Uma abordagem alternativa para a terapia gênica somática é a entrega da proteína terapêutica através da implantação de células geneticamente modificadas com capacidade de superexpressar o gene de interesse. Os mecanismos de encapsulação foram projetados para proteger as células da rejeição do organismo hospedeiro e para prevenir que as células modificadas se espalhassem, ao mesmo tempo em que permite a secreção protéica. As esferas de alginato formam uma estrutura semi-permeável conveniente para a injeção in vivo. Neste estudo, um protocolo laboratorial eficaz foi otimizado para gerar micro cápsulas de alginato de cálcio com forma e tamanho uniformes, contendo células viáveis. A encapsulação de células baby hamster kidney (BHK) em esferas de alginato foi executada utilizando um dispositivo simples montado com um cilindro de ar comprimido e uma bomba peristáltica. O fluxo de 100 mL/h da solução contendo as células e o fluxo de 10 L/min de ar comprimido geraram as melhores cápsulas em relação ao tamanho e a uniformidade das esferas. As células se mantiveram viáveis em cultura por quatro semanas, sem apresentar sinais de necrose, e a difusão protéica foi observada durante estas quatro semanas. Os resultados destes estudos in vitro demonstram claramente que o micro isolamento de células BHK em alginato, utilizando este dispositivo simples, pode prover um ambiente capaz de preservar as células vivas e viáveis. Além disso, as células encapsuladas sob as condições descritas nesse trabalho, possibilitam a difusão de β-gal mesmo após quatro semanas de tratamento, tornando-se assim potencialmente compatíveis com a entrega de proteína terapêutica. / An alternative approach to somatic gene therapy is to deliver the therapeutic protein by implanting genetically modified cells that could overexpress the gene of interest. Microencapsulation devices were designed to protect cells from host rejection and prevent the foreign cells from spreading while allowing protein secretion. Alginate beads form a semi-permeable structure that is suitable for in vivo injection. In this study we report an effective laboratory protocol to generate calcium alginate microcapsules, following optimization of uniformly shaped and sized particles that contain viable cells. Encapsulation of baby hamster kidney (BHK) cells in alginate beads was performed using a simple device assembled with a cylinder of compressed air and a peristaltic pump. Cell suspension flow of 100 mL/h and air jet flow of 10 L/min allowed best size and shape uniformity of beads. Cells were maintained viable in culture for 4 weeks, with no signs of necrosis, and protein diffusion was observed during these weeks. Results of these in vitro studies clearly demonstrated that microisolation of BHK cells in alginate using a simple assembly device could provide an environment that is capable of preserving live and viable cells. In addition, encapsulated cells under the conditions described were able to secrete β- galactosidase even after four weeks of treatment, thus becoming potentially compatible with therapeutic protein delivery.

Uma abordagem alternativa para a terapia gênica somática é a entrega da proteína terapêutica através da implantação de células geneticamente modificadas com capacidade de superexpressar o gene de interesse. Os mecanismos de encapsulação foram projetados para proteger as células da rejeição do organismo hospedeiro e para prevenir que as células modificadas se espalhassem, ao mesmo tempo em que permite a secreção protéica. As esferas de alginato formam uma estrutura semi-permeável conveniente para a injeção in vivo. Neste estudo, um protocolo laboratorial eficaz foi otimizado para gerar micro cápsulas de alginato de cálcio com forma e tamanho uniformes, contendo células viáveis. A encapsulação de células baby hamster kidney (BHK) em esferas de alginato foi executada utilizando um dispositivo simples montado com um cilindro de ar comprimido e uma bomba peristáltica. O fluxo de 100 mL/h da solução contendo as células e o fluxo de 10 L/min de ar comprimido geraram as melhores cápsulas em relação ao tamanho e a uniformidade das esferas. As células se mantiveram viáveis em cultura por quatro semanas, sem apresentar sinais de necrose, e a difusão protéica foi observada durante estas quatro semanas. Os resultados destes estudos in vitro demonstram claramente que o micro isolamento de células BHK em alginato, utilizando este dispositivo simples, pode prover um ambiente capaz de preservar as células vivas e viáveis. Além disso, as células encapsuladas sob as condições descritas nesse trabalho, possibilitam a difusão de β-gal mesmo após quatro semanas de tratamento, tornando-se assim potencialmente compatíveis com a entrega de proteína terapêutica. / An alternative approach to somatic gene therapy is to deliver the therapeutic protein by implanting genetically modified cells that could overexpress the gene of interest. Microencapsulation devices were designed to protect cells from host rejection and prevent the foreign cells from spreading while allowing protein secretion. Alginate beads form a semi-permeable structure that is suitable for in vivo injection. In this study we report an effective laboratory protocol to generate calcium alginate microcapsules, following optimization of uniformly shaped and sized particles that contain viable cells. Encapsulation of baby hamster kidney (BHK) cells in alginate beads was performed using a simple device assembled with a cylinder of compressed air and a peristaltic pump. Cell suspension flow of 100 mL/h and air jet flow of 10 L/min allowed best size and shape uniformity of beads. Cells were maintained viable in culture for 4 weeks, with no signs of necrosis, and protein diffusion was observed during these weeks. Results of these in vitro studies clearly demonstrated that microisolation of BHK cells in alginate using a simple assembly device could provide an environment that is capable of preserving live and viable cells. In addition, encapsulated cells under the conditions described were able to secrete β- galactosidase even after four weeks of treatment, thus becoming potentially compatible with therapeutic protein delivery.

Uma abordagem alternativa para a terapia gênica somática é a entrega da proteína terapêutica através da implantação de células geneticamente modificadas com capacidade de superexpressar o gene de interesse. Os mecanismos de encapsulação foram projetados para proteger as células da rejeição do organismo hospedeiro e para prevenir que as células modificadas se espalhassem, ao mesmo tempo em que permite a secreção protéica. As esferas de alginato formam uma estrutura semi-permeável conveniente para a injeção in vivo. Neste estudo, um protocolo laboratorial eficaz foi otimizado para gerar micro cápsulas de alginato de cálcio com forma e tamanho uniformes, contendo células viáveis. A encapsulação de células baby hamster kidney (BHK) em esferas de alginato foi executada utilizando um dispositivo simples montado com um cilindro de ar comprimido e uma bomba peristáltica. O fluxo de 100 mL/h da solução contendo as células e o fluxo de 10 L/min de ar comprimido geraram as melhores cápsulas em relação ao tamanho e a uniformidade das esferas. As células se mantiveram viáveis em cultura por quatro semanas, sem apresentar sinais de necrose, e a difusão protéica foi observada durante estas quatro semanas. Os resultados destes estudos in vitro demonstram claramente que o micro isolamento de células BHK em alginato, utilizando este dispositivo simples, pode prover um ambiente capaz de preservar as células vivas e viáveis. Além disso, as células encapsuladas sob as condições descritas nesse trabalho, possibilitam a difusão de β-gal mesmo após quatro semanas de tratamento, tornando-se assim potencialmente compatíveis com a entrega de proteína terapêutica. / An alternative approach to somatic gene therapy is to deliver the therapeutic protein by implanting genetically modified cells that could overexpress the gene of interest. Microencapsulation devices were designed to protect cells from host rejection and prevent the foreign cells from spreading while allowing protein secretion. Alginate beads form a semi-permeable structure that is suitable for in vivo injection. In this study we report an effective laboratory protocol to generate calcium alginate microcapsules, following optimization of uniformly shaped and sized particles that contain viable cells. Encapsulation of baby hamster kidney (BHK) cells in alginate beads was performed using a simple device assembled with a cylinder of compressed air and a peristaltic pump. Cell suspension flow of 100 mL/h and air jet flow of 10 L/min allowed best size and shape uniformity of beads. Cells were maintained viable in culture for 4 weeks, with no signs of necrosis, and protein diffusion was observed during these weeks. Results of these in vitro studies clearly demonstrated that microisolation of BHK cells in alginate using a simple assembly device could provide an environment that is capable of preserving live and viable cells. In addition, encapsulated cells under the conditions described were able to secrete β- galactosidase even after four weeks of treatment, thus becoming potentially compatible with therapeutic protein delivery.

En esta Tesis Doctoral se propuso la síntesis de hidrogeles termo-sensibles para aplicaciones biomédicas a partir de copolímeros de alginato y N-isopropilacrilamida (NIPAAm). Los copolímeros de injerto se obtuvieron empleando tres métodos de síntesis: uno basado en la generación de los sitios reactivos por medio de un iniciador redox convencional (nitrato de amonio y cerio(IV), CAN), el otro mediante radiaciones ionizantes de alta energía, mientras que el tercer método se realizó en dos etapas consecutivas, obteniendo primero polímeros telequélicos amino-terminados los cuales se unieron luego a la cadena del alginato por medio de una reacción de condensación. Los copolímeros obtenidos fueron caracterizados química y térmicamente empleando distintas técnicas analíticas tales como Resonancia Magnética Nuclear de protón (1H-NMR), Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR), análisis termogravimétrico (TGA), reología y mediciones de punto de nube (CP). Los copolímeros de injerto obtenidos mediante irradiación con rayos gamma de soluciones acuosas de alginato y NIPAAm presentaron buenas propiedades físicas, tal como solubilidad y termosensibilidad. La composición de los copolímeros resultó ser función de la dosis de radiación y la composición de alginato y NIPAAm en la mezcla inicial de reacción. De las otras dos vías de síntesis química utilizadas, resultó mejor aquella basada en la obtención de PNIPAAm amino terminado (PNIPAAm-NH2), y su posterior injerto en la cadena de alginato mediante la reacción de condensación entre los grupos amino del PNIPAAm y los grupos carboxílicos del alginato, ya que se obtuvieron copolímeros con estructura química controlada, con cadenas laterales de masas molares conocidas y una composición definida por la mezcla de reacción. Los hidrogeles empleados en los ensayos de hinchamiento se prepararon en forma de perlas, por medio del goteo de soluciones de copolímeros sobre una solución de cloruro de calcio. El grado de hinchamiento de los hidrogeles obtenidos a partir de los copolímeros sintetizados por irradiación presentó una dependencia con la temperatura y el contenido de PNIPAAm. Por otra parte, si bien los copolímeros obtenidos a partir del injerto de PNIPAAm-NH2 sobre el alginato presentaron termosensibilidad en solución, tal como se pudo observar en los ensayos de reología, los hidrogeles obtenidos a partir de estos copolímeros no mostraron luego este comportamiento, debido probablemente al menor contenido de PNIPAAm una vez obtenido el hidrogel hinchado. iii Para llevar a cabo ensayos de liberación se seleccionaron como matrices portadoras del fármaco modelo a aquellos hidrogeles más promisorios de acuerdo a los resultados de hinchamiento obtenidos previamente. Estudios preliminares de liberación de atenolol empleando hidrogeles termosensibles, preparados a partir de los copolímeros de injerto obtenidos por irradiación, mostraron una liberación de aproximadamente un 70 % del contenido inicial del fármaco en el hidrogel en la primer hora de ensayo a 37 °C. / In this Doctoral Thesis the synthesis of thermo-responsive hydrogels for biomedical application obtained from alginate and N-isopropylacrylamide (NIPAAm) graft copolymers has been proposed. In order to obtain the copolymers three methods of graft copolymerization have been studied: gamma-ray irradiation and two different methods of conventional grafting reactions using chemical initiator agents. Obtained graft copolymers were chemically and thermally characterized by H-Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), Thermal Gravimetric Analysis (TGA), rheology, and cloud point measurements (CP). Graft copolymers obtained by gamma-ray irradiation of aqueous solutions of alginate and NIPAAm presented good physical properties such as solubility and thermosensibility. Copolymers composition is a function of radiation dose and alginate and NIPAAm composition in the initial aqueous solution. Only graft copolymers obtained from amino-terminated PNIPAAm, PNIPAAm-NH2 prepared by a redox initiator, and grafted to alginate by a condensation reaction between amino groups of PNIPAAm-NH2 and carboxylic groups of alginate, gave copolymers with a know chemical structure with side chains of defined molar mass defined and a composition given by the reaction mixture. Swelling degree studies were performed on hydrogels obtained by dropping an aqueous solution of the copolymer onto a solution of calcium chloride. Swelling degree of the hydrogels, prepared by using the copolymers synthesized by gamma irradiation, was a function of both temperature and NIPAAm content. On the other hand, even when copolymers obtained by grafting PNIPAAm-NH2 onto alginate showed an observable thermosensibility in solution, hydrogels prepared with those graft copolymers did not behave in the same way, probably due to the low PNIPAAm content in the swollen hydrogel. Controlled release studies were carried out on those hydrogels that presented thermosensitivity in the swelling study. Preliminary results on athenolol release, using the thermosensitivity hydrogels obtained from the graft copolymers synthesized by gamma radiation, gave a 70 % recovery of initial drug load after one hour at 37 ºC.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-08-30T16:48:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Iorrana Ribeiro Versão Final.pdf: 3686467 bytes, checksum: eb3be92a5a83832d6b8853f47e27da79 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T16:48:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Iorrana Ribeiro Versão Final.pdf: 3686467 bytes, checksum: eb3be92a5a83832d6b8853f47e27da79 (MD5) / Um grande desafio para a medicina e para os pesquisadores da Área de Bioengenharia Tecidual Óssea é desenvolver e aperfeiçoar técnicas e biomateriais que possam devolver a estrutura e funcionalidade do tecido ósseo em caso de perdas ósseas extensas. Dentre os biomateriais utilizados, a hidroxiapatita tem se destacado devido à sua excelente biocompatibilidade, similaridade com a fase mineral do tecido ósseo e interação biológica com os tecidos do sítio de implantação. A associação da hidroxiapatita com polímeros é um caminho promissor, já que este compósito garante diminuição da fragilidade da biocerâmica, estimula a adesão de células e simula a composição química do tecido ósseo. Porém, além da composição, as características físico-químicas do biomaterial, como tamanho e formato, também influenciam diretamente o seu potencial osteogênico. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a biocompatibilidade e o potencial osteogênico de biomateriais à base de hidroxiapatita no reparo ósseo. Para isso, uma amostra de 15 ratos foi utilizada, distribuídos para a composição de 3 grupos, com 5 animais cada, avaliados no ponto biológico de 15 dias de pós-operatório: Grupo GHAalg – defeito preenchido com grânulos de hidroxiapatita associada ao alginato; Grupo EHAalg – defeito preenchido com microesferas de hidroxiapatita associada ao alginato; Grupo Controle – defeito ósseo vazio, sem implantação de biomaterial. No grupo GHAalg, observou-se a deposição de matriz osteoide no centro do defeito, em permeio aos grânulos, e uma discreta inflamação crônica granulomatosa. No grupo EHAalg, notou-se a formação de delgados septos de tecido conjuntivo ao redor das microesferas e em permeio as suas partículas a deposição de um tecido conjuntivo associado à reação inflamatória crônica granulomatosa. No Grupo Controle, a neoformação óssea restringiu-se às bordas ósseas e houve preenchimento de toda extensão do defeito por tecido conjuntivo. Diante disto, concluiu-se que ambos os biomateriais foram biocompatíveis e os GHAalg tiveram comportamento osteogênico superior as EHAalg.

As doenças lisossômicas (DL) são um grupo de doenças herdadas geneticamente e que são causadas por um defeito parcial ou total de enzimas envolvidas na degradação de macromoléculas dentro dos lisossomos. Terapias para aumentar os níveis de enzima nas DL incluem o transplante de célulastronco hematopoiéticas (TCTH) e terapia de reposição enzimática (TRE). Esses tratamentos são todos baseados na propriedade das enzimas lisossomais de serem secretadas e captadas pelas células vizinhas através do receptor de manose-6-fosfato (M6PR). Novas abordagens terapêuticas vêm sendo investigadas, uma vez que as terapias atuais possuem limitações. A microencapsulação de células geneticamente modificadas superexpressando um produto terapêutico e o aperfeiçoamento na captação de enzimas lisossomais, via M6PR, parecem ser estratégias promissoras. Neste trabalho objetivamos aperfeiçoar o sistema de liberação de enzimas lisossomais superexpressas por células recombinantes microencapsuladas para o tratamento das DL. Para isso, estudos de biocompatibilidade in vivo foram avaliados com distintos tipos celulares (BHK e HepG2), concentrações de alginato (1 e 1,5%), tempos (7 e 21 dias) e sítios de implante (cavidade peritoneal, tecido subcutâneo e músculo vasto-medial) em ratos Wistar. A resposta inflamatória foi caracterizada e células-tronco mesenquimais (CTM) foram encapsuladas e implantadas em ratos para avaliar se o seu efeito imunomodulador poderia diminuí-la. Posteriormente o efeito antiinflamatório da prednisolona foi avaliado em camundongos normais e MPS I tratados com células BHK superexpressando IDUA (BHKIDUA) encapsuladas e implantadas na cavidade intraperitoneal por 15 dias. A liberação da enzima após implante foi avaliada por meio da recuperação das cápsulas e cultivo das mesmas por 24h e medida de IDUA no meio. Observamos que as microcapsulas in vivo provocam uma reação do tipo corpo estranho, em todos os parâmetros avaliados. Essa reação se dá por presença de fibrose e infiltrado inflamatório e diminui aos 21 dias. O uso de CTM encapsuladas melhorou esse aspecto, uma vez que a resposta foi menor em ratos nos quais esse tipo celular foi implantado, devido ao efeito imunomodulador dessas células. O tratamento com antiinflamatório prednisolona também diminuiu a resposta inflamatória gerada contra as microcápsulas implantadas na cavidade peritoneal de camundongos normais e MPS I. As células encapsuladas permaneceram viáveis após os 15 dias de implante. A liberação de enzima para o meio extracapsular é maior nas cápsulas recuperadas de animais tratados com prednisolona. Níveis de atividade de IDUA circulante passaram de indetectáveis para 2,4 nmol/h/mL de soro nos animais MPS I tratados. Outra estratégia utilizada foi a superexpressão de M6PR para melhorar a captação enzimática. Avaliamos os níveis de M6PR em fibroblastos de pacientes com Leucodistrofia Metacromática (LDM) e normais após o tratamento com o sobrenadante de células BHK superexpressando ARSA (BHKARSA), por imunocitoquímica e PCR em Tempo Real. Finalmente foi avaliado se o pré-tratamento de fibroblastos MPS I com o sobranadante de BHKARSA e posterior tratamento com o sobrenadante de BHKIDUA melhorava a captação de IDUA nessas células devido ao aumento na expressão dos M6PR. O tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA levou a um aumento na expressão, em cerca de 2 vezes, dos M6PR em fibroblastos de pacientes com LDM e de indivíduos normais. O pré-tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA também levou a um aumento de 2 vezes na expressão dos M6PR e aumentou a captação de IDUA por fibroblastos de pacientes com MPS I. Juntos esses resultados sugerem que as células microencapsuladas podem ser uma boa estratégia para a entrega de produtos terapêuticos desde que sua biocompatibilidade seja melhorada e que a partir da descoberta dos mecanismos que levam à superxpressão dos M6PR, o sobrenadante de BHKARSA poderá ser usado como adjuvante no tratamento com TRE ou células encapsuladas. / Lysosomal Diseases (LD) are a group of genetically inherited diseases, caused by total or partial failure of enzymes involved in the degradation of macromolecules in lysosomes. Therapies to increase enzyme levels in LD include transplantation of hematopoietic stem cells (THSC) and enzyme replacement therapy (ERT). These treatments are based on the properties of lysosomal enzymes to be secreted and uptaken by neighboring cells through the mannose 6-phosphate receptor (M6PR). Since current therapies have limitations, new therapeutic approaches are under investigation. Microencapsulation of genetically modified cells overexpressing therapeutic products and the improvement in the uptake of lysosomal enzymes via M6PR seem to be promising strategies. In this work, we aimed to improve the delivery system of lysosomal enzymes overexpressed by microencapsulated recombinant cells for LD treatment. In vivo biocompatibility was evaluated using distinct cell lines (BHK and HepG2), alginate concentrations (1 and 1.5%), duration (7 and 21 days), and implant sites (peritoneal, subcutaneous and in the vastus medialis muscle) in Wistar rats. Inflammatory response was observed and characterized. Then we used encapsulated mesenchymal stem cells (MSC) to evaluate whether their immunomodulatory effect could decrease this response in rats. Subsequently, the anti-inflammatory effect of prednisolone was evaluated in normal and MPSI mice, both treated with encapsulated BHK cells overexpressing IDUA (BHKIDUA) and implanted in intraperitoneal cavity for 15 days. The enzyme release to the extra-capsular medium was measured in recovered capsules after 24h culture. The in vivo biocompatibility of microcapsules is a typical foreign body reaction in all parameters evaluated. This reaction occurs due to fibrosis and inflammatory infiltrate formation, but decreases after 21 days. The use of encapsulated MSC improved this aspect, since the response was milder in rats that received this cell type, due to the immonomodulatory effect of MSC. Treatment with prednisolone also decreased the response generated against alginate microcapsules implanted in the peritoneal cavity of both normal and MPS I mice. The encapsulated cells remained viable 15 days after the implant. The enzyme release to the extracapsular medium was higher in capsules recovered from prednisolone treated animals. Circulating levels of IDUA increased from undetectable to 2.4 nmol/h/mL of serum. Another strategy evaluated by our group was the up regulation of M6PR to enhance enzyme uptake. We evaluated M6PR levels in MLD and normal fibroblasts after treatment with the conditionated medium from cells overexpressing ARSA (BHKARSA), by immunocytochemistry and real time PCR. Finally we verified if pre-treatment of MPS I fibroblasts with BHKARSA followed by treatment with conditionated medium of BHKIDUA improved IDUA uptake. MLD and normal fibroblasts treated with BHKARSA had a 2-fold increase in M6PR expression. Pre-treatment with BHKARSA and after with BHKIDUA also led to a 2-fold increase in the expression of M6PR, and IDUA uptake was improved in these cells. Together these results suggest that microencapsulated cells may be an interesting strategy for delivery of therapeutic products as long as its biocompatibility is improved. Once the mechanism leading to M6PR over expression is defined, the conditionated medium of BHKARSA could be used as an adjuvant in ERT or with encapsulated cells.

As doenças lisossômicas (DL) são um grupo de doenças herdadas geneticamente e que são causadas por um defeito parcial ou total de enzimas envolvidas na degradação de macromoléculas dentro dos lisossomos. Terapias para aumentar os níveis de enzima nas DL incluem o transplante de célulastronco hematopoiéticas (TCTH) e terapia de reposição enzimática (TRE). Esses tratamentos são todos baseados na propriedade das enzimas lisossomais de serem secretadas e captadas pelas células vizinhas através do receptor de manose-6-fosfato (M6PR). Novas abordagens terapêuticas vêm sendo investigadas, uma vez que as terapias atuais possuem limitações. A microencapsulação de células geneticamente modificadas superexpressando um produto terapêutico e o aperfeiçoamento na captação de enzimas lisossomais, via M6PR, parecem ser estratégias promissoras. Neste trabalho objetivamos aperfeiçoar o sistema de liberação de enzimas lisossomais superexpressas por células recombinantes microencapsuladas para o tratamento das DL. Para isso, estudos de biocompatibilidade in vivo foram avaliados com distintos tipos celulares (BHK e HepG2), concentrações de alginato (1 e 1,5%), tempos (7 e 21 dias) e sítios de implante (cavidade peritoneal, tecido subcutâneo e músculo vasto-medial) em ratos Wistar. A resposta inflamatória foi caracterizada e células-tronco mesenquimais (CTM) foram encapsuladas e implantadas em ratos para avaliar se o seu efeito imunomodulador poderia diminuí-la. Posteriormente o efeito antiinflamatório da prednisolona foi avaliado em camundongos normais e MPS I tratados com células BHK superexpressando IDUA (BHKIDUA) encapsuladas e implantadas na cavidade intraperitoneal por 15 dias. A liberação da enzima após implante foi avaliada por meio da recuperação das cápsulas e cultivo das mesmas por 24h e medida de IDUA no meio. Observamos que as microcapsulas in vivo provocam uma reação do tipo corpo estranho, em todos os parâmetros avaliados. Essa reação se dá por presença de fibrose e infiltrado inflamatório e diminui aos 21 dias. O uso de CTM encapsuladas melhorou esse aspecto, uma vez que a resposta foi menor em ratos nos quais esse tipo celular foi implantado, devido ao efeito imunomodulador dessas células. O tratamento com antiinflamatório prednisolona também diminuiu a resposta inflamatória gerada contra as microcápsulas implantadas na cavidade peritoneal de camundongos normais e MPS I. As células encapsuladas permaneceram viáveis após os 15 dias de implante. A liberação de enzima para o meio extracapsular é maior nas cápsulas recuperadas de animais tratados com prednisolona. Níveis de atividade de IDUA circulante passaram de indetectáveis para 2,4 nmol/h/mL de soro nos animais MPS I tratados. Outra estratégia utilizada foi a superexpressão de M6PR para melhorar a captação enzimática. Avaliamos os níveis de M6PR em fibroblastos de pacientes com Leucodistrofia Metacromática (LDM) e normais após o tratamento com o sobrenadante de células BHK superexpressando ARSA (BHKARSA), por imunocitoquímica e PCR em Tempo Real. Finalmente foi avaliado se o pré-tratamento de fibroblastos MPS I com o sobranadante de BHKARSA e posterior tratamento com o sobrenadante de BHKIDUA melhorava a captação de IDUA nessas células devido ao aumento na expressão dos M6PR. O tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA levou a um aumento na expressão, em cerca de 2 vezes, dos M6PR em fibroblastos de pacientes com LDM e de indivíduos normais. O pré-tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA também levou a um aumento de 2 vezes na expressão dos M6PR e aumentou a captação de IDUA por fibroblastos de pacientes com MPS I. Juntos esses resultados sugerem que as células microencapsuladas podem ser uma boa estratégia para a entrega de produtos terapêuticos desde que sua biocompatibilidade seja melhorada e que a partir da descoberta dos mecanismos que levam à superxpressão dos M6PR, o sobrenadante de BHKARSA poderá ser usado como adjuvante no tratamento com TRE ou células encapsuladas. / Lysosomal Diseases (LD) are a group of genetically inherited diseases, caused by total or partial failure of enzymes involved in the degradation of macromolecules in lysosomes. Therapies to increase enzyme levels in LD include transplantation of hematopoietic stem cells (THSC) and enzyme replacement therapy (ERT). These treatments are based on the properties of lysosomal enzymes to be secreted and uptaken by neighboring cells through the mannose 6-phosphate receptor (M6PR). Since current therapies have limitations, new therapeutic approaches are under investigation. Microencapsulation of genetically modified cells overexpressing therapeutic products and the improvement in the uptake of lysosomal enzymes via M6PR seem to be promising strategies. In this work, we aimed to improve the delivery system of lysosomal enzymes overexpressed by microencapsulated recombinant cells for LD treatment. In vivo biocompatibility was evaluated using distinct cell lines (BHK and HepG2), alginate concentrations (1 and 1.5%), duration (7 and 21 days), and implant sites (peritoneal, subcutaneous and in the vastus medialis muscle) in Wistar rats. Inflammatory response was observed and characterized. Then we used encapsulated mesenchymal stem cells (MSC) to evaluate whether their immunomodulatory effect could decrease this response in rats. Subsequently, the anti-inflammatory effect of prednisolone was evaluated in normal and MPSI mice, both treated with encapsulated BHK cells overexpressing IDUA (BHKIDUA) and implanted in intraperitoneal cavity for 15 days. The enzyme release to the extra-capsular medium was measured in recovered capsules after 24h culture. The in vivo biocompatibility of microcapsules is a typical foreign body reaction in all parameters evaluated. This reaction occurs due to fibrosis and inflammatory infiltrate formation, but decreases after 21 days. The use of encapsulated MSC improved this aspect, since the response was milder in rats that received this cell type, due to the immonomodulatory effect of MSC. Treatment with prednisolone also decreased the response generated against alginate microcapsules implanted in the peritoneal cavity of both normal and MPS I mice. The encapsulated cells remained viable 15 days after the implant. The enzyme release to the extracapsular medium was higher in capsules recovered from prednisolone treated animals. Circulating levels of IDUA increased from undetectable to 2.4 nmol/h/mL of serum. Another strategy evaluated by our group was the up regulation of M6PR to enhance enzyme uptake. We evaluated M6PR levels in MLD and normal fibroblasts after treatment with the conditionated medium from cells overexpressing ARSA (BHKARSA), by immunocytochemistry and real time PCR. Finally we verified if pre-treatment of MPS I fibroblasts with BHKARSA followed by treatment with conditionated medium of BHKIDUA improved IDUA uptake. MLD and normal fibroblasts treated with BHKARSA had a 2-fold increase in M6PR expression. Pre-treatment with BHKARSA and after with BHKIDUA also led to a 2-fold increase in the expression of M6PR, and IDUA uptake was improved in these cells. Together these results suggest that microencapsulated cells may be an interesting strategy for delivery of therapeutic products as long as its biocompatibility is improved. Once the mechanism leading to M6PR over expression is defined, the conditionated medium of BHKARSA could be used as an adjuvant in ERT or with encapsulated cells.

As doenças lisossômicas (DL) são um grupo de doenças herdadas geneticamente e que são causadas por um defeito parcial ou total de enzimas envolvidas na degradação de macromoléculas dentro dos lisossomos. Terapias para aumentar os níveis de enzima nas DL incluem o transplante de célulastronco hematopoiéticas (TCTH) e terapia de reposição enzimática (TRE). Esses tratamentos são todos baseados na propriedade das enzimas lisossomais de serem secretadas e captadas pelas células vizinhas através do receptor de manose-6-fosfato (M6PR). Novas abordagens terapêuticas vêm sendo investigadas, uma vez que as terapias atuais possuem limitações. A microencapsulação de células geneticamente modificadas superexpressando um produto terapêutico e o aperfeiçoamento na captação de enzimas lisossomais, via M6PR, parecem ser estratégias promissoras. Neste trabalho objetivamos aperfeiçoar o sistema de liberação de enzimas lisossomais superexpressas por células recombinantes microencapsuladas para o tratamento das DL. Para isso, estudos de biocompatibilidade in vivo foram avaliados com distintos tipos celulares (BHK e HepG2), concentrações de alginato (1 e 1,5%), tempos (7 e 21 dias) e sítios de implante (cavidade peritoneal, tecido subcutâneo e músculo vasto-medial) em ratos Wistar. A resposta inflamatória foi caracterizada e células-tronco mesenquimais (CTM) foram encapsuladas e implantadas em ratos para avaliar se o seu efeito imunomodulador poderia diminuí-la. Posteriormente o efeito antiinflamatório da prednisolona foi avaliado em camundongos normais e MPS I tratados com células BHK superexpressando IDUA (BHKIDUA) encapsuladas e implantadas na cavidade intraperitoneal por 15 dias. A liberação da enzima após implante foi avaliada por meio da recuperação das cápsulas e cultivo das mesmas por 24h e medida de IDUA no meio. Observamos que as microcapsulas in vivo provocam uma reação do tipo corpo estranho, em todos os parâmetros avaliados. Essa reação se dá por presença de fibrose e infiltrado inflamatório e diminui aos 21 dias. O uso de CTM encapsuladas melhorou esse aspecto, uma vez que a resposta foi menor em ratos nos quais esse tipo celular foi implantado, devido ao efeito imunomodulador dessas células. O tratamento com antiinflamatório prednisolona também diminuiu a resposta inflamatória gerada contra as microcápsulas implantadas na cavidade peritoneal de camundongos normais e MPS I. As células encapsuladas permaneceram viáveis após os 15 dias de implante. A liberação de enzima para o meio extracapsular é maior nas cápsulas recuperadas de animais tratados com prednisolona. Níveis de atividade de IDUA circulante passaram de indetectáveis para 2,4 nmol/h/mL de soro nos animais MPS I tratados. Outra estratégia utilizada foi a superexpressão de M6PR para melhorar a captação enzimática. Avaliamos os níveis de M6PR em fibroblastos de pacientes com Leucodistrofia Metacromática (LDM) e normais após o tratamento com o sobrenadante de células BHK superexpressando ARSA (BHKARSA), por imunocitoquímica e PCR em Tempo Real. Finalmente foi avaliado se o pré-tratamento de fibroblastos MPS I com o sobranadante de BHKARSA e posterior tratamento com o sobrenadante de BHKIDUA melhorava a captação de IDUA nessas células devido ao aumento na expressão dos M6PR. O tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA levou a um aumento na expressão, em cerca de 2 vezes, dos M6PR em fibroblastos de pacientes com LDM e de indivíduos normais. O pré-tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA também levou a um aumento de 2 vezes na expressão dos M6PR e aumentou a captação de IDUA por fibroblastos de pacientes com MPS I. Juntos esses resultados sugerem que as células microencapsuladas podem ser uma boa estratégia para a entrega de produtos terapêuticos desde que sua biocompatibilidade seja melhorada e que a partir da descoberta dos mecanismos que levam à superxpressão dos M6PR, o sobrenadante de BHKARSA poderá ser usado como adjuvante no tratamento com TRE ou células encapsuladas. / Lysosomal Diseases (LD) are a group of genetically inherited diseases, caused by total or partial failure of enzymes involved in the degradation of macromolecules in lysosomes. Therapies to increase enzyme levels in LD include transplantation of hematopoietic stem cells (THSC) and enzyme replacement therapy (ERT). These treatments are based on the properties of lysosomal enzymes to be secreted and uptaken by neighboring cells through the mannose 6-phosphate receptor (M6PR). Since current therapies have limitations, new therapeutic approaches are under investigation. Microencapsulation of genetically modified cells overexpressing therapeutic products and the improvement in the uptake of lysosomal enzymes via M6PR seem to be promising strategies. In this work, we aimed to improve the delivery system of lysosomal enzymes overexpressed by microencapsulated recombinant cells for LD treatment. In vivo biocompatibility was evaluated using distinct cell lines (BHK and HepG2), alginate concentrations (1 and 1.5%), duration (7 and 21 days), and implant sites (peritoneal, subcutaneous and in the vastus medialis muscle) in Wistar rats. Inflammatory response was observed and characterized. Then we used encapsulated mesenchymal stem cells (MSC) to evaluate whether their immunomodulatory effect could decrease this response in rats. Subsequently, the anti-inflammatory effect of prednisolone was evaluated in normal and MPSI mice, both treated with encapsulated BHK cells overexpressing IDUA (BHKIDUA) and implanted in intraperitoneal cavity for 15 days. The enzyme release to the extra-capsular medium was measured in recovered capsules after 24h culture. The in vivo biocompatibility of microcapsules is a typical foreign body reaction in all parameters evaluated. This reaction occurs due to fibrosis and inflammatory infiltrate formation, but decreases after 21 days. The use of encapsulated MSC improved this aspect, since the response was milder in rats that received this cell type, due to the immonomodulatory effect of MSC. Treatment with prednisolone also decreased the response generated against alginate microcapsules implanted in the peritoneal cavity of both normal and MPS I mice. The encapsulated cells remained viable 15 days after the implant. The enzyme release to the extracapsular medium was higher in capsules recovered from prednisolone treated animals. Circulating levels of IDUA increased from undetectable to 2.4 nmol/h/mL of serum. Another strategy evaluated by our group was the up regulation of M6PR to enhance enzyme uptake. We evaluated M6PR levels in MLD and normal fibroblasts after treatment with the conditionated medium from cells overexpressing ARSA (BHKARSA), by immunocytochemistry and real time PCR. Finally we verified if pre-treatment of MPS I fibroblasts with BHKARSA followed by treatment with conditionated medium of BHKIDUA improved IDUA uptake. MLD and normal fibroblasts treated with BHKARSA had a 2-fold increase in M6PR expression. Pre-treatment with BHKARSA and after with BHKIDUA also led to a 2-fold increase in the expression of M6PR, and IDUA uptake was improved in these cells. Together these results suggest that microencapsulated cells may be an interesting strategy for delivery of therapeutic products as long as its biocompatibility is improved. Once the mechanism leading to M6PR over expression is defined, the conditionated medium of BHKARSA could be used as an adjuvant in ERT or with encapsulated cells.

La impresión dental es el procedimiento que más se realiza en la práctica clínica odontológica por lo que es indispensable realizarla de manera correcta para obtener un modelo definitivo óptimo. El propósito del presente estudio fue evaluar la alteración dimensional en modelos de yeso tipo IV obtenidos de impresiones con alginato, en las cuales la preparación empleó mayor o menor proporción de agua de lo que el fabricante refiere para la mezcla. El material utilizado fue alginato Tropicalgin de Zhermack®. Se realizó un modelo maestro de acero inoxidable, el cual simulaba una hemi-arcada con dos pilares. Se establecieron 3 grupos (Grupo1, Grupo control: 18 ml de agua y 9gr de polvo que corresponden a las proporciones indicadas por el fabricante, grupo 2: 13.5 ml de agua y 9 gr de polvo y grupo 3: 24 ml de agua y 9 gr de polvo). Se realizaron 15 impresiones por cada grupo que fueron vaciadas en yeso tipo IV Elite Rock de Zhermack®. Se realizaron 8 medidas a los modelos de yeso obtenidos de éstas impresiones mediante una máquina de medición por coordenadas con tecnología de Scanning por contacto modelo Contura G2 ZEISS para ser comparadas con las medidas del modelo maestro. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas para las localizaciones E, F, G y H que corresponden a las medidas de las cimas y bases de los pilares. / Tesis

LINS, Kézia Oliveira Abrantes de Lacerda. Estudo das atividades antitumoral e inflamatória do alginato isolado da alga Sargassum Vulgare C. Agardh. 2012. 122 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-28T11:09:42Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_koallins.pdf: 7814747 bytes, checksum: 6c6167631ef347d8c5165dbab35755ab (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-28T11:43:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_koallins.pdf: 7814747 bytes, checksum: 6c6167631ef347d8c5165dbab35755ab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T11:43:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_koallins.pdf: 7814747 bytes, checksum: 6c6167631ef347d8c5165dbab35755ab (MD5) Previous issue date: 2012 / Cancer is a disease that occurs in a larger number of people each year. The therapies used to treat it are still not satisfatory. Natural products have been studied to select new compounds capable of reducing tumours and with fewer side effects. The alginate isolated from the seaweed S. vulgare (SVHV) was investigated for its antitumor and immunostimulating properties and also for the toxicological aspects related to SVHV treatment. The SVHV did not show any significant in vitro cytotoxic effect, but showed a strong in vivo antitumor effect. The inhibition rates of Melanoma B-16 tumor development was 75,8% at the dose of 25 mg/kg/day when treated by intraperitoneal route (p < 0,05). The histopathological analysis of liver and kidney showed that the kidneys were affected by SVHV-treatment, presenting some hemorragic areas. The enzymatic activity of alanine aminotransferase, was augmented in mice with tumor or treated with SVHV by oral route. In hematological analyses, these groups showed a higher percentage of neutrophils, while the group with tumor or treated with SVHV by intraperitoneal route showed a reduction in the percentage of monocytes. It was also demonstrated that SVHV acts as an immunomodulatory agent, stimulating macrophages in vitro, causing paw edema in rats and neutrophil migration to the intraperitoneal cavity. In conclusion, SVHV has some interesting antitumour activity that is associated with its immunostimulanting properties. / O câncer é uma doença que afeta cada vez mais um número maior de pessoas em todo o mundo. As terapias atuais utilizadas para o tratamento do câncer são ainda insatisfatórias. Produtos naturais têm sido avaliados para seleção de compostos ativos, capazes de reduzir os tumores malignos de uma forma mais eficiente e com menos efeitos indesejáveis. O alginato extraído da alga Sargassum vulgare C. AGARDH (SVHV) foi testado para avaliação do seu potencial antitumoral e imunoestimulante. Além disso, foram feitos testes de toxicidade do fígado, rins e baço após o tratamento com SVHV. Os resultados demonstraram que SVHV não apresenta citotoxicidade in vitro, mas é capaz de reduzir o tumor Melanoma B-16 implantado em camundongos em 75,8% na dose de 25mg/kg/dia, quando administrado por via intraperitoneal (p < 0,05), enquanto não houve inibição por via oral. As análises do fígado e rins revelaram que houve toxicidade no rim, com áreas de hemorragia glomerular e intersticial nos camundongos tratados com SVHV. Essas alterações são, entretanto, consideradas reversíveis. As análises bioquímicas, revelaram um aumento nos níveis séricos da alanina aminotransferase (ALT) nos grupos com tumor ou tratado com SVHV por via oral e os testes hematológicos revelaram um aumento na porcentagem de neutrófilos nestes grupos, enquanto que a porcentagem de monócitos foi reduzida nos grupos com tumor e nos tratados com SVHV por via intraperitoneal. Também foi demonstrado que SVHV age como agente imunoestimulante e imunomodulador, ativando macrófagos in vitro, assim como sendo capaz de causar inflamação através do teste do edema de pata e induzir a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal. Conclui-se então que SVHV apresenta atividade antitumoral e que esta atividade está relacionada com suas propriedades imunoestimulantes.