Das parodontopathogene Bakterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) exprimiert zahlreiche Virulenzfaktoren. In dieser Studie wurden die Gene für die Virulenzfaktoren Leukotoxin (LtxA), Cytolethal Distending Toxin (CDT) und Fimbriae-assoziiertes Protein (Flp1) in 99 A. actinomycetemcomitans-Isolaten aus der Plaque von Parodontitispatienten aus vier deutschen Universitätskliniken untersucht. Die Proben wurden serotypisiert. Die Entnahme erfolgte mit sterilen Papierspitzen aus der jeweils tiefsten Tasche jedes Quadranten. Es wurden von den Patienten Sondierungstiefe (PD) und Attachmentlevel (AL) an sechs Stellen pro Zahn gemessen und ebenfalls die Tiefen an den vier Entnahmestellen notiert. Außerdem wurden ethnische Herkunft der Eltern, Geschlecht und Raucherstatus erfragt. Lediglich zwei A. actinomycetemcomitans-Isolate aus Frankfurt/Main wiesen das ltx-Gen mit Deletion auf. Diese zeigten signifikant höhere PD an den vier Entnahmestellen. Die übrigen 97 Proben hatten das ltx-Gen ohne Deletion in der DNA-Promotorregion ihrer A. actinomycetemcomitans-Stämme. Probanden mit Genlokus für das cdtB-Gen, mit drei cdt-Genen oder insgesamt fünf Genen für Virulenzfaktoren litten signifikant häufiger an aggressiver Parodontitis. A. actinomycetemcomitans-Isolate mit cdtA-Gen, cdtB-Gen, cdtCGen, drei cdt-Gene oder flp-1-Gen wiesen signifikant häufiger Serotyp b oder c auf. Probanden ohne cdtC-Gen oder flp-1-Gen in der DNA ihrer isolierten A. actinomycetemcomitans-Stämme zeigten am häufigsten Serotyp e. Probanden mit Genlokus für das cdtB-Gen oder drei cdt-Gene in den isolierten A. actinomycetemcomitans-Proben oder mit aggressiver Parodontitis stammten signifikant häufiger aus dem Ausland. Es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen Vorkommen der Gene für Virulenzfaktoren und PD bzw. AL im gesamten Gebiss gefunden.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Introducción: La periodontitis crónica es una enfermedad inflamatoria que destruye los tejidos de soporte dentarios. El factor etiológico responsable es la presencia de bacterias generadoras de una respuesta inmunológica en el hospedero. El tratamiento tradicional es el pulido y alisado radicular (PAR), pero puede complementarse con antibióticos sistémicos. Azitromicina es utilizada por su acción bacteriostática sobre anaerobios Gram negativo, cómoda dosificación, vida media prolongada y mínimas reacciones adversas. El objetivo de este trabajo de investigación fue cuantificar la microbiota total cultivable, determinar, comparar la presencia y cuantificar Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf) y Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) en un grupo de individuos chilenos con periodontitis crónica previo al tratamiento azitromicina, en conjunto al PAR, y a los 3 meses de seguimiento, en comparación a un grupo que recibió placebo. Materiales y métodos: Se realizó un ensayo clínico aleatorizado, de diseño paralelo, enmascarado y controlado mediante placebo. Se evaluaron parámetros clínicos (nivel de inserción clínica, profundidad al sondaje, índice de placa e índice de sangrado) y microbiológicos a nivel basal y 3 meses de seguimiento. La microbiota total cultivable fue analizada mediante técnicas microbiológicas clásicas (cultivo en jarras de anaerobiosis). La prevalencia de Pg, Tf y Aa fue determinada a través de identificación molecular por PCR. Se consideró significancia estadística con un p < 0,05, y un intervalo de confianza de un 95%. Resultados: Los cuatro parámetros clínicos estudiados mejoraron significativamente a los 3 meses respecto al tiempo basal; tanto grupo experimental como control (valor p < 0,05). Además, disminuyó significativamente el recuento de microbiota total cultivable en el grupo experimental (valor p = 0,0006) y control (valor p = 0,0029). La prevalencia de Tf a los 3 meses de evaluación fue significativamente menor en el grupo experimental (valor p = 0,0002) y en el grupo control (valor p = 0,03). No hubo diferencias significativas inter-grupales en ninguno de los tiempos evaluados. Conclusión: Azitromicina adjunta a PAR es igualmente efectiva en mejorar parámetros clínicos y microbiológicos respecto al PAR por sí solos.

Tesis Magister en Ciencias Odontológicas con Mención en Periodontología / Las periodontitis son un conjunto de enfermedades de naturaleza inflamatoria y etiología infecciosa. La biopelícula patogénica subgingival, constituida principalmente por bacterias anaerobias Gram-negativas, es el factor etiológico responsable del inicio y progresión de las periodontitis. Esta biopelícula está compuesta por una amplia variedad de bacterias, entre ellas, Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Sobre la base de la antigenicidad del O-polisacárido componente del LPS, en A. actinomycetemcomitans se describen distintos serotipos bacterianos y se ha propuesto que entre ellos existe una virulencia y patogenicidad distinta. Las bacterias periodonto-patógenas son reconocidas por las células dendríticas periodontales. Una vez activadas, las células dendríticas expresan moléculas co-estimuladoras y liberan citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas, determinantes de la presentación antigénica a los linfocitos T. Durante esta presentación antigénica, las células dendríticas inducen la activación, proliferación y diferenciación selectiva de los linfocitos TCD4+ hacia los distintos fenotipos efectores, caracterizados por la expresión y secreción de un patrón específico de citoquinas que determina el tipo de respuesta inmune en el hospedero y, finalmente, el fenotipo clínico de las periodontitis. En este estudio, se evaluó la respuesta de células dendríticas estimuladas con los serotipos a, b o c de A. actinomycetemcomitans. Ante el serotipo b se detectaron mayores niveles de expresión y secreción de IL-1β, IL-12, IL-23, IFN-γ y TNF-α en comparación a las células dendríticas estimuladas con los serotipos a o c. Adicionalmente, se analizó la activación de los linfocitos TCD4+ naïve ante células dendríticas autólogas estimuladas con los serotipos a, b o c de A. actinomycetemcomitans y se cuantificaron los niveles de expresión de los factores de transcripción y de expresión y secreción de las citoquinas fenotipo-específicas. En los linfocitos TCD4+ naïve activados por células dendríticas estimuladas con el serotipo b de A. actinomycetemcomitans se detectaron mayores niveles de expresión de los factores de transcripción T-bet y RORC2 y de producción de las citoquinas IL-1β, IL-6, IL-12, IL-17, IL-23, IFN-γ, TNF-α y RANKL, característicos de un patrón de respuesta inmune tipo Th1 (pro-inflamatorio) y Th17 (osteo- destructivo), en comparación a las mismas células estimuladas con los serotipos a o c. En conjunto, estos datos permiten establecer un mayor potencial inmuno-estimulador del serotipo b de A. actinomycetemcomitans en las células dendríticas y linfocitos TCD4+ naïve. Los mayores niveles de secreción de citoquinas propias de un patrón de respuesta tipo Th1 y Th17 se correlacionaron positivamente con la expresión de T-bet y RORC2, factores de transcripción determinantes de los fenotipos linfocitarios Th1 y Th17, respectivamente. Estos resultados nos permiten especular una asociación entre la mayor frecuencia de detección del serotipo b en lesiones periodontales de pacientes con periodontitis y la mayor respuesta inducida en las células dendríticas y linfocitos TCD4+ naïve establecida en este estudio, con una mayor patogenicidad del microorganismo, en particular, con un fenotipo de enfermedad pro-inflamatorio y osteo-destructivo. / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 11100298

A proposta deste trabalho foi de aplicar a Terapia Fotodinâmica (TFD) para avaliar a inativação da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), um patógeno que está associado à endocardite bacteriana, abscessos cerebrais e subcutâneos e principalmente à doença periodontal, que é caracterizada pela inflamação dos tecidos de suporte dos dentes, e consequentemente a perda de dentes. O surgimento de resistência bacteriana a diversas classes de antibióticos vem sendo um problema sério que surge como efeito do uso indiscriminado destes fármacos e até mesmo por fatores adaptativos dos microrganismos. Devido a este fator, várias investigações vêm surgindo com referências satisfatórias no que diz respeito ao emprego da TFD como medida terapêutica. O efeito da TFD foi verificado sobre a cultura da bactéria A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e em biofilme. Foi utilizado como agentes fotossensibilizadores Rose bengal, Azul de metileno e Eritrosina, que em baixas concentrações não causam toxicidade para células de fibroblastos e células humanas. Como fonte de luz foi utilizado o fotopolimerizador de resina odontológica, que é de fácil acesso, baixo custo e apresenta uma faixa de emissão de luz de 300 a 800 nm. Rose Bengal até 1 µM não afetou as células de fibroblastos, mas essa mesma concentração sem usar a TFD reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em 41,2%, porém as células de A. actinomycetemcomitans quando cultivadas em biofilme não foram afetadas quando se usou apenas o corante (0,5 e 1,0 µM) ou apenas a luz. Quando se aplicou a TFD Rose Bengal foi o segundo corante (entre os três estudados), que causou uma maior redução da viabilidade celular de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico 54,4% e o terceiro em reduzir a viabilidade quando cultivadas em biofilme com 45% de redução. Azul de Metileno nas concentrações de 0,5 e 1,0 µM reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico 16 e 24% respectivamente, já sobre o biofilme essa concentração de corante não promoveu redução da viabilidade bacteriana. Com a TFD observou-se uma redução de 50% da viabilidade das células de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e 53,3% em biofilme. Dos três corantes utilizados Eritrosina foi o corante que per se apresentou menor redução da viabilidade 5 e 14%, indicando ter baixa toxicidade, no escuro, e não afetou as células do biofilme de A. actinomycetemcomitan. Porém com a TFD, esse corante promoveu uma maior redução da viabilidade das células bacterianas de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme 75% e 67,2% respectivamente. Desta forma, a Eritrosina foi o corante mais eficiente em diminuir a viabilidade de A. actinomycetemcomitans nas condições estudadas. Esses resultados indicam que a TFD reduz as células viáveis de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme, indicando que essa terapia poderá ser uma opção efetiva para o tratamento clinico da doença periodontal, com a vantagem de não apresentar efeitos colaterais como a terapia medicamentosa, nem desenvolver a resistência bacteriana que vem sendo um grande problema do tratamento com antibióticos. / The objective of this work was to apply the photodynamic therapy (TFD) to evaluate the inactivation of the Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) bacteria, a pathogen that is associated to bacterial endocarditis, subcutaneous and cerebral abscesses and mainly to periodontal disease, which is characterized by inflammation of teeth support tissue and as a consequence, teeth loss. The occurrence of bacterial resistance to many classes of antibiotics has been a serious problem that results from the indiscriminate use of these drugs and also by the adaptation factors of these microorganisms. Due to this, many investigations are being done with satisfactory references regarding the use of TFD as therapeutic step. The TFD effect on A. actinomycetemcomitans bacteria culture in planktonic medium and biofilm was verified. Rose Bengal, methylene Blue and Erythrosyn were used as photosensitizing agents which, in low concentrations are not toxic to fibroblast cells and human cells. The odontological resin photopolymerizer was used as a light source since it is easy accessible, low cost and has a light emission range between 300 and 800nm. Rose Bengal up to 1 µM did not affect the fibroblast cells, but this same concentration without the use of TFD has reduced viability of A. actinomycetemcomitans in 41.2%, but the cells when cultivated in biofilm were not affected when only dye (0.5 and 1.0 µM) or only light were used. When TFD was applied, Rose Bengal was the second dye (among the three studied) to cause the highest reduction of cell viability of A. actinomycetemcomitans cultivated in 54.4% planktonic medium and the third in reducing the viability when cultivated in biofilm, with 45% reduction. Methylene Blue in 0.5 and 1.0 µM concentrations has reduced the viability of A. actinomycetemcomitans in planktonic medium in 16% and 24%, respectively. In biofilm, this dye concentration has not fostered bacterial reduction. With TFD, a 50% reduction of A. actinomycetemcomitans cells in planktonic medium and a 53.3% in biofilm was observed. Among the three dyes used, Erythrosyn was the one that , per se, has shown the lowest viability reduction of all, 5% and 14%, indicating its low toxicity in the dark, and it did not affect the biofilm cells. Nevertheless, with TFD, this dye has fostered a higher viability reduction of A. actinomycetemcomitans bacterial cells cultured in planktonic medium and in biofilm of 75% and 67.2%, respectively. Therefore , Erythrosyn was the dye that, per se, has been the most efficient in reducing A. actinomycetemcomitans viability in the conditions studied. These results indicate that TFD reduces A. actinomycetemcomitans viable cells cultivated in planktonic medium and biofilm, indicating that this therapy could be an effective option for the treatment of periodontal disease, with the advantage that it does not show collateral effects like the drug therapy and without developing bacterial resistance, as this has been a major issue with antibiotics treatment.

Orientador: Ana Lia Anbinder / Coorientadora: Liliana Scorzoni / Banca: Cristiane Yumi Koga Ito / Banca: Victor Angelo Martins Montalli / Resumo: A doença periodontal, afecção crônica inflamatória multifatorial, está entre as principais doenças bucais que afetam a população mundial. Entre as bactérias associadas à periodontite, estão Fusobacterium nucleatum e Aggregactibacter actinomycetemcomitans. Novas terapias adjuntas ao tratamento convencional têm sido propostas para a doença periodontal, entre elas o uso de probióticos. Porém, seu uso não está isento de riscos, e uma alternativa para minimizá-los é inativar os micro-organismos, mantendo suas propriedades benéficas, o que ocorre com os chamados paraprobióticos. Desse modo, são objetivos deste estudo avaliar os efeitos antimicrobianos de L. reuteri vivo, inativado pelo calor e seus produtos sobre F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans e sobre as bactérias comensais, Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius, além de estudar os efeitos da interação das preparações e periodontopatógenos em modelo de invertebrado. A atividade antimicrobiana in vitro foi avaliada associando-se as bactérias patogênicas ou comensais a L. reuteri vivo, inativado ou sobrenadante. Após interação, as bactérias foram cultivadas em meio seletivo para contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). No estudo em Galleria mellonella, após a infecção com as bactérias patogênicas e as preparações de L. reuteri, foi avaliada a curva de sobrevivência e densidade hemocitária. Os dados foram analisados com o teste estatístico apropriado, ao nível de 5%. Após interação bacteriana in vitro, S. sa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Periodontal disease, a chronic multifactorial inflammatory disease, is among the major oral diseases that affects the worldwide population. Among the bacteria associated with periodontitis are Fusobacterium nucleatum and Aggregactibacter actinomycetemcomitans. New therapies have been proposed for periodontal disease as adjunct to conventional treatment, including the use of probiotics. However, their use isn't risk-free and an alternative to that is the inactivation of the microorganisms, maintaining their beneficial properties, which occurs with the paraprobiotics. Thus, the objective of this study is to evaluate the antimicrobial effects of living and heat-killed L. reuteri, and its products on F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans and on the commensal bacteria, Streptococcus mitis and Streptococcus salivarius, as well as to study the interaction of the preparations and periodontopathogens in an invertebrate model. In vitro antimicrobial activity was evaluated by associating the pathogenic or commensal bacteria to live, heat killed or L. reuteri supernatant. After interaction, the bacteria were cultured in a selective medium for colony-forming unit (CFU) count. In the study with Galleria mellonella, after infection with pathogenic bacteria and L. reuteri preparations, the survival curve and hemocyte density were evaluated. The data were analyzed with the appropriate statistical test at the 5% level. After bacterial interaction in vitro, S. salivarius reduced the number of ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) is a bacteria associated with Aggressive Periodontitis (AP). It invades soft tissues, with occurrence of lysogeny and bacteriophage presence up to 69% of Aa subspecies. In vitro studies suggested that bacteriophage (Aa17) induction occurs upon co-culture of Aa lysogens subspecies with human fibroblasts. If such an in vivo interaction resulted in Aa17 induction and release of virions, an immunologic reaction to Aa17 proteins could ensue. The purpose of this investigation was to learn whether serum antibodies (AB) to Aa17 proteins are found in human sera, and whether they are associated with periodontal disease. An additional purpose was to test the AB response against known Aa serotypes.52 individuals took part: 31 with AP, 5 with Chronic Periodontitis (CP) and 16 with a Healthy Periodontium (HP). Serum was collected after clinical classification. Aa17 proteins were obtained from purified Aa17 preparations. The Aa strains used for protein sampling through sonication were: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) serotype A, 43718 (ATCC) serotype B, 33384 (ATCC) serotype C, IDH781 serotype D, NJ9500 serotype E and CU1000 serotype F. Proteins were separated by SDS-PAGE gels and then transferred to nitrocellulose membranes. Western-blotting reactions were carried out with the primary AB being each subjects serum. All membranes were read through the Odyssey system which captures signals from a dye in a secondary (antihuman) AB. AB response against at least one Aa17 protein, as well as a response to at least one Aa serotype, was observed in all but two individuals (with HP) who participated in the study. Serum from one individual from the CP group and three from the AP group had AB response to some, but not all Aa serotypes. AB response against all Aa serotypes was the most common finding in AP (28/31), HP (14/16) and CP (4/5) groups. AB response to the full complex of Aa17 proteins was observed in 7 individuals with AP, 2 with CP and 6 with HP. Chi-square tests comparing the AP with HP groups indicated that the presence of AB against any Aa17 protein is statistically significant (p= 0,044), as well as AB response against serotype C (p= 0,044). Intense reactions were seen when sera reacted with proteins from serotype C; in some cases the signal was so strong that it covered much of the lane. This intense response was present in 17, 3, and 1 of the AP, CP and HP subjects, respectively and was statistically significant (p=0.001) between the AP and HP groups. AB response against a Aa17 protein or its whole complex was observed in all groups. This finding suggests that the in vitro Aa17 induction could also be occurring in vivo, although it is not necessarily associated with periodontitis. AB response against multiple Aa serotypes was a common finding and is not associated with disease. However, the presence and intensity of AB response against Aa serotype C, is associated with AP.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) is a bacteria associated with Aggressive Periodontitis (AP). It invades soft tissues, with occurrence of lysogeny and bacteriophage presence up to 69% of Aa subspecies. In vitro studies suggested that bacteriophage (Aa17) induction occurs upon co-culture of Aa lysogens subspecies with human fibroblasts. If such an in vivo interaction resulted in Aa17 induction and release of virions, an immunologic reaction to Aa17 proteins could ensue. The purpose of this investigation was to learn whether serum antibodies (AB) to Aa17 proteins are found in human sera, and whether they are associated with periodontal disease. An additional purpose was to test the AB response against known Aa serotypes.52 individuals took part: 31 with AP, 5 with Chronic Periodontitis (CP) and 16 with a Healthy Periodontium (HP). Serum was collected after clinical classification. Aa17 proteins were obtained from purified Aa17 preparations. The Aa strains used for protein sampling through sonication were: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) serotype A, 43718 (ATCC) serotype B, 33384 (ATCC) serotype C, IDH781 serotype D, NJ9500 serotype E and CU1000 serotype F. Proteins were separated by SDS-PAGE gels and then transferred to nitrocellulose membranes. Western-blotting reactions were carried out with the primary AB being each subjects serum. All membranes were read through the Odyssey system which captures signals from a dye in a secondary (antihuman) AB. AB response against at least one Aa17 protein, as well as a response to at least one Aa serotype, was observed in all but two individuals (with HP) who participated in the study. Serum from one individual from the CP group and three from the AP group had AB response to some, but not all Aa serotypes. AB response against all Aa serotypes was the most common finding in AP (28/31), HP (14/16) and CP (4/5) groups. AB response to the full complex of Aa17 proteins was observed in 7 individuals with AP, 2 with CP and 6 with HP. Chi-square tests comparing the AP with HP groups indicated that the presence of AB against any Aa17 protein is statistically significant (p= 0,044), as well as AB response against serotype C (p= 0,044). Intense reactions were seen when sera reacted with proteins from serotype C; in some cases the signal was so strong that it covered much of the lane. This intense response was present in 17, 3, and 1 of the AP, CP and HP subjects, respectively and was statistically significant (p=0.001) between the AP and HP groups. AB response against a Aa17 protein or its whole complex was observed in all groups. This finding suggests that the in vitro Aa17 induction could also be occurring in vivo, although it is not necessarily associated with periodontitis. AB response against multiple Aa serotypes was a common finding and is not associated with disease. However, the presence and intensity of AB response against Aa serotype C, is associated with AP.

A proposta deste trabalho foi de aplicar a Terapia Fotodinâmica (TFD) para avaliar a inativação da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), um patógeno que está associado à endocardite bacteriana, abscessos cerebrais e subcutâneos e principalmente à doença periodontal, que é caracterizada pela inflamação dos tecidos de suporte dos dentes, e consequentemente a perda de dentes. O surgimento de resistência bacteriana a diversas classes de antibióticos vem sendo um problema sério que surge como efeito do uso indiscriminado destes fármacos e até mesmo por fatores adaptativos dos microrganismos. Devido a este fator, várias investigações vêm surgindo com referências satisfatórias no que diz respeito ao emprego da TFD como medida terapêutica. O efeito da TFD foi verificado sobre a cultura da bactéria A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e em biofilme. Foi utilizado como agentes fotossensibilizadores Rose bengal, Azul de metileno e Eritrosina, que em baixas concentrações não causam toxicidade para células de fibroblastos e células humanas. Como fonte de luz foi utilizado o fotopolimerizador de resina odontológica, que é de fácil acesso, baixo custo e apresenta uma faixa de emissão de luz de 300 a 800 nm. Rose Bengal até 1 µM não afetou as células de fibroblastos, mas essa mesma concentração sem usar a TFD reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em 41,2%, porém as células de A. actinomycetemcomitans quando cultivadas em biofilme não foram afetadas quando se usou apenas o corante (0,5 e 1,0 µM) ou apenas a luz. Quando se aplicou a TFD Rose Bengal foi o segundo corante (entre os três estudados), que causou uma maior redução da viabilidade celular de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico 54,4% e o terceiro em reduzir a viabilidade quando cultivadas em biofilme com 45% de redução. Azul de Metileno nas concentrações de 0,5 e 1,0 µM reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico 16 e 24% respectivamente, já sobre o biofilme essa concentração de corante não promoveu redução da viabilidade bacteriana. Com a TFD observou-se uma redução de 50% da viabilidade das células de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e 53,3% em biofilme. Dos três corantes utilizados Eritrosina foi o corante que per se apresentou menor redução da viabilidade 5 e 14%, indicando ter baixa toxicidade, no escuro, e não afetou as células do biofilme de A. actinomycetemcomitan. Porém com a TFD, esse corante promoveu uma maior redução da viabilidade das células bacterianas de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme 75% e 67,2% respectivamente. Desta forma, a Eritrosina foi o corante mais eficiente em diminuir a viabilidade de A. actinomycetemcomitans nas condições estudadas. Esses resultados indicam que a TFD reduz as células viáveis de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme, indicando que essa terapia poderá ser uma opção efetiva para o tratamento clinico da doença periodontal, com a vantagem de não apresentar efeitos colaterais como a terapia medicamentosa, nem desenvolver a resistência bacteriana que vem sendo um grande problema do tratamento com antibióticos. / The objective of this work was to apply the photodynamic therapy (TFD) to evaluate the inactivation of the Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) bacteria, a pathogen that is associated to bacterial endocarditis, subcutaneous and cerebral abscesses and mainly to periodontal disease, which is characterized by inflammation of teeth support tissue and as a consequence, teeth loss. The occurrence of bacterial resistance to many classes of antibiotics has been a serious problem that results from the indiscriminate use of these drugs and also by the adaptation factors of these microorganisms. Due to this, many investigations are being done with satisfactory references regarding the use of TFD as therapeutic step. The TFD effect on A. actinomycetemcomitans bacteria culture in planktonic medium and biofilm was verified. Rose Bengal, methylene Blue and Erythrosyn were used as photosensitizing agents which, in low concentrations are not toxic to fibroblast cells and human cells. The odontological resin photopolymerizer was used as a light source since it is easy accessible, low cost and has a light emission range between 300 and 800nm. Rose Bengal up to 1 µM did not affect the fibroblast cells, but this same concentration without the use of TFD has reduced viability of A. actinomycetemcomitans in 41.2%, but the cells when cultivated in biofilm were not affected when only dye (0.5 and 1.0 µM) or only light were used. When TFD was applied, Rose Bengal was the second dye (among the three studied) to cause the highest reduction of cell viability of A. actinomycetemcomitans cultivated in 54.4% planktonic medium and the third in reducing the viability when cultivated in biofilm, with 45% reduction. Methylene Blue in 0.5 and 1.0 µM concentrations has reduced the viability of A. actinomycetemcomitans in planktonic medium in 16% and 24%, respectively. In biofilm, this dye concentration has not fostered bacterial reduction. With TFD, a 50% reduction of A. actinomycetemcomitans cells in planktonic medium and a 53.3% in biofilm was observed. Among the three dyes used, Erythrosyn was the one that , per se, has shown the lowest viability reduction of all, 5% and 14%, indicating its low toxicity in the dark, and it did not affect the biofilm cells. Nevertheless, with TFD, this dye has fostered a higher viability reduction of A. actinomycetemcomitans bacterial cells cultured in planktonic medium and in biofilm of 75% and 67.2%, respectively. Therefore , Erythrosyn was the dye that, per se, has been the most efficient in reducing A. actinomycetemcomitans viability in the conditions studied. These results indicate that TFD reduces A. actinomycetemcomitans viable cells cultivated in planktonic medium and biofilm, indicating that this therapy could be an effective option for the treatment of periodontal disease, with the advantage that it does not show collateral effects like the drug therapy and without developing bacterial resistance, as this has been a major issue with antibiotics treatment.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-15T17:25:19Z No. of bitstreams: 1 liviadeoliveirapereira.pdf: 1685677 bytes, checksum: 07e27133c285258d3d0cd1bb3dd371c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-02T14:33:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 liviadeoliveirapereira.pdf: 1685677 bytes, checksum: 07e27133c285258d3d0cd1bb3dd371c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T14:33:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 liviadeoliveirapereira.pdf: 1685677 bytes, checksum: 07e27133c285258d3d0cd1bb3dd371c4 (MD5) Previous issue date: 2015-06-26 / O tratamento ortodôntico apresenta potencial para causar alterações no periodonto devido ao acúmulo de biofilme, em função da dificuldade de realização de uma adequada higiene bucal na presença de bandas e braquetes. OBJETIVOS: avaliar a ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans na saliva total em indivíduos antes e depois da instalação do aparelho ortodôntico fixo metálico. METODOLOGIA: Foram avaliados 15 pacientes da Clínica de Especialização em Ortodontia da Faculdade de Odontologia – UFJF e de consultórios particulares, do sexo feminino e masculino, com idade média de 18 anos e 3 meses (14-18 anos); 7 homens e 8 mulheres. Amostras de saliva total foram coletadas um mês antes (T1), imediatamente antes (T2), 15 dias antes (T3) e 1 mês após a instalação de aparelho fixo Edgewise Standard (Morelli 10.30.900) nos dentes superiores e inferiores, com exceção dos segundos e terceiros molares. A coleta de saliva foi realizada com o dispositivo Salivete Cortisol (Sarstedt ® Nümbrecht, Alemanha), com swab neutro de poliéster e microtubo. A partir das amostras coletadas, foi realizada a extração do DNA para identificação da bactéria (Aa) por meio do método Reação em Cadeia Polimerase em tempo real. RESULTADOS: Após as análises, não havia a presença da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans em nenhum dos intervalos das amostras testadas. Não houve deterioração da condição periodontal (índice de placa visível, profundidade de sondagem e sangramento à sondagem) após T4. CONCLUSÕES: a) não foi possível identificar a ocorrência da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans na saliva nem antes (um mês antes), nem no dia da colagem, nem 15 e um mês após a colagem do aparelho fixo; b) o uso do aparelho fixo não contribuiu para o aumento dos índices de placa, profundidade de sondagem e sangramento à sondagem. / Orthodontic treatment has potential to cause changes in periodontal due to biofilm accumulation, due to the difficulty of conducting a proper oral hygiene in the presence of bands and brackets. OBJECTIVES: Evaluate the occurrence of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in whole saliva in individuals before and after the installation of metal orthodontic braces and assess whether there has been deterioration of periodontal status (visible plaque index, probing depth and bleeding on probing) after installing braces. METHODS: We evaluated 15 patients of Specialization in Clinical Orthodontics, School of Dentistry - UFJF and private practices, female and male, with an average age of 18 years and 3 months (14-18 years); 7 men and 8 women. Whole saliva samples were collected one month before (T1), immediately before (T2), 15 days before (T3) and one month after the installation of fixed Edgewise Standard unit (Morelli 10.30.900) on the upper and lower teeth, except the second and third molars. The saliva collection was done with the Salivete Cortisol device (Sarstedt ® Nümbrecht, Germany), with neutral swab polyester and micro tube. From samples collected, extraction of DNA for bacteria identification was carried out (Aa) by Polymerase Chain Reaction method in real time. RESULTS: After the analysis, there was no presence of bacteria Aggregatibacter actinomycetemcomitans in any of the intervals of the samples tested. There was no deterioration of the periodontal status (visible plaque index, probing depth and bleeding on probing) after T3. CONCLUSIONS: a) Unable to identify instances of Aa bacteria in saliva either before or after bonding of fixed appliances; b) the use of braces did not contribute to increase plaque index, probing depth and bleeding on probing.

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