"Diabetic cardiovascular autonomic neuropathy (DCAN) is common in patients with diabetes mellitus, and causes abnormalities in heart rate control as well as central and peripheral nervous system dynamics. A good understanding of DCAN is not established yet. An effective way to detect diabetes mellitus at an early stage is still undiscovered, which method is highly desired by researchers and patients. One reason why the pathogenesis of DCAN is unclear is that non- invasive assessment of DCAN in humans and animals has been problematic. The non-stationary and non- linear natures of the interested physiological signals have placed great limitation on traditionally algorithms. To overcome this limitation, this work proposes a series of time- varying, nonlinear and non-invasive methods to assess cardiac autonomic dysregulation from ECG and PPG records. Including a non-stationary method called PDM, which is based on principal dynamic mode (PDM) analysis of heart rate variability (HRV), nonstationary power spectral density called TVOPS-VFCDM and also standard spectrum analysis method of HRV. We are also able to study and analyze a series of long term and short term ECG and PPG data. In a pilot study, ECG was measured via telemetry in conscious 4 month old C57/Bl6 controls and in Akita mice, a model of insulin- dependent type I diabetes, while PPG was measured via tail pulse oximetry system from 2 month old to 4 month old. The results indicate significant cardiac autonomic impairment in the diabetic mice in comparison to the controls at 4 month old and such impairment start to present at 3 month old. Further, both immunohistochemistry and Western blot analyses show a reduction in nerve density in Akita mice as compared to the control mice, thus, corroborating our data analysis records."

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(社会健康医学) / 甲第22386号 / 社医博第108号 / 新制||社||医11(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科社会健康医学系専攻 / (主査)教授 中山 健夫, 教授 佐藤 俊哉, 教授 川口 義弥 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Public Health / Kyoto University / DFAM

Le diabète est une maladie chronique dont la principale caractéristique est un niveau plasmatique élevé de glucose, qui est causé soit par un défaut dans la production d’insuline, l’action de l’insuline, ou les deux à la fois. Plusieurs études ont démontré que l’hyperglycémie chronique peut mener à la dysfonction et même la défaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le système vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents cérébro-vasculaires et des complications rétinales et rénales, respectivement. La néphropathie diabétique (DN) est la principale cause de déficience rénale et affecte près de 25-40% des patients diabétiques. La DN est invariablement associée à un risque élevé d’accident cérébrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique précurseur de tous les types d’angiotensines. En plus du système rénine-angiotensine (RAS) sytémique, le rein possède son propre système intrarénal et exprime tous les composants du RAS. L’Agt est fortement exprimé dans les cellules du tubule proximal rénal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabétiques présentent de hauts niveaux d’AngII et une augmentation de l’expression des gènes du RAS, suggérant que l’activation du RAS intrarénal joue un rôle important dans la progression de la DN. Les mécanismes qui contrôlent la régulation du niveau rénal d’Agt par l’hyperglycémie et l’insuline demeurent mal compris. Le but global de cette thèse est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression du gène Agt chez la souris Akita (un modèle murin de diabète de type 1). Dans cette optique, la première partie de la thèse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont déjà identifié 2 protéines nucléaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un hétérodimère et se lient à l’élément de réponse à l’insuline (IRE) présent dans le promoteur du gène Agt du rat et inhibent la transcription du gène Agt in vitro. Afin de déterminer si hnRNP F / K sont responsables de l’inhibition de l’expression rénale de Agt par l’insuline in vivo, nous avons étudié des souris Akita males traités ou non avec des implants d’insuline pour une période de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont été employées comme contrôles. Les souris Akita développent de l’hypertension et de l’hypertrophie rénale. Le traitement à l’insuline rétablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et atténue l’hypertrophie rénale, l’albuminurie (ratio albumine/créatinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires d’Agt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement à l’insuline inhibe l’expression rénale du gène Agt, tout en augmentant l’expression des gènes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, l’insuline inhibe Agt, mais stimule l’expression de hnRNP F et hnRNP K en présence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protéine kinase activée par un mitogène). La transfection avec des petits ARN interférents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prévient l’inhibition de l’expression d’Agt par l’insuline dans les RPTC. Cette étude démontre bien que l’insuline prévient l’hypertension et atténue les dommages rénaux observés chez les souris Akita diabétiques, en partie grâce à la suppression de la transcription rénale de Agt, via une augmentation de l’expression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thèse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrôle les gènes de la réponse antioxydante cellulaire en réponse au stress oxydant ou aux électrophiles. Le but de cette étude est d’examiner l’impact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur l’expression du gène Agt via Nrf2 et sur le développement de l’hypertension et des dommages rénaux résultants chez les souris diabétiques Akita transgéniques (Tg). Nos études ont démontré que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, atténue les dommages rénaux et inhibe l’expression des gènes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose élevé (HG) et l’oltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent l’expression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut être bloqué par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-κB et MAPK p38. La suppression de sites de réponse à Nrf2 présents dans le promoteur du gène Agt du rat abolit la stimulation par l’oltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgéniques traitées avec l’oltipraz montrent une augmentation de l’expression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut être normalisée par la trigonelline. Ces données permettent d’identifier un nouveau mécanisme d’action de Nrf2, par la stimulation du gène Agt intrarénal et l’activation du RAS, qui induisent l’hypertension et les dommages rénaux par le glucose élevé et les espèces réactives de l’oxygène chez les souris diabétiques. Nos conclusions permettent de démontrer que l’insuline induit l’expression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rôle protecteur en prévenant l’hypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant à elle atténuer l’activation de Nrf2 et ainsi réduit la SBP chez les souris Akita. / Diabetes mellitus is a chronic metabolic disorder characterized by high plasma glucose caused by an impairment of insulin production, insulin action or both. Accumulating evidence has shown that chronic hyperglycemia can lead to dysfunction and failure of multiple organs including the heart, vascular system, eyes, and kidneys resulting in myocardial infarction, stroke, and retinal and renal complications, respectively. Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease affecting approximately 25–40% of diabetic patients. DN is invariably associated with an increased risk of stroke and cardiovascular dysfunction. Angiotensinogen (Agt) is the sole precursor for all types of angiotensins. In addition to systemic renin-angiotensin system (RAS), all the components of the intrarenal RAS are expressed in the kidney. Agt is highly expressed in the renal proximal tubular cells (RPTCs) and converted into biologically active angiotensin II (Ang II). In Diabetics, intrarenal Ang II level and RAS gene expression are upregulated, suggesting that intrarenal RAS activation plays an important role in the progression of DN. The mechanism (s) underlying the regulation of renal Agt by hyperglycemia and insulin are not completely understood. The overall aim of this thesis is to understand the molecular mechanism(s) that regulate renal Agt gene expression in an Akita mouse (a mouse model of type 1 diabetes). For this purpose, the first part of this thesis focuses on two transcription factors from the heterogenous nuclear ribonucleoprotein (hnRNPs) family. Previously, Chan’s group identified two nuclear proteins hnRNP F and hnRNP K of 48kD and 70kD, respectively. hnRNP F and hnRNP K form a heterodimer and bind to the insulin-responsive element (IRE) in the rat Agt gene promoter inhibiting Agt gene transcription in vitro. To determine whether hnRNP F / K mediate insulin inhibition of renal Agt expression in vivo, we used adult male Akita mice treated ± insulin implants for 4 weeks. Non-Akita mice served as controls. The Akita mice developed hypertension and exhibited renal hypertrophy. Insulin treatment normalized plasma glucose levels and systolic blood pressure (SBP), attenuated renal hypertrophy, decreased urinary albumin/creatinine ratio (ACR) and urinary Agt and Ang II levels in Akita mice. Furthermore, insulin treatment inhibited renal Agt expression but enhanced hnRNP F, hnRNP K and angiotensinconverting enzyme-2 (ACE2) expression. In vitro, insulin inhibited Agt but stimulated hnRNP F and hnRNP K expression in high-glucose media via p44/42 mitogen-activated protein kinase signaling in RPTCs. Transfection with hnRNP F and hnRNP K small interfering RNAs (siRNA) prevented the insulin inhibition of Agt expression in RPTCs. This study demonstrates that insulin prevents hypertension and attenuates kidney injury, at least in part, through suppressing renal Agt transcription via upregulation of hnRNP F and hnRNP K expression in diabetic Akita mice. In the second part of the thesis we focused on the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Nrf2 is a transcription factor that regulates cellular antioxidant gene defense against oxidative stress or electrophiles. The purpose of this study is to investigate the impact of the overexpressing catalase (Cat) in RPTCs on Agt gene expression via Nrf2and the resulting effects on the development of hypertension and renal injury in diabetic Akita transgenic (Tg) mice. Our studies demonstrate that Cat overexpression normalizes SBP, attenuates renal injury, and inhibits RPTC Nrf2 and Agt gene expression in the Akita Cat- Tg compared to Akita mice. In vitro, high glucose (HG) and Oltipraz stimulated Nrf2 and Agt gene expression; these changes were blocked by Trigonelline (an inhibitor of Nrf2), siRNA against Nrf2, antioxidants, or pharmacological inhibitors of NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase. Moreover, deletion of Nrf2-responsive elements in the rat Agt gene promoter abolishes the stimulatory effect of Oltipraz. Finally,non transgenic adult male mice treated with the Nrf2 activator Oltipraz, upregulated Nrf2 and Agt expression in mouse RPTs, an effect that was normalized by Trigonelline. These data identify a novel mechanism via which Nrf2 mediates the stimulation of intrarenal Agt gene expression and activates the RAS through whichHG/reactive oxygen species (ROS) induce hypertension and renal injury in diabetic mice. Our findings demonstrate that the insulin induced hnRNP F and hnRNP K gene expression play a protective role in the preventing hypertension. Catalase overexpression, in RPT's, attenuates Nrf2 activation and lowers the SBP in Akita mice.

A study of hyperglycemia and its effects on endothelial activation, macrophage recruitment, and atherosclerotic plaque development in mice. Hyperglycemic mice demonstrated greater VCAM but not ICAM expression along the endothelium, increased macrophage presence within the subendothelial space of these regions, and a greater volume of plaque in adulthood. / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world today. Atherosclerosis is the formation of plaque in the arteries and a major underlying cause of these fatalities. Type I and II diabetes are each strong independent risk factors for atherosclerosis. This study examines the effects of hyperglycemia on early atherosclerosis. Hyperglycemia did not promote atherosclerosis in the absence of hypercholesterolemia. Hyperglycemic mice demonstrated greater VCAM, but not ICAM, expression in regions of the endothelium susceptible to atherogenesis, prior to initiation of plaque development. Regions correlating to upregulation of VCAM exhibited a greater quantity of macrophages infiltrating the intima. This study suggests a unique and important role for VCAM in early atherosclerotic development and may explain the accelerated atherosclerotic plaque progression seen in hyperglycemic mice. This study also identifies VCAM as a potential target for the development of therapies to block or slow atherosclerotic plaque development in people with diabetes. / Thesis / Master of Science (MSc) / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world today. A major underlying cause of cardiovascular disease is atherosclerosis – a condition involving the thickening of the artery wall. Type I and II diabetes are each strong independent risk factors for atherosclerosis. The purpose of this study is to examine the effects of high blood glucose (hyperglycemia) on early events leading to atherosclerosis. This study found that hyperglycemia was not sufficient to promote atherosclerosis unless plasma cholesterol levels were also elevated. Hyperglycemia appeared to induce atherosclerosis by increasing the expression of factors responsible for recruiting white blood cells to the artery wall. This is consistent with the observation that hyperglycemic mice also had significantly more macrophages in the sites of plaque development. This study implicates one macrophage-recruitment factor in particular, vascular cell adhesion molecule (VCAM), as playing an important and unique role in the initiation of atherosclerosis by hyperglycemia. Therefore, VCAM is a possible target for the development of therapies to block or slow the development of atherosclerosis in individuals with diabetes.