<p>Trombin är ett trypsinliknande serinproteas som har stor del i kroppens reglering av blodets fluiditet och koagulation genom att det klyver faktorer som slutligen leder till att blodet kan koagulera och fibrin bildas. Syftet med det här projektet har varit att syntetisera fragment som designats med datorgrafiska metoder på Astra Zeneca och sedan analysera fragmenten med affinitetskromatografi med trypsin immobiliserad på kiselgelspartiklar. I projektet har även ett nytt koncept prövats, nämligen att analysera reaktionsblandningarna direkt med hjälp av trypsinkolonnen utan att först isolera och rena föreningarna. De designade fragmenten har syntetiserats med standardmetoder, bl.a. har N,N’dicyklohexylkarbodiimid (DCC) använts. DCC är ett kopplingsreagens som kopplar ihop aminer med karboxylsyror genom skapande av en amidbindning, peptidbindning. Ibland då lite mer komplicerade peptider skall göras, kan aminoänden eller karboxyländen skyddas med en skyddsgrupp, för att dessa inte ska reagera under reaktionssteget och för att man ska få den peptiden man är ute efter. Vätskekromatografi-masspektrometri, LC-MS har använts för identifiering av reaktionblandningarna (substanserna). Resultaten visade att två av de framställda föreningarna retarderades på trypsinkolonnen, vilket innebär att de växelverkar med trypsin och att s.k. hits, träffar erhållits. Synteserna verkar ha gått bra, då LC-MS har visat att det är rätt produkt som finns i kolven. Projektet har visat att det går att designa fragment som man syntetiserar och sen analyserar med AFC-MS. AFC-MS har dessutom visat vara en lämplig metod för screening av svagt bindande fragment.</p> / <p>Through different, intricate mechanisms, the body regulates the coagulation and the fluidity of the blood. This is an important part of the hemostasis if for example bleeding occurs, or to provide the body with oxygen and nutrition.</p><p>Thrombin is a trypsin like serine protease that plays an important role in this process since it is cleaving factors that eventually lead to coagulation of the blood and production of fibrin.</p><p>The aim of this project has been to synthesize fragments that have been designed with computer graphical methods by Astra Zeneca and then to analyze the fragments with affinity chromatography that has trypsin immobilized on silica particles. The project also introduces a new concept i.e. to analyze reaction mixtures on the trypsin column without first isolating and purifying the compounds.</p><p>The design fragments are synthesized by earlier reported standard methods. N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) was used as coupling reagents to form amide or peptide bonds between carboxylic acids and amines.</p><p>In some of the reactions the amino group or the carboxylic groups of the amino acid were protected, to prevent these from interfering in the reaction and avoid to formation of unwanted substances. After the reactions the protecting groups were removed in different ways. If it is attached to the amine as a Boc-group (the most common protecting group to protect amino groups) it would be removed with trifluoracetic acid, and if the carboxyl group was protected, the protecting group would be removed with catalytical hydrogenolysis, for example by adding sodium hydroxide. To analyze if the right product has been acquired, analyzes with liquid chromatography-masspectrometry has been performed.</p><p>The results showed that two of the prepared fragments were retarded on the trypsin column meaning that they interact with trypsin i.e. hits were obtained.</p><p>The results showed that the two fragments that were analyzed with the trypsin column did retard a bit, which implies that they interact with trypsin. The synthesis seems to have been successful since the liquid-chromatography has shown that the right product has been made. This project has proven that it is possible to design fragments with computer graphical methods before synthesizing and analyzing with AFC-MS. AFC-MS has also been shown to be a suitable method for screening of weak binding fragments.</p>

Weak affinity interaction of monoclonal antibodies and carbohydrate antigens can be detected and quantified by alterations in the antibodies' intrinsic tryptophan fluorescence. These weak/transient binding events have been monitored by total internal reflection fluorescence (TlRF) by facilitating the change in intrinsic tryptophan fluorescence. This immunosensor followed instant changes in the antigen concentration with rapid association- and dissociation rate constants reaching equilibrium in a short time, without the need for regeneration. Furthermore, in a competition assay with extrinsic fluorescence labeling, it was established that Förster/fluorescence resonance energy transfer (FRET) can be applied for weak and transient interactions. By entrapping components in small semipermeable capsules, aconvenient flow system was fabricated allowing on-line measurements of maltose. Quantification of maltose concentration was achievable in the mM-range without need for regeneration.High specificty for maltose was exhibited in crude food-samples with quantification in accordance with batch analysis. Furthermore, a monoclonal antibody was developed for potential use as a glucose immunosensor for diabetes. Its ability to interact with glucose was determined by competitive weak affinity chromatography (WAC) to approximately 19 mM in dissociation constant. This antibody was developed to bind monosaccharides, especially glucose, by utilizing crossreation with a carbohydrate dextran polymer. Selectivity for glucose was greater than for the similar monosaccharides, mannose and galactose. This antibody, or a fragment, in a fluorescence platform is an alternative to monitor glucose in vivo where other glucose-binders might fail. / Att känna igen en motståndare är viktigt i många sammanhang, inte minst i kroppens immunförsvar som är utvecklat för att angripa främmande ämnen i kroppen. Antikroppen spelar en central roll i immunförsvaret där den lär sig att känna igen sin motståndare (antigen) och därmed binda sitt antigen. De antikroppsproducerande cellerna kan användas i laboratoriet för att producera antikroppar som härstammar från försöksdjur. I denna avhandling har antikroppar använts som binder betydligt svagare till antigenet än vad man i de flesta analyser använder sig av för att t.ex. detektera sjukdomar. Antikroppar som binder till olika typer av socker, däribland maltsocker (maltos) och blodsocker (glukos) har studerats. Dessa antikroppar har använts för att undersöka hur hårt de binder till sitt antigen beroende på temperatur och om antikropparna kan känna igen liknande motståndare (korsreaktivitet). Fördelen med dessa svaga bindningar är att antikroppen snabbt kan binda in och släppa sitt antigen istället för att nästan permanent sitta på sitt antigen, som vid starka bindningar. Bindningens styrka (affinitet) har i avhandlingen studerats med hjälp av fluorescensteknik och affinitets-separation. Den maltosbindande antikroppen har använts tillsammans med fluorescensteknik för att designa två olika biosensorer (immunosensorer). Immunosensorerna kan mäta förändringen av maltoskoncentration över tid, vilket är attraktivt i t.ex. livsmedelsindustrin när man vill mäta maltoshalten kontinuerligt under tillverkningen. Den glukosbindande antikroppen har använts i affinitets-separation för att bestämma dess affinitet mot glukos och olika polymerer av glukos. En glukosbindande antikropp är åtråvärt för att t.ex. kontinuerligt mäta koncentrationen av blodsocker genom huden hos diabetiker och därmed minska antalet blodprover man idag behöver ta.

Trombin är ett trypsinliknande serinproteas som har stor del i kroppens reglering av blodets fluiditet och koagulation genom att det klyver faktorer som slutligen leder till att blodet kan koagulera och fibrin bildas. Syftet med det här projektet har varit att syntetisera fragment som designats med datorgrafiska metoder på Astra Zeneca och sedan analysera fragmenten med affinitetskromatografi med trypsin immobiliserad på kiselgelspartiklar. I projektet har även ett nytt koncept prövats, nämligen att analysera reaktionsblandningarna direkt med hjälp av trypsinkolonnen utan att först isolera och rena föreningarna. De designade fragmenten har syntetiserats med standardmetoder, bl.a. har N,N’dicyklohexylkarbodiimid (DCC) använts. DCC är ett kopplingsreagens som kopplar ihop aminer med karboxylsyror genom skapande av en amidbindning, peptidbindning. Ibland då lite mer komplicerade peptider skall göras, kan aminoänden eller karboxyländen skyddas med en skyddsgrupp, för att dessa inte ska reagera under reaktionssteget och för att man ska få den peptiden man är ute efter. Vätskekromatografi-masspektrometri, LC-MS har använts för identifiering av reaktionblandningarna (substanserna). Resultaten visade att två av de framställda föreningarna retarderades på trypsinkolonnen, vilket innebär att de växelverkar med trypsin och att s.k. hits, träffar erhållits. Synteserna verkar ha gått bra, då LC-MS har visat att det är rätt produkt som finns i kolven. Projektet har visat att det går att designa fragment som man syntetiserar och sen analyserar med AFC-MS. AFC-MS har dessutom visat vara en lämplig metod för screening av svagt bindande fragment. / Through different, intricate mechanisms, the body regulates the coagulation and the fluidity of the blood. This is an important part of the hemostasis if for example bleeding occurs, or to provide the body with oxygen and nutrition. Thrombin is a trypsin like serine protease that plays an important role in this process since it is cleaving factors that eventually lead to coagulation of the blood and production of fibrin. The aim of this project has been to synthesize fragments that have been designed with computer graphical methods by Astra Zeneca and then to analyze the fragments with affinity chromatography that has trypsin immobilized on silica particles. The project also introduces a new concept i.e. to analyze reaction mixtures on the trypsin column without first isolating and purifying the compounds. The design fragments are synthesized by earlier reported standard methods. N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) was used as coupling reagents to form amide or peptide bonds between carboxylic acids and amines. In some of the reactions the amino group or the carboxylic groups of the amino acid were protected, to prevent these from interfering in the reaction and avoid to formation of unwanted substances. After the reactions the protecting groups were removed in different ways. If it is attached to the amine as a Boc-group (the most common protecting group to protect amino groups) it would be removed with trifluoracetic acid, and if the carboxyl group was protected, the protecting group would be removed with catalytical hydrogenolysis, for example by adding sodium hydroxide. To analyze if the right product has been acquired, analyzes with liquid chromatography-masspectrometry has been performed. The results showed that two of the prepared fragments were retarded on the trypsin column meaning that they interact with trypsin i.e. hits were obtained. The results showed that the two fragments that were analyzed with the trypsin column did retard a bit, which implies that they interact with trypsin. The synthesis seems to have been successful since the liquid-chromatography has shown that the right product has been made. This project has proven that it is possible to design fragments with computer graphical methods before synthesizing and analyzing with AFC-MS. AFC-MS has also been shown to be a suitable method for screening of weak binding fragments.

Virtually all extracellular proteins in humans are glycoproteins and likewise are many biopharmaceuticals. The glycosylation is directly correlated to biological function and stability of these proteins. The ability to isolate glycoproteins is thus of great importance in many applications. The most common isolation method for glycoproteins is affinity chromatography using lectins, a ubiquitous and versatile group of carbohydrate-binding proteins. The lectin Concanavalin A (ConA) has long been used for this purpose but suffers from undesired leakage into the eluate, causing an inquiry of alternative chromatography ligands or optimization of the ConA resin.In this study, a total of 20 different lectins, including ConA, were evaluated and compared in terms of suitability as ligands in affinity chromatography for glycoprotein isolation. The lectins’ binding to glycoproteins were studied, mainly through microtiter plate binding assays using a monoclonal IgG1 antibody and Conalbumin (Ovotransferrin). Further, sugar-specificities and potential eluting sugars for the lectins were examined through inhibition with eight different carbohydrates. Additionally, the glycoprotein binding and leakage of ConA columns were examined, and a potential leakagereducing treatment of ConA resin evaluated.ConA was found to be superior in binding to the investigated glycoproteins but exhibited a limited binding when immobilized to an agarose resin. This discrepancy is likely a consequence of structurally hidden glycans on the used glycoproteins and requirements of long residence time when used in a chromatographic setting. Binding competition with several sugars were investigated with a similar microtiter plate binding assay. This method displayed potential to predict the behaviour of sugars and their suitability as eluting agents in a chromatography column. The best eluting sugar for ConA was showed to be methylmannoside, ideally in combination with methylglucoside. Lastly, evaluation of ConA columns with a crosslinking glutaraldehyde-treatment showed that the ConA ligand leakage may be significantly reduced, although further studies and optimizations are needed.This study thus presents a repertoire of lectins and their differences in terms of glycoprotein-binding and sugar-specificity, as well as evaluations of ConA columns’ efficiency and potential leakage-prevention.

Hemofili A är en X-länkad ärftlig sjukdom som påverkar blodkoagulationen och beror på avsaknaden eller bristen på proteinet faktor VIII (fVIII). Nuwiq® är en rekombinant fVIII B- domän borttagen produkt från Octapharma AB som behandlar hemofili A och produceras med en cellinje av mänskliga njurceller från embryon. FVIII är 170 kDa som hel-längds protein, men klyvs till 90 kDa och 80 kDa kedjor innan de släpps ut i kroppen för cirkulation. Enligt reglementen måste 170 kDa kedjan vara under en specifik gräns under odlings processen för den farmaceutiska produkten och den relative distributionen av de tre olika isoformerna behövs mätas. Idag upparbetas proverna och analyseras med en droppkolon och reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC). Droppkolonen är en tidskrävande process och målet med detta projekt var att hitta en metod som kan förkorta tiden för detta analyssteg. I denna studie ska möjligheterna utvärderas för att använda Western Blot metod och att använda ett ÄKTA pure system för att rena proverna innan de analyseras med HPLC. Resultatet från Western Blot visa liknades resultat som HPLC analysen gör och en linjäritets, noggrannhets och precisions studie utfördes. Linjäritets studien resulterade i att provkoncentrationen bestämdes till 2 IU/mL. Noggrannhets testerna visade att det var liknande resultat men med mindre skillnader mellan de två metoderna och viss olikhet är förväntad då HPLC analyserar med avseende på hydrofobisitet och Western Blot använder antikroppar och kemiluminiscens. En mer omfattande precisions studie behövs innan några beslut kan tas angående en ändring av analysmetod. Western Blot visade lovande resultat och skulle förkorta metodtiden med ungefär 1-2 dagar. De första ÄKTA reningarna med odlingsprover visade inget protein i eluatet, men med en högre protein mängd pålagd på kolonen från ett prov med mindre cell rester hade eluatet en bra mängd protein i sig. Analysen av eluatet med Western Blot visade goda resultat. Fortsatta tester behövs göras med ÄKTA reningen för att metoden ska kunna betrakta det som en möjlig metod att använda på laboratoriet för att analysera faktor VIII protein. / Hemophilia A is a X-linked hereditary disease that effects the coagulation of the blood and is due to the absence or deficiency of the protein factor VIII (FVIII). Nuwiq® is a recombinant FVIII B-domain deleted product from Octapharma AB that treats hemophilia A and are produced with human embryonic kidney cell lines. The fVIII protein is 170 kDa full length but are cleaved into a 90 kDa chain and an 80 kDa chain before release into circulation in the body. Due to regulations the 170 kDa chain needs to be below a certain limit during the cultivation process of the pharmaceutical product and the relative distribution between the three isoforms needs to be measured. Today the sample is prepared and analysed through a drop column and reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC). The drop column is a time-consuming process and the aim for this project was to find a method that can reduce the time for this analysis step. This study investigated the possibilities to use Western Blot as a method and to use an ÄKTA pure system for the preparation of the samples and then analyse with HPLC. Results from Western Blot showed similar results as the HPLC analysis and a linearity, accuracy and precision study were performed. The linearity study showed promising results for a sample concentration of 2 IU/mL to be used. Accuracy testing showed similar but slightly different results between the two methods and some differences are expected since the HPLC analyses on hydrophobicity and Western Blot uses antibodies and chemiluminescence. There would need to be a more extensive precision study before any decision could be made about changing the analysis method. Western Blot showed promising results and would shorten the method time with around 1-2 days. The first ÄKTA purification runs with cultivation samples did not show any protein levels in the eluate, but with a higher protein amount put on the column from a sample with less cell debris the eluate had good amount of protein in it. The analysis of the eluate with Western Blot showed good results. Further testing of the ÄKTA purific tion is needed to consider it an option to use at the laboratory for analysis of factor VIII protein.

Integrationen av artificiell intelligens (AI) i bioprocessapplikationer har framträtt som en transformerande metod inom bioteknik- och läkemedelsindustrin, och lovar betydande framsteg i effektivitet, verkan och hållbarhet. Genom att utnyttja avancerade algoritmer, såsom djupinlärning och förstärkningsinlärning, kan AI-system förutsäga och generera nya ligandstrukturer med hög affinitet för sina mål, såsom monoklonala antikroppar (mAbs) i detta projekt. Detta projekt syftar till att utvärdera potentialen hos AI-genererade affinitetsproteiner och validera de datorsimulerade förutsägelserna genom att undersöka bindningseffektiviteten och stabiliteten hos dessa ligander under verkliga förhållanden. Flera våtlabbstekniker användes för att uttrycka och rena de AI-designade proteinerna. Affinitetskromatografi var en teknik som användes för rening, följt av ytplasmonresonans (Biacore) för att studera interaktionen mellan de genererade affinitetsproteinerna och mAbs. Analyseresultat från SDS-PAGE och masspektrometri visade att de flesta proteiner kunde renas med hjälp av affinitetskromatografi. Emellertid visade karaktärisering med Biacore att de flesta proteiner inte interagerade med mAbs, förutom ett designat protein. Cirkulär dikroism (CD) spektrometri som användes för att visualisera sekundärstrukturen i proteiner visade att de flesta proteiner var veckade och bibehöll alfahelixar och betaflak jämfört med det vilda typen proteinet. Sammanfattningsvis ger denna forskning värdefulla insikter i utmaningarna vid utvärdering och karaktärisering av AI-genererade proteiner. Ytterligare forskningsinsatser bör fokusera på att förfina experimentella förhållanden och visualisera sekundärstrukturerna hos de genererade proteinerna för en djupare förståelse av deras stabilitetsproblem. / The integration of artificial intelligence (AI) into bioprocess applications has emerged as a transformative approach in the biotechnology and pharmaceutical industries, promising significant advancements in efficiency, efficacy, and sustainability. By leveraging advanced algorithms, such as deep learning and reinforcement learning, AI systems can predict and generate novel ligand structures with high affinity for their targets, such as monoclonal antibodies(mAbs) in this project. This project aims to evaluate the potential of AI-generated affinity protein ligands and validate the computational predictions by examining the binding efficiency and stability of these ligands in real-world conditions. Several wet lab techniques were employed to express and purify the AI-designed proteins. Affinity chromatography was one technique used for purification, followed by surface plasmon resonance (Biacore) to study the interaction between the generated affinity proteins and mAbs. Analysis results from SDS-PAGE and mass spectrometry showed that most proteins could be purified using affinity chromatography. However, characterization using Biacore revealed that most proteins did not interact with mAbs, except for one designed protein. Circular dichroism (CD) spectrometry used to visualize the secondary structure in proteins showed that most proteins were folded and retained alpha helices and beta sheets when compared to the wild type protein. In conclusion, this research provides valuable insights into the challenges in evaluating and characterizing AI-generated proteins. Further research efforts should focus on refining experimental conditions and visualizing the secondary structures of the generated proteins for a more in-depth understanding of their stability issues.