG mutants defective in the ã subunit of ATP synthase.<p>In this work we find by reverse transcriptase and real time quantitative PCR that levels of pckA mRNA are normal in the atpG mutants and that the defects in expression of pckA are therefore likely at the level of translation, protein assembly and/or protein degradation. As expected, ATP synthase activity and proton pumping in inside-out membrane vesicles were defective in these atpG mutants. It is likely that one of these defects is affecting regulation or expression of the pckA gene. It was observed that atpG mutants were defective in calcium-dependent transformation although they could be made competent for electroporation. The atpG mutants were also defective for growth of P1 bacteriophage although they could serve as recipients for P1-dependent generalised transduction. These latter phenotypes are also likely due to defects in energy metabolism.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pre textuais aline franca.pdf: 261338 bytes, checksum: 26489ba3dd2eb948a58b73b531aee0b2 (MD5) Previous issue date: 2010-10-05 / The evaluation of the reproductive capacity of stallions and semen cooled and / or frozen is of fundamental importance in practical breeding of horses. Whereas predicting the fertility of a stallion is still a subjective decision, the present study was conducted to evaluate different staining techniques, as well as tests that assess the viability of semen in horses, studying the effects of the addition of cysteine and glutathione in plasma membrane integrity of sperm DNA, and to evaluate the effects of the addition of these antioxidants in preserving the viability of sperm undergoing incubation and refrigerated for short periods. We used semen from six stallions, wich were split into seven samples, one kept as control (Control Group) and other antioxidants cysteine was added at a ratio of 1.0 mM (Group C1, 0), 1.5 mM (Group C1, 5), 2.5 mM (Group C 2.5) and glutathione also at 1.0 mM (Group G1, 0), 1.5 mM (Group G1, 5) and 2.5 mM (Group G 2.5 ). All tests were performed every six hours. The three treatments were: Treatment I cooled to 12 &#8304;C for 12 hours (zero hour; 6h resf.; 12h resf.) Chilled in boxes; Treatment II incubated in a water bath at 37 &#8304;C for 12 hours (6h 37 ° C, 12h 37 ° C) and Treatment III - cooled and subsequently incubated, according to the treatments I and II. The evaluation of plasma membrane integrity was performed by staining eosine-nigrosin; acrosomal membrane by FITC-PSA and DNA by acridine orange. For each analysis were numbered 200 to 500 cells. The evaluation of the viability of sperm was performed by MTT assay according to Mosmann (1983). The results showed that antioxidants were effective (p <0.05) in keeping the DNA intact chromatin, especially glutathione. In the acrosome of antioxidants were protective, at times 18 and 24 hours, and in other treatments, no significant difference (p> 0.05) between control and treated groups. The MTT test showed that groups treated with antioxidants had absorbance values similar to those of control, showing positive effect (p <0.05) only when cooled by six o'clock in the cysteine group 2.5. In relation to the plasma membrane of spermatozoa stained with eosin-nigrosin, no protective effect of antioxidants in the samples. The values of their averages were close to the control group (p> 0.05). One factor was estimated that cooling per se, independent of the addition of antioxidants used, has been effective in protecting the sperm. And the incubation at 37 &#8304; C causes these cells, and the addition of cysteine and glutathione were efficient, if not protect, but to maintain the integrity of the factors evaluated, not causing more damage to sperm. / A avaliação da eficácia reprodutiva do garanhão e do sêmen resfriado e&#8260;ou congelado é de fundamental importância na prática reprodutiva dos eqüinos. Predizer a fertilidade de um garanhão constitui uma decisão subjetiva. O presente estudo foi realizado com o objetivo de testar diferentes técnicas de coloração, assim como testes que avaliem a viabilidade do sêmen de eqüinos, estudando os efeitos da adição de cisteína e glutationa na integridade da membrana plasmática, do DNA espermático, além de avaliar os efeitos da adição desses antioxidantes na preservação da viabilidade dos espermatozóides submetidos à incubação e refrigeração por curtos períodos. Foi utilizado sêmen de seis garanhões, que foram fracionados em sete amostras, sendo uma mantida como controle (Grupo Controle) e às outras foi adicionado os antioxidantes cisteína, na proporção de 1,0mM (Grupo C1,0); 1,5mM (Grupo C1,5); 2,5mM (Grupo C 2,5) e glutationa também na proporção de 1,0mM (Grupo G1,0); 1,5mM (Grupo G1,5) e 2,5mM (Grupo G 2,5). Todas as análises foram realizadas a cada seis horas. Os três tratamentos foram: Tratamento I resfriado a 12 °C, por 12 horas (zero hora; 6h resf.; 12h resf.), em caixas refrigeradas; Tratamento II incubado em banho-maria a 37 °C, por 12 horas (6h 37° C; 12h 37° C) e Tratamento III resfriado e posteriormente incubado, conforme os Tratamentos I e II. A avaliação da integridade da membrana plasmática foi feita pela coloração eosina-nigrosina; da membrana acrossomal pelo FITC-PSA e do DNA pela laranja de acridina. A avaliação da viabilidade do sêmen foi realizada pelo ensaio do MTT, de acordo com Mosmann(1983). Os resultados obtidos mostraram que os antioxidantes foram eficientes (p<0,05) em manter a cromatina do DNA intacta, especialmente a glutationa. Na membrana acrossomal houve proteção dos antioxidantes, nos momentos 18 e 24 horas, sendo que nos demais tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os grupos tratados e o grupo controle. O teste do MTT mostrou que os grupos tratados com antioxidantes tiveram valores de absorbância próximos aos do controle, mostrando efeito positivo (p<0,05) apenas quando resfriados por seis horas, no grupo cisteína 2,5. Em relação à membrana plasmática dos espermatozóides, corados por eosina-nigrosina, não houve efeito protetor dos antioxidantes nas amostras avaliadas. Um fator avaliado foi que o resfriamento, por si só, independente da adição dos antioxidantes utilizados, já foi eficaz em proteger os espermatozóides. E a incubação a 37&#8304; C causa danos a essas células, e a adição de cisteína e glutationa foi eficiente em, senão proteger, mas manter a integridade dos fatores avaliados, não causando mais danos aos espermatozóides.

This work is focused on physical interactions of negatively charged polymers with small ionogenic fluorescent molecules. Trying to verify the presence of these interactions using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and provides a comprehensive view of the problem. The aim of this work is to observe the effect of concentration on the diffusion properties. P/D ratio, where P represents number of polymer binding sites and D number of dye binding sites, was chosen for this issue. Hyaluronate, sodium chondroitin sulfate and sodium polystyrene sulfonace were used as polymers and Acridine Orange, and Rhodamine 6G were chosen as fluorescent probes. The reason why this experiment uses these probes, was the assumption, that the positive charge occuring on the fluorescent probe will lead to the electrostatic interaction with the negatively charged polymer. As a result, the bond between acridine orange and polyelectrolyte was not clearly demonstrated, but the interaction with Rhodamine 6G have been proved.