Le facteur de transcription STAT1 est un effecteur majeur de la réponse à l’interféron exerçant ainsi un rôle clé dans l’immunité innée. Il est également un suppresseur de tumeur et régule des effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques. Afin de mettre en évidence de nouvelles implications anti-tumorales de STAT1, ce projet de doctorat a porté sur son implication fonctionnelle i) dans l’expression des immunoglobulines (Ig), processus essentiel de l’immunité adaptative et ii) dans la réponse cellulaire aux traitements par les agents génotoxiquesNotre étude cinétique, après induction de l’expression de STAT1 dans des cellules initialement totalement déficientes, a montré son implication dans l’expression des IgG membranaires. Le mécanisme régulateur est indirect : il impliquerait une inhibition de l’activation de STAT3 conduisant à l’inhibition de l’expression de BLIMP1, un acteur essentiel de la différenciation plasmocytaire. La capacité de STAT1 à pouvoir se fixer sur le promoteur de BLIMP1, de même que STAT3 n’exclut pas une implication transcriptionnelle.Au cours d’un traitement génotoxique par le MNNG, nous avons décrit la participation de STAT1 à un complexe de réparation de l’ADN. Seule la présence de STAT1 permet l’intégration au complexe MLH1/p53 de la kinase c-Abl. Dans ce contexte, on observe une cytotoxicité sous le contrôle de l’activité kinase de c-Abl, une réparation rapide et efficace de l’ADN, un arrêt seulement transitoire du cycle et une orientation vers la survie cellulaire équivalent à une résistance à ce traitement.Ces résultats mettent en évidence deux nouveaux rôles anti-tumoraux de STAT1 par sa contribution à des complexes régulateurs essentiels et la désigne comme une potentielle cible thérapeutique. / The transcription factor STAT1, as a major effector of interferon, plays a key role in innate immunity. Through its strong anti-proliferative and pro-apoptotic properties STAT1 is also considered as a tumor suppressor. The aim of this project was to delineate new potential tumor suppressor properties for STAT1 in two signaling mechanisms: i) Ig expression in plasmacytoid cells and ii) cellular response to genotoxic stress.Our kinetic experiments, upon “de novo” expression of STAT1 in a rare STAT1-deficient cell line showed its modulation of membrane IgG expression. The underlying mechanism involves a STAT1-dependent inactivation of STAT3 and subsequently a decreased expression of BLIMP1, a major contributor to plasma cell differentiation. Since STAT1, like STAT3, is able to bind to the BLIMP1 promoter elements a transcriptional interference cannot be excluded.During alkylating agent treatment with MNNG we have observed the presence of STAT1 in DNA repair complex. STAT1 expression allows the recruitment into a MLH1/p53 complex of the kinase c-Abl. This complex leads to cytotoxic dependence on c-Abl kinase activity, an efficient DNA repair with a transient cell cycle arrest and to signaling mechanisms toward cell survival. At longer term of exposure STAT1 also lead to cellular resistance to treatment.These results provide evidences for new anti-tumor roles of STAT1 in two major regulatory systems and indicate STAT1 as a potential therapeutic target.

Le paludisme est la première endémie parasitaire mondiale causée par le protozoaire Plasmodium. Cette parasitose est responsable de 219 millions de cas et 660 000 décès par an. La prévalence et la mortalité élevées sont liées notamment à la résistance des parasites aux traitements existants, ce qui rend primordial le développement de nouvelles thérapeutiques. Pour ce faire, une meilleure connaissance de la biologie fondamentale du parasite est nécessaire. Dans ce contexte l’un des axes de recherche concerne la régulation du cycle cellulaire chez Plasmodium et notamment les mécanismes de phosphorylation/déphosphorylation qui sont essentiels.Parmi les nombreux acteurs des mécanismes de phosphorylation, la sérine/thréonine protéine phosphatase de type 2A (PP2A) est, avec PP1, l’une des phosphatases majeures. Cette phosphatase est impliquée dans de nombreux processus cellulaires notamment la mitose, la méiose ou encore l’apoptose. Elle est composée d’une sous-unité catalytique (PP2Ac), d’une sous-unité d’aide à l’agencement spatial (A) et d’une sous-unité régulatrice (B). Il existe quatre familles de sous-unités régulatrices contenant chacune plusieurs membres qui permettent de réguler la localisation, la spécificité et l’activité de PP2A. Il existe également des protéines régulatrices indépendantes, notamment les inhibiteurs 1 et 2, la protéine α4 et le PhosphoTyrosyl Phosphatase Activator (PTPA). Chez Plasmodium falciparum, la protéine phosphatase de type 2A ou PfPP2A a été identifiée et semble essentielle pour le développement asexué du parasite. Cependant, peu de choses sont connues sur sa régulation chez le parasite. En effet, seul l’inhibiteur 2 de PP2A a été décrit et caractérisé. Au cours de cette thèse, nous avons effectué par des études in silico un recensement des régulateurs putatifs de PfPP2A. Ces études nous ont permis d’identifier la sous-unité A et une unique sous-unité B. Parmi les régulateurs spécifiques, outre l’inhibiteur 2 déjà caractérisé, l’analyse du génome du parasite montre qu’il contient un orthologue de l’inhibiteur 1, d’α4 et de PTPA. Le projet de cette thèse s’articule autour de la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de l’un de ces régulateurs : PfPTPA.La caractérisation moléculaire de PfPTPA a permis de montrer dans ce travail la conservation de cette protéine au cours de l’évolution. L’analyse de sa séquence a révélé que cinq des six motifs de fixation à la PP2A identifiés chez l’homme sont conservés. Par des études in vitro et in vivo dans un modèle hétérologue, nous avons pu confirmer le rôle d’activateur de PfPTPA vis-à-vis de la PP2A. Par une approche de mutation unique d’acides aminés, nous avons identifié trois résidus impliqués dans l’interaction et l’activité de PfPTPA notamment le résidu G292 qui est essentiel pour l’interaction PfPTPA/PfPP2A. Nous avons ensuite montré par des études de génétique inverse que PfPP2A et PfPTPA, qui sont présents dans le même compartiment cellulaire au cours du cycle érythrocytaire, sont essentielles pour la complétion du cycle intra-érythrocytaire du parasite. De plus, PfPTPA semble impliqué dans le cycle cellulaire chez le xénope.En parallèle, l’analyse de la séquence de PfPTPA, a révélé la présence, spécifique au parasite, d’un motif de fixation à la PP1 (motif RVxF). L’identification de ce motif, nous a incités à étudier la relation entre PfPTPA et PfPP1. Nous avons ainsi pu montrer que PfPTPA était capable de se lier à PfPP1 même si elle est incapable de réguler son activité.L’ensemble de ce travail de thèse a permis de caractériser chez Plasmodium falciparum un activateur de la protéine phosphatase de type 2A et de montrer sa spécificité par rapport à la protéine humaine. Nos résultats, et notamment l’implication de PfPTPA dans la régulation du cycle cellulaire, font de ce régulateur une cible thérapeutique potentielle. / Malaria is the most deadly parasitic disease in the world caused by the Apicomplexa protozoan Plasmodium falciparum. This parasite is responsible for 219 million cases and 660 000 deaths per year and the drug resistance increases the prevalence and the morbidity. The emergence of multi-drug resistance requires the development of new therapeutics. Hence, a better understanding of parasitic fundamental biology is necessary. In this context, one research axis is the cell cycle regulation of Plasmodium, notably phosphorylation/dephosphorylation mechanisms which are essential for the parasite.Among the actors of the reversible phosphorylation, the serine/threonine phosphatase type 2A (PP2A) in eukaryote is, with PP1, one of the major phosphatases. It is involved in several cell processes like mitosis, meiosis or apoptosis. PP2A is composed of a catalytic subunit (PP2Ac), a scaffold subunit (A) and a regulatory subunit (B). There are four regulatory subunit families which regulate location, specificity and activity of PP2A. Furthermore, several independent regulatory proteins including inhibitor 1 and 2, the α4 protein or the phosphotyrosyl phosphatase activator (PTPA) were identified.In Plasmodium falciparum, the protein phosphatase type 2A named PfPP2A has been characterized and seems to be essential for the parasite asexual development as shown by the inhibition of parasitic growth after treatment with natural toxins inhibiting phosphatases. However, its regulation is still poorly understood in Plasmodium. Indeed, only the PP2A inhibitor 2 is characterized in P. falciparum and in P. berghei (a rodent specific Plasmodium species). Using an in silico study, we have identified a putative scaffold subunit and only one B subunit. Among the regulatory proteins, we have identified orthologs of the inhibitor 1, α4 and PTPA. The purpose of this thesis is to study PfPTPA both of the molecular and functional levels.The molecular characterization of PfPTPA showed the evolutionary conservation of this protein. The PfPTPA sequence analysis revealed that five out of six amino acids involved in interaction with PP2A in human, are conserved in P. falciparum. In vitro binding and functional studies revealed that PfPTPA binds to and activates PfPP2A. Mutation studies showed that three residues (V283, G292 and M296) of PfPTPA are indispensable for the interaction and that G292 residue is essential for its activity. Localization studies indicated that PfPTPA and PfPP2A are localized in the same cellular compartment throughout the erythrocytic cycle of P. falciparum, suggesting a possible interaction of both proteins in vivo. In Plasmodium falciparum, genetic studies likely suggested the essentiality of PfPTPA for the completion of intraerythrocytic parasite lifecycle. Functionnal studies, using Xenopus oocyte, showed that PfPTPA blocked the G2/M transition. Further analysis of PfPTPA sequence revealed that PfPTPA, unlike its human counterpart, possess one of the most canonical binding motif to PP1 (RVxF motif). The identification of this RVxF motif led us to study the role PfPTPA on PfPP1. Thus, we have shown that PfPTPA interacts with PfPP1 but was unable to regulate PfPP1 activity in vitro. This work allowed characterizing the PfPTPA, an activator of protein phosphatase type 2A in Plasmodium falciparum and to show some specificities when compared to its human ortholog. Our data which suggest that this regulator could be involved in cell cycle regulation, together with its essentiality for the growth of P. falciparum strongly support the idea to explore it as potential drug target.

Class of 2006 Abstract / Objectives: To determine the cost-effectiveness of urokinase (UK) and alteplase (recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA) when used intra-arterially for the treatment of acute peripheral arterial occlusions. Methods: A decision analytic model was constructed using TreeAge Pro 2005 Suite to determine the cost- effectiveness of these therapies. Data for costs and probabilities were collected from published literature, as well as other references. Average and incremental cost-effectiveness ratios were calculated with a 95% confidence interval. A two-dimensional (sampling plus trials) Monte Carlo analysis with 5,000 patients was performed, along with a sensitivity analysis of the costs and variables. The costs measured were direct medical costs from the perspective of the healthcare institution. The primary outcome variable assessed in this model was 30-day survival. Results: The Monte Carlo microsimulation indicated that average cost-effectiveness (C/E) ratio for rt-PA was $54,141 (95th CI: 44,647 to 62,832) per successful treatment, while the average C/E ratio for UK was $65,515 (95th CI: 56,286 to 76,135). The ICER for rt-PA versus UK as the baseline was calculated to be $284,170 per additional survival over 30 days (95th CI: 186,097 to 418,443). Neither strategy was dominant. Conclusions: This study found rt-PA to be less costly but also slightly less efficacious than UK for patients treated for acute arterial occlusions. Neither therapy was indicated to be dominant over the other in terms of 30-day survival. Further long-term outcome data is necessary to more extensively assess the benefits of each therapy.

La dépression majeure représente l’une des affections les plus lourdes dans le monde, touchant plus de 350 millions depersonnes. La 5e édition du Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-V) est la référence mondiale utiliséepour poser le diagnostic de la pathologie chez l’humain. Bien que très nombreux, les antidépresseurs prescrits à ce jour restentencore malheureusement inefficaces pour 30% des patients. Dans ce contexte, il est fondamental de développer de nouvellesstratégies thérapeutiques pour soigner les patients. Des études récentes suggèrent, sans toutefois le démontrer véritablement,l’implication de l’axe « activateur tissulaire du plasminogène / inhibiteur de l’activateur tissulaire du plasminogène de type 1 »(axe tPA/PAI-1) dans la pathogenèse de la dépression majeure.La première partie de mes travaux a été consacrée à la mise au point d’un nouveau système d’évaluation comportementalede la dépression majeure chez la souris en modélisant de manière exhaustive et standardisée les symptômes cliniques du DSMV.La seconde partie de mes travaux a consisté à étudier les mécanismes d’action potentiels de l’axe tPA/PAI-1 dans ladépression majeure. Pour ce faire, j’ai tout d’abord caractérisé le phénotype comportemental de souris déficientes en tPA (souristPA-/-) et en PAI-1 (souris PAI-1-/-), ainsi que de leurs homologues de type sauvage, grâce au système fonctionnel d’évaluationinitialement mis en place. Par ailleurs, du fait de la forte comorbidité entre anxiété et dépression, les comportements de typeanxieux ont également été analysés chez ces animaux. Mes expériences ont révélé un phénotype de type dépressif, indépendantdu tPA, chez les souris déficientes en PAI-1, associé à des diminutions des concentrations de deux monoamines (sérotonine etdopamine) dans des structures cérébrales connues pour être impliquées dans la dépression majeure (hippocampe et noyau du litde la strie terminale). De surcroît, l’enrichissement modéré de l’environnement n’amenuise pas les symptômes de type dépressifdes souris PAI-1-/- mais conduit cependant à la disparition des troubles anxieux dépendants, quant à eux, de l’axe tPA/PAI-1.La troisième partie de ma thèse a été dédiée à des manipulations pharmacologiques visant à tester l’efficacitéd’antidépresseurs de type inhibiteurs de la recapture de la sérotonine. L’escitalopram produit un effet anxiolytique chez les sourisdéficientes en PAI-1, sans toutefois contrebalancer le phénotype dépressif chez ces mêmes sujets. Qui plus est, la fluoxétine, àla même dose que l’escitalopram, est toxique pour ces souris.Les résultats de ma thèse apportent ainsi la première démonstration de l’implication de PAI-1 dans la dépression majeurepar un mécanisme indépendant de son interaction avec le tPA. Ces travaux démontrent également que la souris PAI-1-/- constitueun outil essentiel et innovant pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la dépression majeure, ainsique pour la recherche de cibles thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des traitements. / Major depressive disorder is one of the heaviest mental disorders in the world, affecting more than 350 people worldwide.It is in the fifth edition of Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-V) that the basis for an internationallyadmitted diagnosis was laid. Albeit diverse, existing antidepressants still remain ineffective for 30% of the patients. Under suchcircumstances, the necessity of developing new therapeutical strategies has arisen. Recent studies tend to suggest, withoutabsolute demonstration, the implication of the axis "Tissue Plasminogen Activator / Plasminogen Activator Inhibitor type-1"(tPA/PAI-1 axis) in the pathogenesis of major depressive disorders.The first section of my works has been devoted to the development of a new system of behavioural assessment in micefor depressive-like disorders, through a comprehensive and standardised modelling of clinical symptoms of DSM-V.The second section of my works has consisted in studying the potential action mechanisms of the tPA/PAI-1 axis in theemergence of depressive-like disorders. To do so, I first had to identify the behavioural phenotype of mice having from a tPA(tPA-/- mice) and PAI-1 (PAI-1-/-mice) deficiency as well as their wild-type counterparts through the system of assessment setup in the beginning of my research. In addition, due to the significant comorbidity between anxiety and depression, anxious-likebehaviours have been analysed as well. Among PAI-1-deficient mice, my experiments have disclosed a depressive-likephenotype, independent of tPA, and correlated with a decrease in the concentration of two monoamines (serotonin and dopamine)in brain structures known to be involved in major depressive disorder (hippocampus and bed nucleus of the stria terminalis).Besides, the moderate enrichment of the environment does not reduce the depressive-like symptoms of PAI-1-/- mice, yet inducesthe dissipation of dependent-tPA/PAI-1 axis anxious disorders.The third section of my PhD has been devoted to pharmacological experiments meant to assess the effectiveness ofantidepressants classified among selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Escitalopram produces anxiolytic falloutsamong PAI-1-deficient mice without for all that offsetting the depressive phenotype among these same mice. Moreover,fluoxetine administered in the same concentration as escitalopram has proven to be toxic for these mice.The results of these doctoral experiments have therefore demonstrated for the first time the implication of PAI-1 in theprocess of major depressive disorder through a mechanism independent from its interaction with tPA. These works have alsodemonstrated that PAI-1-/- mice make up a fundamental and cutting edge tool to study the cellular and molecular mechanismsunderlying major depressive disorder as well as to develop competent therapeutical targets intended to improve the efficiency oftreatments.

L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase initialement découverte dans le sang pour sa capacité à convertir le plasminogène en plasmine, une enzyme capable de dégrader les chaînes de fibrine des caillots sanguins. Pour cette fonction pro-fibrinolytique, le tPA est le seul traitement pharmacologique aujourd’hui utilisé dans la phase aiguë de l’accident vasculaire cérébral (AVC) de type ischémique, même s’il présente plusieurs limites. Outre son rôle dans la fibrinolyse, le tPA est aussi capable de moduler différents phénomènes physiologiques et pathologiques au sein du système nerveux central et de l’unité neurovasculaire, tels que la mémoire, l’excitotoxicité ou encore le couplage neurovasculaire comme décrit plus récemment. Plusieurs fonctions du tPA impliquent son interaction avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate (NMDA), qui permet de potentialiser leur signalisation. Sur le plan structurel, deux formes du tPA ont été identifiées : une forme simple chaîne (sc-tPA) et une forme double chaîne (tc-tPA). Ces deux formes, dont les proportions peuvent varier dans la solution administrée aux patients pour la thrombolyse post-AVC ischémique, partagent certaines fonctions communes mais peuvent aussi avoir des actions différentes. Le premier objectif de nos travaux visait à mieux comprendre l’implication du tPA dans le couplage neurovasculaire, un phénomène essentiel au fonctionnement cérébral permettant aux régions en activité de bénéficier d’un apport accru en sang afin de subvenir à la demande énergétique des neurones. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux effets des formes sc-tPA et tc-tPA utilisées lors de la thrombolyse dans un modèle murin d’AVC ischémique thromboembolique.Premièrement, nos résultats mettent en évidence la capacité du tPA vasculaire à augmenter l’hyperhémie fonctionnelle dans le cadre du couplage neurovasculaire. En effet, nous montrons chez la souris que le tPA vasculaire peut interagir avec les récepteurs NMDA présents à la surface des cellules endothéliales des artères et artérioles, et augmenter leur dilatation lors d’une activité neuronale. D’autre part, dans le cadre de l’ischémie cérébrale, nos résultats indiquent que lorsqu’ils sont utilisés pour la thrombolyse précoce, le sc-tPA et le tc-tPA ont des effets différents et parfois opposés. Le sc-tPA permet de réduire les volumes de lésion et d’améliorer la récupération fonctionnelle, alors que le tc-tPA est moins efficace pour réduire la lésion et ne diminue pas les déficits fonctionnels. De fait, nos données montrent que le tc-tPA aggrave l’altération de l’intégrité de la barrière hématoencéphalique par rapport au sc-tPA. Dans l’ensemble, ces données permettent d’améliorer les connaissances sur les mécanismes d’actions du tPA dans des phénomènes physiologiques et pathologiques importants. Nos travaux soulignent également la nécessité de prendre en compte les différences entre les formes de tPA dans l’amélioration du traitement actuel des AVC et dans l’élaboration de futures stratégies thérapeutiques impliquant cette molécule. / The tissue-type plasminogen activator (tPA) is a serine protease initially discovered in the blood for its ability to convert plasminogen into plasmin, an enzyme capable of degrading fibrin chains of blood clots. tPA is the only pharmacological treatment currently used for the acute phase of ischemic stroke, although it has several limitations. Besides its role in fibrinolysis, tPA also modulates various physiological and pathological phenomena within the central nervous system and neurovascular unit, such as memory, excitotoxicity and neurovascular coupling, which has been described recently. Several functions of tPA involve its interaction with N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) receptors, which leads to an increase in NMDA signaling. Structurally, two forms of tPA have been identified: a single chain form (sc-tPA) and a double chain form (tc-tPA). These two forms, whose proportions vary in the solution administered for thrombolysis during ischemic stroke, share some common functions but may also differ in their therapeutic action. The first objective of our work was to better understand the implication of tPA in neurovascular coupling, which is an essential phenomenon for cerebral functioning that allows active brain regions to benefit from increased blood supply in order to meet local energy demands. In the second part of our work, we investigated the effects of sc-tPA and tc-tPA in a murine model of ischemic thromboembolic stroke.Our results establish a role for vascular tPA in increasing functional hyperemia in neurovascular coupling. We show that vascular tPA interacts with NMDA receptors present at the surface of endothelial cells of arteries and arterioles to increase their dilation during neuronal activity. In the context of cerebral ischemia, our results indicate that when administered during early thrombolysis, sc-tPA and tc-tPA have different and sometimes opposite effects. tc-tPA is less effective than sc-tPA in reducing lesion volume and protecting against functional impairment. In fact, our data show that tc-tPA worsens the integrity of the blood-brain barrier compared to sc-tPA. Overall, these data improve our knowledge of the mechanisms of action of tPA in important physiological and pathological phenomena. Our work underlines the need to take into account differences between sc-tPA and tc-tPA when trying to improve the current treatment for stroke and in the development of future therapeutic strategies involving this molecule.

L'anevrysme intracrânien (AIC) est une anomalie morphologique spécifique des artères cérébrales exposant au risque, particulièrement grave, de saignement intracrânien. Malgré les progrès établis dans le traitement curatif , aucun traitement préventif de la formation des AIC n’a été prouvé chez l’Homme. L’absence de traitement non invasif et l’absence de consensus sur le traitement des AIC non rompus sont le corolaire direct d’un manque de connaissance des mécanismes physiopathologiques de la maladie anévrysmale.L’ensemble du travail exposé ici a eu pour but de mieux comprendre les mécanismes de la pathologie anévrysmale intracrânienne pouvant être la base de nouvelles stratégies préventive améliorant le traitement des AIC.Nous avons tout d'abord étudié l'influence des anomalies du tissus de soutien des artères cervicales sur la formation des AIC. Au cours de cette étude, nous avons réalisé une étude cas-témoins dont l’objectif principal était d’étudier l’association entre les anomalies morphologiques des artères cervicales et la présence d’un AIC. Les objectifs secondaires étaient premièrement d’examiner si cette association variait selon le caractère rompu ou non de l’anévrisme et deuxièmement d’examiner si la sévérité des anomalies artérielles cervicales était liée à la sévérité de la pathologie anévrismale. Nous rapportons que la prévalence des anomalies angiographiques chez les patients porteurs d’AIC est élevée. De plus l’incidence d’une pathologie rare, la dysplasie fibro-musculaire est très élevée chez les patients porteurs d’AIC comparativement à la population générale. La présence des anomalies angiographiques n’a aucun impact sur l’évolution naturelle des AIC vers la rupture, ni sur d’autres aspect comme leur taille, leurs nombres ou leur forme. Dans le cadre de notre étude, nous pensons que l’association entre les anomalies angiographiques et les AIC semble être expliquée par l’hypothèse d'une vulnérabilité du tissu de soutien pariétal (condition pathologique particulière de la paroi artérielle à l’origine de la formation des AIC). Cette condition pathologique, affecterait de manière diffuse la vascularisation cérébrale et les artères cervicales. Les AIC seraient ainsi des manifestations cliniquement « bruyantes » de pathologies vasculaires plus silencieuses affectant la paroi de l’ensemble des vaisseaux. Les anomalies morphologiques des artères cervicales témoignent de façon sensible mais très peu spécifique de l’association des pathologies du tissu de soutien avec la présence d’AIC.Dans une deuxième partie nous essayons de décrire et de caractériser une voie inédite de la formation et de la croissance des AIC, la voie de la fibrinolyse via l'activateur de plasminogène de type tissulaire (tPA). Nos données suggèrent que le tPA présent dans la circulation sanguine est suffisant pour favoriser la formation et la rupture des anévrismes. Nous avons donc proposé que le tPA vasculaire était un des responsables de la formation des AIC. Nous avons également constaté une certaine continuité dans le temps de l'influence du tPA sur le remodelage matriciel. Nous avons donc proposé le tPA vasculaire comme une nouvelle cible possible pour prévenir la progression et la rupture des AIC. Différentes expériences ont été entreprise pour inhiber sélectivement le tPA et les résultats préliminaires sont encourageants et ouvrent la voie à une stratégie thérapeutique non invasive inédite. On peut aussi imaginer que ces différentes approches puissent être combinées entre elles et avec des agents matriciels ciblant directement l’activité du tPA dans la paroi des AIC. L’amélioration des stratégies thérapeutiques dans la pathologie anévrysmale intracrânienne est définitivement un axe de recherche dont les possibilités sont immenses et les résultats nécessaires et attendus. / Intracranial aneurysm (IA) is a specific morphological abnormality of the cerebral arteries that exposes to devastating intracranial bleeding. Despite the progress made in the curative treatment, no preventive treatment of IA formation has been proven in humans. The lack of non-invasive treatment and consensus on the treatment of unruptured IA are the consequences of the lack of knowledge of the physiopathological mechanisms of aneurysmal disease. All of the work presented here aims to better understand the mechanisms of intracranial aneurysmal pathology, which may be the basis of new preventive strategies improving the treatment of IA.We first studied the influence of cervical artery abnormalities on IA formation. In this study, we performed a case-control study whose main objective was to study the association between morphologic abnormalities of cervical arteries and the presence of IA. The secondary objectives were first to examine whether this association varied according to whether or not the aneurysm was broken, and secondly to examine whether the severity of the cervical arterial abnormalities was related to the severity of the aneurysmal pathology. We report that the prevalence of angiographic abnormalities in patients harboring IA is high. In addition, the incidence of a rare pathology, fibro-muscular dysplasia is very high in patients with IA compared to the general population. The presence of angiographic abnormalities has no impact on the rupture of the IA, nor on other aspects such as their size, numbers or shape. In our study, we believe that the association between angiographic abnormalities and IA seems to be explained by the hypothesis of a vulnerability of the arterial wall (a particular pathological condition of the arterial wall at the origin of IA formation). This pathological condition would affect the whole cerebral vasculature and cervical arteries. IA would thus be the clinical manifestations of more silent vascular pathologies affecting the wall of all vessels. The morphological abnormalities of the cervical arteries testify sensitively but not very specifically of the association of the arterial wall diseases with the presence of IA.In a second study, we try to describe and characterize an unprecedented pathway of formation and growth of IA : the pathway of fibrinolysis via tissue-type plasminogen activator (tPA). Our data suggest that tPA present in the bloodstream is sufficient to promote formation and rupture of aneurysms. We therefore proposed that vascular tPA was one of those responsible for training IA. We also noted a certain continuity in the time of the influence of the tPA on the matrix remodeling. We therefore proposed vascular tPA as a possible new target to prevent progression and rupture of IA. Various experiments have been undertaken to selectively inhibit tPA and the preliminary results are encouraging and open the way to an unprecedented non-invasive therapeutic strategy. It is also conceivable that these different approaches could be combined with each other and with matrix agents directly targeting tPA activity in the AIC wall. The improvement of therapeutic strategies in intracranial aneurysmal pathology is definitely an topic of ​​research whose possibilities are huge and the results necessary and expected.

L’activateur tissulaire du plasminogène est une sérine protéase initialement découverte dans le compartiment vasculaire et qui joue un rôle prépondérant dans le processus de fibrinolyse. De manière intéressante, le tPA est également présent dans le parenchyme cérébral, où il est notamment exprimé par les neurones. Le tPA est impliqué dans de nombreuses fonctions cérébrales dont la plasticité synaptique, les processus de mémoire et d’apprentissage ainsi que dans la survie et la mort neuronales. Le tPA est capable d’augmenter la signalisation calcique induite par une activation des récepteurs N-Méthyl-D-Aspartate (NMDAR) : un mécanisme à la base de la plasticité synaptique mais également de la mort neuronale excitotoxique. Cependant, il peut également activer les récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR) pour induire un effet anti-apoptotique sur les neurones. Afin de mieux comprendre les différentes fonctions du tPA sur les neurones, nous nous sommes intéressés à la distribution et au trafic intracellulaire du tPA. Pour cela, nous avons créé un nouvel outil afin d’imager le tPA dans les neurones en temps réel: un plasmide codant pour une protéine fusion, le tPA-HaloTag®.Premièrement, nos résultats montrent que le tPA est présent dans les axones et les dendrites des neurones corticaux matures en culture et qu’il est majoritairement présent dans le compartiment post-synaptique. Cette étude a également permis de voir que le tPA est stocké et libéré par des vésicules d’exocytose VAMP2, qu’il peut être endocyté par des vésicules Rab5, recyclé par des vésicules Rab11 et dégradé par des vésicules Rab7. Deuxièmement, nous avons montré que le tPA est présent dans les mêmes vésicules synaptiques que le facteur neurotrophique issu du cerveau (BDNF) : une neurotrophine importante pour le bon fonctionnement cérébral et dont la maturation dépend de l’activité protéolytique du tPA. Ce travail fournit une meilleure compréhension du rôle et de la distribution du tPA dans les neurones et ouvre de nouvelles voies de recherche dans l’implication de du tPA et du BDNF dans la survie neuronale. / Tissue-type Plasminogen Activator (tPA) is a serine protease, firstly discovered for its fibrinolytic role in the vascular compartment. Interestingly, tPA is also present in the brain parenchyma, being notably expressed by neurons. tPA displays important roles in synaptic plasticity(Danny Baranes et al., 1998; Melchor and Strickland, 2006), learning, memory processes(R Madani et al., 1999; R Pawlak et al., 2002), neuronal survival and death. tPA is able to promote N-Methyl-D-Aspartate Receptors (NMDAR)-induced calcium influx, promoting synaptic plasticity or excitotoxic neuronal death. tPA is also able to activate Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR), a mechanism mediating its anti-apoptotic effect. To better understand the different functions of tPA on neurons, we studied the pattern of distribution and trafficking of neuronal tPA. For that, we designed a new tool to image tPA in living neurons: a plasmid encoding for a tPA-HaloTag® fusion protein. We first found that tPA is present in both axons and dendrites of mature cultured cortical neurons and preferentially at the post-synaptic part. Our results also showed that tPA is stored and released by VAMP2 exocytotic vesicles, and can be endocytosed by Rab5 vesicles, recycled by Rab11 vesicles and degraded by Rab7 vesicles. Furthermore, tPA is localized and sorted in the same vesicles than Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), one of the most important neurotrophins, Interestingly, BDNF maturation is dependent of tPA proteolytic activity. This work provides a better understanding of the role and distribution of tPA in living neurons and opens new avenues into the involvement of tPA and BDNF in neuronal survival.

L'ischémie cérébrale est une pathologie complexe impliquant une cascade de mécanismes cellulaires qui conduisent, entre autres, à une augmentation de l’autophagie dans les neurones. Bien que l’activation de l’autophagie dans l’AVC ischémique soit aujourd’hui un fait avéré, le rôle de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA ; médicament utilisé dans la phase aigüe de l’AVC ischémique et neuromodulateur du système nerveux central) n’a jamais été décrit. Le tPA est une sérine protéase initialement découverte dans le compartiment vasculaire jouant un rôle important dans la fibrinolyse. Mais le tPA est aussi exprimé dans le parenchyme cérébral où il intervient dans le système glutamatergique, la plasticité synaptique et la survie neuronale. Afin de mieux comprendre les effets moléculaires du tPA dans l’autophagie, nous avons utilisé un modèle in vitro d'ischémie cérébrale consistant à sevrer en oxygène et en glucose (OGD) puis à réoxygéner des neurones corticaux primaires murins avec ou sans tPA. Nous avons confirmé, dans un premier temps, que l’OGD induit une autophagie délétère via une diminution de l’axe PI3K/Akt/mTORC1. Nous avons ensuite étudié l’effet du tPA sur l’autophagie induite par l’OGD. Nos résultats démontrent que le tPA protège les neurones de la mort induite par l’OGD en réduisant l’autophagie via l’activation du récepteur du facteur de croissance à l'insuline (IGF-1R, un récepteur tyrosine kinase) et de la voie PI3K/Akt/mTOR. Ce travail de thèse a donc permis de décrire le rôle neuroprotecteur et anti-autophagique du tPA, et d’identifier un nouveau récepteur cible du tPA : IGF-1R. / Cerebral ischemia is a complex pathology involving a cascade of cellular mechanisms leading, among other things, to an increase of neuronal autophagy. The activation of autophagy in ischemic stroke conditions is now well accepted, but the role of tissue-type plasminogen activator (tPA, a drug used in the acute phase of ischemic stroke, and a neuromodulator) on this pathway has never been studied. tPA is a serine protease originally discovered in the vascular compartment, that plays an important role in fibrinolysis. Interestingly, tPA is also expressed in the cerebral parenchyma where it is involved in the glutamatergic neurotransmission, synaptic plasticity and neuronal survival. To better understand molecular effects of tPA on autophagy, we used an in vitro model of cerebral ischemia consisting in an oxygen and glucose deprivation (OGD) followed by reoxygenation, on murine primary cortical neurons with or without tPA. First we reported that OGD enhances deleterious autophagy through the decrease of PI3K/Akt/mTOR pathways. Then, we investigated the effect of tPA on OGD-induced autophagy. Our results demonstrate that tPA protects neurons from OGD-induced death by reducing autophagy through Insulin Growth Factor Receptor (IGF-1R, a tyrosine kinase receptor) and an increase of PI3K/Akt/mTOR pathways. This thesis has made it possible to describe the neuroprotective and anti-autophagic effect of tPA, and to identify a new target receptor for tPA: IGF-1R.

Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) can be used as adaptable DNAbinding modules to create site-specific chimeric nucleases or synthetic transcriptional regulators. The central repeat domain mediates specific DNA binding via hypervariable repeat di-residues (RVDs). This DNA-Binding Domain can be engineered to bind preferentially to any user-selected DNA sequence if engineered appropriately. Therefore, TALEs and their derivatives have become indispensable molecular tools in site-specific manipulation of genes and genomes. This thesis revolves around two problems: in silico design and improved binding site prediction of TALEs. In the first part, a study is shown where TALEs are successfully designed in silico and validated in laboratory to yield the anticipated effects on selected genes. Software is developed to accompany the process of designing and prediction of binding sites. I expanded the functionality of the software to be used as a more generic set of tools for the design, target and offtarget searching. Part two contributes a method and associated toolkit developed to allow users to design in silico optimized synthetic TALEs with user-defined specificities for various experimental purposes. This method is based on a mutual relationship of three consecutive tandem repeats in the DNA-binding domain. This approach revealed positional and compositional bias behind the binding of TALEs to DNA. In conclusion, I developed methods, approaches, and software to enhance the functionality of synthetic TALEs, which should improve understanding of TALEs biology and will further advance genome-engineering applications in various organisms and cell types.

Background: Clinical factors associated with exclusion from recombinant tissue plasminogen activator in both men and women are not completely understood. The aim of this study is to determine whether there is a gender difference in clinical risk factors that excluded ischemic stroke patients with a history of smoking from recombinant tissue plasminogen activator. Methods: Retrospective data from a stroke registry were analyzed, and multivariable linear regression models were used to determine gender differences. Logistic regression models determined exclusion clinical risk factors for thrombolysis in male and female acute ischemic stroke patients with a history of smoking, while sequentially adjusting for sociodemographic, clinical, and stroke-related variables. The Kaplan–Meier survival analysis was used to determine the exclusion probabilities of men and women with a history of smoking within the stroke population. Results: Of the 1,446 acute ischemic stroke patients eligible for recombinant tissue plasminogen activator, 379 patients with a history of smoking were examined, of which 181 received recombinant tissue plasminogen activator while 198 were excluded from receiving recombinant tissue plasminogen activator. Of the 198 patients, 75 females and 123 males were excluded from receiving recombinant tissue plasminogen activator. After multivariable adjustment for age, National Institutes of Health scores, and stroke-related factors, females who present with weakness/paresis on initial examination (OR = 0.117, 95% CI, 0.025–0.548) and men who present with a history of previous transient ischemic attack (OR = 0.169, 95% CI, 0.044–0.655), antiplatelet medication use (OR = 0.456, 95% CI, 0.230–0.906), and weakness/paresis on initial examination (OR = 0.171, 95% CI, 0.056–0.521) were less likely to be excluded from recombinant tissue plasminogen activator (thrombolysis therapy). Conclusions: In an ischemic stroke population with a history of smoking, female smokers are more likely to be excluded from thrombolysis therapy in comparison to men, even after adjustment for confounding variables.