Une réponse immunitaire adéquate nécessite la participation coordonnée de plusieurs populations de cellules immunitaires, comme les lymphocytes T et B, les macrophages, les cellules dendritiques ou les cellules NK. L’activation de ces types cellulaires est modulée par différents récepteurs membranaires dont la fonction est de déclencher une cascade de signalisation.L’activation des lymphocytes T, acteurs cruciaux de la mise en place de la réponse immunitaire adaptative, s’initie par l’engagement du récepteur T (TCR). Plusieurs autres types de récepteurs participent à la modulation des réponses cellulaires. Ainsi, les récepteurs aux facteurs de croissance, aux cytokines et aux chimiokines ainsi que les molécules d’adhésion et les récepteurs de la famille SLAM (pour Signaling Lymphocyte Activation Molecule) influencent l’activation cellulaire. Des travaux récents ont montré que l’activation des récepteurs SLAM induit leur association avec les membres de la famille SAP et est nécessaire à l’induction d’une réponse humorale, au développement des cellules NKT ainsi qu’à la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T CD8 et les cellules NK. L’altération du gène sh2d1a codant pour SAP conduit à l’apparition du syndrome lymphoprolifératif lié à l’X-1 (XLP-1). Les patients atteints de ce syndrome développent trois principaux phénotypes cliniques qui sont une mononucléose infectieuse fulminante, une dysgammaglobulinémie, et des désordres lymphoprolifératifs.L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier les étapes précoces d’activation des lymphocytes T et de comprendre comment la protéine SAP, associée à d’autres protéines ou domaines protéiques intracellulaires, est impliquée dans la régulation de ces mécanismes d’activation. Mon travail s’est donc orienté vers l’identification de nouveaux partenaires de SAP, autres que les récepteurs SLAM, et qui nous permettraient de mieux définir la fonction de SAP dans la signalisation T. Par une approche de biochimie, mon travail a permis de démontrer que SAP s’associe directement à la chaîne CD3 du complexe TCR-CD3, régule la signalisation induite par l’activation du récepteur T et permet la sécrétion de cytokines. Enfin, par une approche de double hybride, nous avons identifié Pecam-1 comme nouveau partenaire de SAP. Nous avons par la suite observé que l’association de SAP avec Pecam-1 régule l’adhérence des lymphocytes T. Par ces deux études, mon travail de thèse a permis de démontrer l’implication de SAP dans de nouvelles voies de signalisation et permet de mieux comprendre les mécanismes dérégulés lors de l’absence de SAP. / Immune responses need a coordinate involvement between different immune cell populations, as T and B cells, macrophages, dendritic cells or NK cells. Activation of these different cell populations is mediated by different receptors whose function is to initiate a signal transduction cascade. T cell activation, a crucial event in adaptive immune response, begins with T cell receptor (TCR) triggering. A large number of receptors can modulate T cell responses. Thus, cytokines, chimiokines and growth factors receptors, adhesion molecules and SLAM (for Signaling Lymphocyte Activation Molecule) family receptors regulate cell activation. Recent works have shown that SLAM receptors triggering induce their association with SAP (for SLAM-Associated Protein) family members and is vital for humoral immunity, NKT cell development and T CD8+ and NK cells cytotoxicity. Mutations in sh2d1a gene, which code for SAP, are responsible of X-linked Lymphoproliferative-1 (XLP-1) syndrome. Patients, who suffer from this syndrome, develop three main clinical manifestations: a fulminant infectious mononucleosis, dysgammaglobulinemia and lymphoproliferative syndromes. My thesis work was to study early steps of T cell activation and to understand how the SAP protein, associated with its partners, regulates these cellular mechanisms. Thus, my work was to identify new SAP partners, others than SLAM receptors, in order to better understand SAP function in T cell signaling. With a biochemical approach, my work has demonstrated that SAP directly associates with CD3 chain of TCR-CD3 complex, regulates cell signaling and cytokines secretion following TCR triggering. Finally, with a two-hybrid assay, we have identified the adhesion molecule Pecam-1 as a new SAP partner. Then, we have observed that SAP directly interacts with Pecam-1 to regulate T cell adhesion. During my thesis work, we have identified new cellular signaling pathways that are regulated by SAP and permit to better understand the cellular mechanisms that are affected when SAP is absent.

Une réponse immunitaire adéquate nécessite la participation coordonnée de plusieurs populations de cellules immunitaires, comme les lymphocytes T et B, les macrophages, les cellules dendritiques ou les cellules NK. L'activation de ces types cellulaires est modulée par différents récepteurs membranaires dont la fonction est de déclencher une cascade de signalisation.L'activation des lymphocytes T, acteurs cruciaux de la mise en place de la réponse immunitaire adaptative, s'initie par l'engagement du récepteur T (TCR). Plusieurs autres types de récepteurs participent à la modulation des réponses cellulaires. Ainsi, les récepteurs aux facteurs de croissance, aux cytokines et aux chimiokines ainsi que les molécules d'adhésion et les récepteurs de la famille SLAM (pour Signaling Lymphocyte Activation Molecule) influencent l'activation cellulaire. Des travaux récents ont montré que l'activation des récepteurs SLAM induit leur association avec les membres de la famille SAP et est nécessaire à l'induction d'une réponse humorale, au développement des cellules NKT ainsi qu'à la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T CD8 et les cellules NK. L'altération du gène sh2d1a codant pour SAP conduit à l'apparition du syndrome lymphoprolifératif lié à l'X-1 (XLP-1). Les patients atteints de ce syndrome développent trois principaux phénotypes cliniques qui sont une mononucléose infectieuse fulminante, une dysgammaglobulinémie, et des désordres lymphoprolifératifs.L'objectif de mon travail de thèse a été d'étudier les étapes précoces d'activation des lymphocytes T et de comprendre comment la protéine SAP, associée à d'autres protéines ou domaines protéiques intracellulaires, est impliquée dans la régulation de ces mécanismes d'activation. Mon travail s'est donc orienté vers l'identification de nouveaux partenaires de SAP, autres que les récepteurs SLAM, et qui nous permettraient de mieux définir la fonction de SAP dans la signalisation T. Par une approche de biochimie, mon travail a permis de démontrer que SAP s'associe directement à la chaîne CD3 du complexe TCR-CD3, régule la signalisation induite par l'activation du récepteur T et permet la sécrétion de cytokines. Enfin, par une approche de double hybride, nous avons identifié Pecam-1 comme nouveau partenaire de SAP. Nous avons par la suite observé que l'association de SAP avec Pecam-1 régule l'adhérence des lymphocytes T. Par ces deux études, mon travail de thèse a permis de démontrer l'implication de SAP dans de nouvelles voies de signalisation et permet de mieux comprendre les mécanismes dérégulés lors de l'absence de SAP.

Lors d’uvéite non infectieuse (UNI), des événements environnementaux vont provoquer une rupture de la tolérance immune périphérique et une activation des cellules résidentes oculaires. Plusieurs données attestent de l’importance du rôle joué par les signaux de danger lors de ces deux phases clefs d’activation pathologique. Si une place capitale a été donnée aux signaux de danger exogènes, notamment microbiens, l’importance des signaux de danger endogènes commence à émerger. A ce titre, les nucléotides constituent une famille importante de signaux de danger endogènes puisque en situation pathologique, ils vont être libérés de façon massive dans l’espace extracellulaire où ils peuvent avoir de nombreux effets en activant des récepteurs P2X et P2Y. Le but de ce travail est d’investiguer si les récepteurs P2Y2 jouent un rôle de récepteurs de danger lors d’UAI. Pour ce faire, nous avons d’abord étudié in vitro l’effet des nucléotides extracellulaires sur la production d’IL-8 (cytokine connue pour son rôle chimiotactique lors d’UNI) par des cellules de l’EPR. Nous avons pu montrer que les nucléotides ATPγS, UTP et UDP, stimulent la sécrétion d’IL-8 tant basale qu’induite par le TNFα en activant la voie intracellulaire d’ERK1/2 via l’activation des récepteurs P2Y2 et P2Y6. Ensuite, in vivo, nous avons comparé le développement d’uvéites autoimmunes expérimentales entre des souris génétiquement déficientes pour le récepteur P2Y2 (P2Y2-/-) et des souris sauvages (P2Y2+/+) et avons pu montrer que le groupe P2Y2-/- était moins affecté par la maladie que le groupe sauvage contrôle. De même, après transfert adoptif de lymphocytes T autoréactifs semi-purifiés, les souris P2Y2-/- étaient moins malades que les souris P2Y2+/+ et le transfert adoptif de lymphocytes T autoréactifs semi purifiés de souris P2Y2-/- induisait moins de maladie que le transfert adoptif de cellules contrôles. En accord avec ces dernières données, nous avons mis en évidence que les LT autoréactifs semi-purifiés issus des souris P2Y2-/- immunisées proliféraient moins et sécrétaient moins de cytokines proinflammatoires que ceux issus des souris P2Y2+/+. Une série de co-cultures nous a permis de démontrer que ce déficit de prolifération provenait d’un défaut au niveau des CPA des souris P2Y2-/-. En conclusion, notre travail de thèse a mis en évidence que la stimulation des récepteurs P2Y augmente l’activation de l’EPR et des lymphocytes T autoréactifs, favorisant ainsi le développement d’UNI. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphocytes B jouent un rôle central dans l’immunité humorale par leur capacité à présenter des antigènes aux lymphocytes T, à sécréter des cytokines et à se différencier en plasmocytes produisant des anticorps. Ces fonctions peuvent être induites par leur stimulation in vitro. Par leur aptitude à présenter des antigènes indépendamment de la spécificité du récepteur des lymphocytes B (BCR), les lymphocytes B peuvent être utilisés comme cellules présentatrices d’antigènes (antigen-presenting cells, APC) afin d’induire la réponse cellulaire des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques. L’immunité cellulaire est cruciale pour prévenir les infections contre certains virus et en immunothérapie du cancer. L’objectif général de ces travaux est d’étudier la biologie des lymphocytes B. Plus particulièrement, nous souhaitons comprendre et améliorer leur fonction de présentation d’antigène afin d’utiliser les lymphocytes B comme source alternative d’APC. Dans la première partie de ces travaux, notre attention s’est portée sur la compréhension du mécanisme de présentation croisée par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) par lequel un épitope de la protéine gp100 du mélanome, inséré dans une nanoparticule pseudo-virale (VLP) composée de la protéine de surface du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV), est présenté par les lymphocytes B. Cette VLP est une plateforme vaccinale capable de stimuler le système immunitaire sans l’aide d’adjuvant et facilite la présentation croisée de l’épitope inséré, de façon indépendante de l’activité du protéasome. Les résultats obtenus démontrent que l’apprêtement de l’épitope inséré dans la nanoparticule s’effectue selon une voie de présentation croisée vacuolaire qui dépend de l’activité de la cathepsine S, de l’acidification des lysosomes et requiert l’induction de l’autophagie. Ainsi, nous avons défini plus précisément le mécanisme de présentation croisée par lequel les lymphocytes B apprêtent et présentent un épitope inséré dans la VLP de PapMV. Par la suite, nous avons cherché à améliorer le protocole d’activation in vitro permettant d’amplifier et d’induire les fonctions de présentation d’antigènes des lymphocytes B, dans le but d’utiliser ces cellules pour activer les réponses cellulaires des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Les stimulations in vitro des lymphocytes B par le CD40 ligand (CD40L) et l’interleukine (IL)-21 ou la combinaison de l’IL-4 et l’IL-21 au lieu de l’activation standard avec le CD40L et l’IL-4 ont été évaluées. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de la biologie des lymphocytes B. Nous avons démontré que la stimulation des lymphocytes B avec le CD40L et l’IL-21 augmente leur prolifération, mais mène à leur différenciation en plasmocytes sécrétant des anticorps. Au contraire, la stimulation avec le CD40L et l’IL-4 induit efficacement leur fonction de présentation d’antigènes. La stimulation des lymphocytes B avec le CD40L et la combinaison de l’IL-4 et de l’IL-21 augmente leur prolifération, mène seulement faiblement à leur différenciation en cellules sécrétrices d’anticorps, mais induit efficacement leur fonction de présentation d’antigènes. Nous avons démontré pour la première fois que cette méthode permet de générer des APC puissantes capables d’induire la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques in vitro. Nos résultats nous permettent de postuler que ces cellules pourraient être capables de mener à une réponse cellulaire in vivo. En tant qu’APC efficaces, les lymphocytes B pourraient être utilisés dans une stratégie vaccinale ou être employés comme APC afin d’améliorer les traitements d’immunothérapie du cancer par transfert adoptif de lymphocytes T. Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse ont porté tant sur la compréhension des mécanismes de présentation croisée d’un épitope inséré dans la VLP de PapMV par les lymphocytes B, que sur l’amélioration de la méthode permettant d’induire leur fonction de présentation d’antigènes pour activer les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Ces travaux de recherche fondamentale ont permis de contribuer à des avancées sur les connaissances de la biologie des lymphocytes B. Ils offrent de nouvelles pistes de réflexion quant aux utilisations biotechnologiques des lymphocytes B comme source alternative d’APC pour des applications de recherche fondamentale et clinique telles que la vaccination et les traitements d’immunothérapie du cancer. / B lymphocytes are central to humoral immunity due to their ability to present antigens to T cells, secrete cytokines and to differentiate into antibody-producing plasma cells. These functions can be induced by their in vitro stimulation. Being able to present antigens independently of the specificity of their B cell receptor (BCR), B cells can be used as antigen-presenting cells (APC) to induce specific cytotoxic CD8+ T cell cellular responses. Cellular immunity is crucial to prevent infections against viruses and in cancer immunotherapy. The main aim of this thesis is to study B cell biology. Specifically, we aim to deepen our understanding of their antigen presentation function and improve this function to use B cells as an alternative source of APC. First, we focused on deciphering the class I major histocompatibility complex (MHC-I) cross-presentation mechanism by which an epitope from gp100 melanoma protein, inserted in a virus-like particle (VLP) made of the coat protein of the papaya mosaic virus (PapMV), is presented by B cells. This VLP is a vaccine platform able to stimulate the immune system with no adjuvant and mediate a proteasome independent cross-presentation of the inserted epitope. Our results show that the inserted epitope is processed through a vacuolar pathway dependent on cathepsin S activity, lysosome acidification and requires the induction of autophagy. Thus, we provide a more detailed characterization of the mechanism used by B cells to process and cross-present an epitope inserted in PapMV VLP. Secondly, we aimed to improve the in vitro activation protocol used to expand B cells and induce their antigen presentation functions to use these cells to trigger cytotoxic CD8+ T cell cellular responses. We evaluated the in vitro stimulation of B cells with CD40 ligand (CD40L) and interleukin (IL)-21 or the combination of IL-4 and IL-21 instead of the standard activation method based on CD40L and IL-4. Our results deepen our knowledge of B cell biology. We showed that stimulating B cells with CD40L and IL-21 increases their proliferation but leads to their differentiation in antibody-producing plasma cells. In comparison, the stimulation with CD40L and IL-4 efficiently induces their antigen presentation function. The stimulation of B lymphocytes with CD40L and the combination of IL-4 and IL-21 increases their proliferation, weakly leads to their differentiation in antibody-secreting cells but is very efficient in inducing their antigen presentation function. We show for the first time that this method can generate potent APC able to induce cytotoxic CD8+ T cell responses in vitro. Our results allow us to hypothesize that these cells could be capable of triggering cellular immunity in vivo. As efficient APC, B cells could be used in a vaccination strategy or be employed as APC to improve cancer immunotherapy treatments such as adoptive cell transfer of T lymphocytes. Thus, the work presented in this thesis provides a deeper understanding of the antigen cross-presentation pathway by which B cells process and present an epitope inserted in PapMV VLP. It also reports an improved method to induce antigen presentation function of B cells to stimulate cytotoxic CD8+ T cells. This research work constitutes a leap forward in fundamental B cell research by increasing our knowledge of B cell biology. It also brings new opportunities regarding biotechnological uses of B cells as an alternative source of APC for fundamental and clinical applications such as vaccination and cancer immunotherapy treatments.