Human RPA (replication protein A), a single-stranded DNA-binding protein, is required for many cellular pathways including DNA repair, recombination and replication. However, the role of RPA in nucleotide excision repair remains elusive. In the present study, we have systematically examined the binding of RPA to a battery of well-defined ssDNA (single-stranded DNA) substrates using fluorescence spectroscopy. These substrates contain adducts of (6-4) photoproducts, N-acetyl-2-aminofluorene-, 1-amino-pyrene-, BPDE (benzo[a]pyrene diol epoxide)- and fluorescein that are different in many aspects such as molecular structure and size, DNA disruption mode (e.g. base stacking or non-stacking), as well as chemical properties. Our results showed that RPA has a lower binding affinity for damaged ssDNA than for non-damaged ssDNA and that the affinity of RPA for damaged ssDNA depends on the type of adduct. Interestingly, the bulkier lesions have a greater effect. With a fluorescent base-stacking bulky adduct, (+)-cis-anti-BPDE-dG, we demonstrated that, on binding of RPA. the fluorescence of BPDE-ssDNA was significantly enhanced by up to 8-9-fold. This indicated that the stacking between the BPDE adduct and its neighbouring ssDNA bases had been disrupted and there was a lack of substantial direct contacts between the protein residues and the lesion itself. For RPA interaction with short damaged ssDNA, we propose that, on RPA binding, the modified base of ssDNA is looped out from the surface of the protein, permitting proper contacts of RPA with the remaining unmodified bases.

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A significant focus of toxicological research is the identification of electrophiles that covalently modify DNA to form addition products (adducts). These products can be generated when aryl radical species react at the C8-site of 2'-deoxyguanosine (dG) to form C8-aryl-dG adducts, which are mutagenic lesions. While this form of DNA modification is detrimental, C8-aryl-dG adducts also possess intriguing properties that can be exploited for beneficial purposes. This thesis is an investigation of one mechanism believed to contribute to the mutagenicity of C8-aryl-dG adducts, as well as a study of the photophysical properties of adducts that allow for their application as fluorescent probes. A common property of C8-aryl-dG adduction is accompaniment of abasic site formation. To determine how the C8-aryl moiety contributes to sugar loss, UV-Vis spectroscopy has been employed to determine hydrolysis kinetics, with C8-aryl-dG adducts found to be more prone than dG to acid-catalyzed hydrolysis. Despite adduct reactivity in acidic media, all adducts are relatively stable at pH 7, suggesting they are unlikely intermediates of abasic site formation at physiological pH. These results have allowed for development of a new rationale for depurination observed upon C8-aryl-dG adduction within duplex DNA. The determination of photophysical parameters of C8-heteroaryl-dG adducts reveals that these nucleosides behave as fluorophores with high fluorescence quantum yields (φfl). These adducts also exhibit emission sensitivity to their solvent environment and H-bonding interactions. C8-Heteroaryl-dG adducts were incorporated in the oligonucleotide 5'-CTCG1G2CG3CCATC, at the G1 and G3 sites, that contains the recognition sequence of the NarI Type II restriction enzyme. Hybridization of the modified NarI oligonucleotides to the complementary strand containing either the C or G nucleobase opposite the adduct allowed for characterization of duplex structures by circular dichroism (CD), UV melting temperature analysis and fluorescence spectroscopy. Results suggest that the C8-heteroaryl-dG adduct favours an anti conformation with base-paired with C, while a syn conformation is favoured when base-paired to G. Adduct conformation of bulky C8-dG adducts is believed to be correlated with their known mutagenic activity. C8-Heteroaryl-dG modified nucleosides could therefore be used as fluorescent models of these adducts to aid in elucidation of adduct-induced mutagenesis in biological systems. / NSERC

Vários adutos resultantes da reação de aldeídos α,β-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-εdGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-εdGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos. / Vários adutos resultantes da reação de aldeídos α,β-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-εdGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-εdGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos.

Vários adutos resultantes da reação de aldeídos α,β-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-εdGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-εdGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos. / Vários adutos resultantes da reação de aldeídos α,β-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-εdGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-εdGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos.

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Bastões plásticos quimioluminescentes, chamados light sticks, são usados por companhias pesqueiras e descartados nas praias. Moradores locais utilizam seus conteúdos como repelentes, óleo bronzeador e medicamento para dores nas articulações. Nós investigamos a reatividade das soluções de bastões de light sticks coletados em praias brasileiras e a toxicidade celular de seus conteúdos e também de soluções de light stick de bastões novos. Produtos da reação dos conteúdos de light stick descartado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo) foram analisados por HPLC/UV/ESI-MS/MS. Um aduto foi purificado e caracterizado em espectrômetro de massas por Dissociação Induzida por Colisão (CID) e através de experimentos de 1H RMN. A estrutura do aduto revelou que o produto de degradação de bis(triclorofenil)oxalato é reativo para nucleófilos in vitro. O mesmo aduto foi detectado em DNA de timo de bezerro incubado in vitro com a solução do light stick descartado pelo uso HPLC/ESI-MS/MS. Além do DNA, albumina também foi modificada pelos conteúdos de light stick descartado. Células HepG2 foram incubadas por 16 h com 0.0125% - 0.12% (v/v) das soluções de light sticks: (i) coletadas na praia, (ii) obtidas imediatamente após a reação quimioluminescente no laboratório, e (iii) previamente a reação, contendo ou n-butil-ftalato, difenilantraceno, e bis(triclorofenil)oxalato (solução 1), ou dimetil-ftalato, H2O2, e salicilato de sódio (solução 2). A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste do XTT, corante cristal violeta e lactato desidrogenase realizados em placas de 96 poços. Com as concentrações testadas foram obtidas significativamente a morte celular. O dano oxidativo ao DNA celular foi avaliado pela análise da 8-oxo-2\'-desoxiguanosina através do equipamento HPLC/ESI-MS/MS, que revelou aumento de alterações nas células tratadas com 0.006% das soluções de light stick de bastões descartados e novos. Nossos dados apontam genotoxicidade e citotoxicidade das soluções de light sticks e podem contribuir como alerta a autoridades públicas para proibição do uso incontrolado. / Chemiluminescent plastic rods, called light sticks, are used by fishery companies and littered on the shores. Local inhabitants use their contents as repellents, tanning oil, and medicine for joint pain. We have investigated the reactivity of spent light stick solutions collected on brazilian beaches and the cellular toxicity of their contents as well as that of brand-new light stick solutions. Products of the reaction of the spent light stick contents with 2\'-deoxyguanosine (dGuo) were analyzed by HPLC/UV/ESI-MS/MS. A dGuo adduct was purified and characterized in a Collision Induced Dissociation (CID) mass spectrometer and through 1H NMR experiments. The adduct structure revealed that a degradation product of bis(trichlorophenyl)oxalate is reactive towards nucleophiles in vitro. The same adduct was detected in calf thymus DNA incubated in vitro with spent light stick solution, by using HPLC/ESI-MS/MS. Besides DNA, albumin was also modified by spent light stick contents. HepG2 cells were incubated for 16 h with 0.0125% 0.12% (v/v) of light stick solutions: (i) collected on the beaches, (ii) obtained immediately after the chemiluminescent reaction in the laboratory, and (iii) previously the reaction, containing either n-butyl-phthalate, diphenylanthracene, and bis(trichlorophenyl)oxalate (solution 1), or dimethyl-phthalate, H2O2, and sodium salicylate (solution 2). Cell survival was evaluated by the XTT, crystal violet dye, and lactate dehydrogenase assays performed in 96 well plates. The concentrations tested were found to significantly kill cells. Oxidative damage to cellular DNA was assessed by 8-oxo-2\'-deoxyguanosine analysis via an HPLC/ESI-MS/MS equipment, which revealed increased changes in cells treated with 0.006% of spent and brand-new light stick solutions. Our data point to important genotoxicity and cytotoxicity of the light stick solutions and may contribute to alert public policies to ban their uncontrolled use.

Bastões plásticos quimioluminescentes, chamados light sticks, são usados por companhias pesqueiras e descartados nas praias. Moradores locais utilizam seus conteúdos como repelentes, óleo bronzeador e medicamento para dores nas articulações. Nós investigamos a reatividade das soluções de bastões de light sticks coletados em praias brasileiras e a toxicidade celular de seus conteúdos e também de soluções de light stick de bastões novos. Produtos da reação dos conteúdos de light stick descartado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo) foram analisados por HPLC/UV/ESI-MS/MS. Um aduto foi purificado e caracterizado em espectrômetro de massas por Dissociação Induzida por Colisão (CID) e através de experimentos de 1H RMN. A estrutura do aduto revelou que o produto de degradação de bis(triclorofenil)oxalato é reativo para nucleófilos in vitro. O mesmo aduto foi detectado em DNA de timo de bezerro incubado in vitro com a solução do light stick descartado pelo uso HPLC/ESI-MS/MS. Além do DNA, albumina também foi modificada pelos conteúdos de light stick descartado. Células HepG2 foram incubadas por 16 h com 0.0125% - 0.12% (v/v) das soluções de light sticks: (i) coletadas na praia, (ii) obtidas imediatamente após a reação quimioluminescente no laboratório, e (iii) previamente a reação, contendo ou n-butil-ftalato, difenilantraceno, e bis(triclorofenil)oxalato (solução 1), ou dimetil-ftalato, H2O2, e salicilato de sódio (solução 2). A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste do XTT, corante cristal violeta e lactato desidrogenase realizados em placas de 96 poços. Com as concentrações testadas foram obtidas significativamente a morte celular. O dano oxidativo ao DNA celular foi avaliado pela análise da 8-oxo-2\'-desoxiguanosina através do equipamento HPLC/ESI-MS/MS, que revelou aumento de alterações nas células tratadas com 0.006% das soluções de light stick de bastões descartados e novos. Nossos dados apontam genotoxicidade e citotoxicidade das soluções de light sticks e podem contribuir como alerta a autoridades públicas para proibição do uso incontrolado. / Chemiluminescent plastic rods, called light sticks, are used by fishery companies and littered on the shores. Local inhabitants use their contents as repellents, tanning oil, and medicine for joint pain. We have investigated the reactivity of spent light stick solutions collected on brazilian beaches and the cellular toxicity of their contents as well as that of brand-new light stick solutions. Products of the reaction of the spent light stick contents with 2\'-deoxyguanosine (dGuo) were analyzed by HPLC/UV/ESI-MS/MS. A dGuo adduct was purified and characterized in a Collision Induced Dissociation (CID) mass spectrometer and through 1H NMR experiments. The adduct structure revealed that a degradation product of bis(trichlorophenyl)oxalate is reactive towards nucleophiles in vitro. The same adduct was detected in calf thymus DNA incubated in vitro with spent light stick solution, by using HPLC/ESI-MS/MS. Besides DNA, albumin was also modified by spent light stick contents. HepG2 cells were incubated for 16 h with 0.0125% 0.12% (v/v) of light stick solutions: (i) collected on the beaches, (ii) obtained immediately after the chemiluminescent reaction in the laboratory, and (iii) previously the reaction, containing either n-butyl-phthalate, diphenylanthracene, and bis(trichlorophenyl)oxalate (solution 1), or dimethyl-phthalate, H2O2, and sodium salicylate (solution 2). Cell survival was evaluated by the XTT, crystal violet dye, and lactate dehydrogenase assays performed in 96 well plates. The concentrations tested were found to significantly kill cells. Oxidative damage to cellular DNA was assessed by 8-oxo-2\'-deoxyguanosine analysis via an HPLC/ESI-MS/MS equipment, which revealed increased changes in cells treated with 0.006% of spent and brand-new light stick solutions. Our data point to important genotoxicity and cytotoxicity of the light stick solutions and may contribute to alert public policies to ban their uncontrolled use.

Les toxidermies médicamenteuses sont des réactions de toxicité cutanée déclenchées par la prise d’un ou de plusieurs médicament(s). Dans les cas les plus graves, ces effets indésirables médicamenteux menacent la vie des patients. La plupart des toxidermies ne seraient pas déclenchées par la substance médicamenteuse elle-même, mais par un ou plusieurs de ses métabolites cutanés suffisamment réactif(s) pour former un complexe antigénique avec les protéines épidermiques. Cette étape-clé serait le point de départ des mécanismes immunitaires à l’origine des toxidermies. L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier l’activation métabolique in situ de la Névirapine, un antirétroviral à l’origine de toxidermies chez 20% des patients. En utilisant une technique non invasive, la RMN HRMAS associée aux épidermes humains reconstruits, il a été possible de suivre l’éventuelle bioactivation épidermique de la Névirapine et de ses dérivés ainsi que la fixation de l’un d’eux dans l’épiderme. / Drug-induced toxidermia are cutaneous toxicity reactions caused by a drug therapy. In the most serious cases, these side effects of drugs are life-threatening.Most toxidermia are not induced by the parent drug, but by one or several skin metabolite(s) which may become antigenic by binding with epidermal proteins. This drug-protein conjugation step could be the starting point of immune responses leading to skin lesions.The aim of the PhD project was to study the in situ metabolic activation of Nevirapine, an anti-retroviral drug associated with toxidermia with an incidence of 20%. By using a non-invasive analysis technique, HR-MAS NMR spectroscopy on reconstructed human epidermis, it has been possible to follow the possible bioactivation of Nevirapine and its derivatives as well as the binding of one of them with the epidermis.