La MAPK p38α est une protéine clé de l’inflammation, également impliquée dans de nombreux processus liés au cancer. Les petites molécules chimiques inhibitrices de p38α bloquent son activité kinase par un mécanisme de compétition à l’ATP. En raison de la grande conservation du domaine kinase, la spécificité de la majorité de ces inhibiteurs n’est pas restreinte à la p38α et des effets « off-targets » ont été rapportés. Dans ce contexte, le projet de ma thèse a porté sur l’utilisation de fragments d’anticorps au format scFv comme nouvel outil de ciblage pharmacologique afin de définir une/des voie(s) alternative(s) d’inhibition de la p38α. Les fragments d’anticorps lient un motif antigénique avec une affinité et une spécificité élevées, tout comme les immunoglobulines classiques. Leur expression intracellulaire permet également le ciblage de protéines cytoplasmiques et l’étude de leurs fonctions dans des processus physiologiques et pathologiques. Nous avons sélectionné par phage display, à partir d’une banque de fragments d’anticorps, 5 scFv spécifiques de la MAPK p38α. Alors que tous ces scFv empêchent l’activation par phosphorylation de la p38α par MKK6, l’un d’entre eux agit directement sur l’enzyme pour inhiber totalement son activité kinase in vitro. Ce scFv possède un site de liaison et un mécanisme d’inhibition distincts des inhibiteurs pharmacologiques déjà décrits : bien qu’il ne cible pas le domaine kinase et n’empêche pas la fixation de l’ATP, le scFv se comporte comme un inhibiteur compétitif de l’hydrolyse de l’ATP. Ces résultats suggèrent un effet allostérique du scFv sur l’activité de la p38α et permettent de le caractériser comme un inhibiteur compétitif non conventionnel. La détermination de son épitope d‘interaction ainsi que la confirmation de sa fonctionnalité une fois exprimé dans le cytosol des cellules nous permettra de définir une voie alternative d'inhibition de la p38α et de valider notre approche de ciblage par l’utilisation de fragments d’anticorps.Ces données ouvrent de nouvelles perspectives de design d’inhibiteurs chimiques de la p38α de meilleure spécificité que ceux actuellement disponibles. / MAPK p38α is a key protein in inflammation, but is also involved in many cancer-related processes. All the currently described chemical inhibitors of p38α inhibit its kinase activity by an ATP-competitive mechanism. Because of the high conservation of the ATP-binding pocket, the majority of these inhibitors are not specific to p38α and off-target effects have been reported. To identify alternative approaches to inhibit p38α MAPK, my thesis project focused on the use of scFv antibody fragments as a new highly specific pharmacological tool.Antibody fragments bind to an antigen with high affinity and specificity like conventional immunoglobulins. Their intracellular expression also allows to target cytoplasmic proteins and study the target functions in physiological and pathological processes. Using a naïve library of antibody fragments, we have selected by phage display five scFv specific of MAPK p38α isoform. While all these scFv inhibit the activation of p38α by MMK6, one of them also completely inhibits its kinase activity in vitro. This scFv has a binding site and a mechanism of inhibition distinct from the pharmacological inhibitors currently described: although it does not target the ATP-binding pocket and does not prevent ATP binding, it behaves like a competitive inhibitor of ATP hydrolysis. These results suggest an allosteric effect of this scFv on p38α activity and allow to characterize it as an unconventional competitive inhibitor. The determination of its epitope as well as the confirmation of its inhibitory activity once expressed in the cell cytosol will allow us to propose an alternative approach to target p38α function using antibody fragments.These data open up new perspectives for the design of more specific p38α chemical inhibitors than those currently available.

Les intégrines, protéines transmembranaires hétérodimériques de type αβ, sont impliquées dans un grand nombre de phénomènes physiologiques et pathologiques. L’intégrine α5β1 est considérée à l’heure actuelle comme une cible thérapeutique pertinente en oncologie, en particulier pour le traitement des glioblastomes. Ces tumeurs cérébrales très agressives résistent aux traitements actuels, en partie par leur capacité à envahir le tissu cérébral sain. Nos résultats mettent en évidence, in vitro, le rôle de l’intégrine α5β1 dans la migration de cellules de glioblastome. Ils ont permis également de caractériser les effets inhibiteurs de la migration d’antagonistes sélectifs de l’intégrine α5β1 non reproduits par des antagonistes de l’intégrine αvβ3. Pour caractériser des antagonistes originaux de l’intégrine α5β1, nous avons combiné des techniques in silico et un test fonctionnel de migration in vitro. Cette démarche a permis la sélection de 3 molécules intéressantes, antagonistes allostériques de l’intégrine α5β1, se démarquant des antagonistes de référence par leur capacité à inhiber la migration cellulaire sans affecter la liaison du ligand endogène de l’intégrine, la fibronectine. / Integrins are αβ heterodimeric transmembrane proteins implicated in various physiological and pathological processes. Currently, α5β1 integrin is considered as a relevant therapeutic target in oncology, particularly for the treatment of glioblastomas. These highly aggressive brain tumours are resistant to current therapies, notably by their ability to invade healthy brain tissues. Our results highlight the role of the α5β1 integrin in the in vitro migration of glioblastoma cells. We characterized the inhibitory effects of selective α5β1 integrin antagonists in cell migration, which are not reproduced by αVβ3 integrin antagonists. To identify original and selective α5β1 integrin antagonists, we combined in silico screening and in vitro functional cell migration assays. This allowed the selection of 3 interesting molecules, behaving as allosteric α5β1 integrin antagonists. Contrarily to known α5β1 antagonists, our three hits inhibit cell migration without interfering with the binding of fibronectin, the endogenous ligand of this integrin.

L'objet de ce travail de thèse est l'étude de la photodissociation de la carboxymyoglobine (MbCO) par dichroïsme circulaire résolu temporellement (TRCD). La myoglobine (Mb) est une protéine responsable du stockage de l'oxygène dans les muscles de l'organisme. Lorsque le complexe MbCO absorbe un photon visible, il y a photodissociation, le CO se détache et quitte la protéine. Il s'agit donc de mesurer le dichroïsme circulaire de la myoglobine juste après la photodissociation, afin de pouvoir remonter aux changements de structure ultra rapides de la protéine. D'un point de vue expérimental, la difficulté de ce travail résidait dans la maîtrise des nombreux artefacts d'une telle expérience. D'un point de vue théorique, un calcul basé sur la théorie de la polarisabilité a permis de montre! r que le CD était sensible essentiellement aux mouvements de l'histidine proximale, résidu clef dans la compréhension de l'effet allostérique. Le résultat marquant de cette étude a donc été la mise en évidence d'une dynamique temporelle de 100 ps, attribuée à un mouvement de l'histidine proximale. Une nouvelle source laser a également été développée dans le but de faire des expériences de TRCD dans l'ultraviolet. L'objectif est de pouvoir suivre à terme la dynamique de repliement des protéines. Des résultats préliminaires ont été obtenus.

Afin de pallier l'apparition de souches pathogènes résistantes, de nouveaux traitements aux mécanismes d'action inédits doivent être découverts. Une de ces cibles d'intérêt grandissant est la synthèse de la structure coiffe chez les ARN messagers (ARNm) eucaryotes. Cette structure est l'une des modifications co-transcriptionnelles essentielles pour augmenter la demi-vie des ARNm, promouvoir leur export du noyau vers le cytoplasme et augmenter l'efficacité de leur traduction en protéines. La synthèse de la structure coiffe (m [indice supérieur 7] GpppARN) résulte de trois activités enzymatiques séquentielles qui ajoutent la structure m[indice supérieur 7] Gppp. Initialement, une ARN triphosphatase (RTase) hydrolyse le phosphate gamma de l'ARN. Une ARN guanylyltransférase (GTase) transfert ensuite sur cet ARN un groupement GMP à partir d'un GTP. Finalement, une ARN guanine-N7 méthyltransférase (N7-MTase) vient méthyler cette guanine en position N7. L'activité enzymatique de la GTase est déterminante pour la synthèse de la structure coiffe, ce qui en fait une cible potentiellement puissante afin d'inhiber la synthèse de la structure coiffe. Certaines études ont identifié des analogues de substrat et de produit, la ribavirine et le foscarnet respectivement, comme inhibiteur de GTase. Ces produits agissent sur les différentes GTases puisqu'elles possèdent un site actif très conservés au niveau de la coordination du substrat. Pour augmenter la spécificité des inhibiteurs, il serait avantageux d'identifier des composés ciblant les régions non conservées. Dans la présente étude, la technique du criblage virtuel a permis d'analyser le potentiel d'interaction des molécules à 80 % similaires au substrat naturel avec plusieurs structures de GTases. Parmi les interactions prédites identifiées par le criblage virtuel, une de ces molécules suscitait un intérêt particulier, puisqu'il s'agissait d'un composé utilisé chez l'humain en tant qu'antiviral et immunosuppresseur, l'acide mycophénolique (MPA). L'hypothèse initiale était que ce composé pouvait potentiellement interférer dans l'activité enzymatique des GTases. Pour valider cette prédiction, des essais biochimiques ciblant la réaction complète et les étapes intermédiaires de la GTase de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ) ont été utilisées pour définir l'effet du MPA sur la cinétique de cette GTase. En effet, la réaction de GTase se déroule en deux temps : premièrement, une molécule de GTP est hydrolysée par l'enzyme pour former du GMP, lequel est lié de façon covalente à l'enzyme, et deuxièmement, cette molécule de GMP est transférée sur un ARN diphosphorylé. Ces essais ont confirmé l'interaction prédite par le criblage virtuel. En utilisant cette approche, nous démontrons que le MPA peut inhiber la réaction de GTase en prévenant le transfert catalytique du nucléotide GMP sur l'ARNm accepteur. En ce sens, le MPA représente un nouveau type d'inhibiteur d'ARN guanylyltransférase qui inhibe la deuxième étape de l'activité catalytique. Puisque les résultats laissaient présager une inhibition non compétitive, il fallait confirmer que le MPA n'était pas reconnu par l'enzyme comme substrat. Pour ce faire, la technique de l'électrophorèse par capillarité a montré que l'inhibiteur ne formait pas de lien covalent avec l'enzyme. De plus, nous démontrons qu'une culture de Saccharomyces cerevisiae qui croit en présence de MPA dénote une quantité moindre d'ARNm possédant une coiffe. Finalement, des essais biochimiques démontrent que le composé peut également inhiber des enzymes de la même famille que les GTases utilisant des substrats différents : les ligases à ADN. Le MPA inhibe la deuxième étape de la réaction enzymatique d'une ligase, soit le transfert du nucléotide sur l'oligonucléotide. Ce mémoire vise donc à présenter un aperçu du mécanisme d'inhibition de l'ARN guanylyltransférase par un composé allostérique. Nous montrons qu'il est possible de réduire la synthèse de la structure coiffe en affectant les changements conformationnels de cette enzyme.

Une famille de pinces moléculaires commutables par coordination métallique basées sur une architecture modulaire de type bis(M-salphen) terpyridine (salphen = N,N’-disalicylidene-o-phenylenediamine) a été synthétisée dans le but de moduler, par un effet mécanique, des propriétés physiques ou chimiques à l’échelle moléculaire. Deux pinces fonctionnalisées par des complexes phosphorescents de platine(II) ont été synthétisées par une approche modulaire. Un mouvement réversible de fermeture et d’ouverture par coordination / décoordination a été obtenu ainsi qu’une extinction de la luminescence via un contrôle allostérique de la reconnaissance de Hg2+. Une pince comportant des complexes paramagnétiques de cuivre (II) a permis l’observation par RPE et SQUID d’une commutation réversible de l’interaction d’échange à travers l’espace entre les deux centres métalliques. Du manganèse(III) a également été utilisé afin de permettre la commutation de l’interaction d’échange via un ligand pontant cyanure grâce à un contrôle allostérique de l’intercalation. De manière similaire, la synthèse d’une pince moléculaire incorporant des unités molécule aimant a été mise au point. D’autre part les propriétés rédox d’une pince à base de nickel(II) ont aussi pu être contrôlées par le mouvement et l’intercalation de pyrazine dans la forme oxydée nickel(III). Finalement, la synthèse d’une pince catalytique a été mise au point, ouvrant la voie à des catalyseurs commutables biomimétiques fonctionnant par effet allostérique. / A family of switchable molecular tweezers based on a bis(M-salphen) terpyridine (salphen = N,N’-disalicylidene-o-phenylenediamine) structure has been developed to study the influence of a mechanical motion on physical properties at the molecular level. Two tweezers functionalized by phosphorescent platinum (II) complexes were synthesized using a modular approach. The reversible mechanical motion by coordination / decoordination of a first metal cation allowed reversible quenching of the luminescence thanks to mercury (II) intercalation with allosteric control. Similar tweezers bearing paramagnetic copper (II) permitted to reversibly switch through-space exchange interactions between the two metallic centers according to EPR and SQUID measurements. manganese (III) was also used in order to switch the exchange interaction through a cyanide bridging ligand whose intercalation can be controlled by allosteric effect. With a similar strategy, the synthetic route towards tweezers showing single-molecule-magnet behavior has beendeveloped. The redox property of nickel(II) based tweezers was also controlled by the mechanical motion and the intercalation of pyrazine in the oxidized nickel (III) closed form. Finally, the synthesis of catalytic tweezers was developed, opening the way to switchable biomimetic catalysts operating with allosteric control.

La fonction des protéines de signalisation est déterminée par la nature des domaines qui les composent. Une meilleure compréhension des voies de signalisation passe par l'étude de ces domaines et de leur régulation. PTPN4 est une tyrosine phosphatase qui joue un rôle anti-apoptotique. Lors de l'infection par une souche atténuée du virus de la rage, sa fonction est perturbée, conduisant à la mort des cellules. Cette perturbation est due à l'interaction du motif de reconnaissance au domaine PDZ (PBM) de la glycoprotéine virale avec le domaine PDZ de PTPN4. Nous avons montré que ce domaine PDZ a un rôle d'inhibiteur allostérique de l'activité catalytique de la phosphatase de PTPN4. Ceci représente la première description de la régulation d'une phosphatase par un domaine PDZ. Cette inhibition est levée lors de la fixation d'un ligand au domaine PDZ, tel que le PBM de la glycoprotéine virale. Notre étude structurale révèle que la fixation d'un PBM perturbe les interactions transitoires entre les deux domaines et rétablit ainsi les propriétés catalytiques de la phosphatase. Nous avons par ailleurs identifié un ligand endogène de PTPN4, la MAP Kinase p38 qui, à travers son interaction avec PTPN4, participerait à la régulation de l'homéostasie cellulaire. La formation du complexe implique le recrutement du PBM de p38 par le domaine PDZ de PTPN4. Ainsi, en plus d'avoir une fonction de régulation du domaine phosphatase, le domaine PDZ permet également le recrutement de partenaires et la présentation de substrats au site actif de la phosphatase de PTPN4. Cette étude contribue ainsi à améliorer notre connaissance du rôle des domaines PDZ dans les voies de signalisation cellulaires. / The function of signaling proteins is determined by the nature of the domains from which they are made up. A better understanding of cell signaling pathways will result from the study of these domains and their regulation. PTPN4 is a non-receptor tyrosine phosphatase with an anti-apoptotic function. Upon infection with an attenuated rabies virus, its function is hijacked, which subsequently leads to cell death. This phenotype is arises from the interaction of the PDZ binding motif (PBM) of the viral glycoprotein with the PDZ domain of PTPN4. In this study, we show that this PDZ domain is an allosteric inhibitor of the catalytic activity of the PTPN4 phosphatase domain. This is the first description of the regulation of a phosphatase by a PDZ domain. This inhibition is released by the interaction of a ligand to the PDZ domain, such as the viral glycoprotein PBM. Our structural study revealed that the PBM recognition disrupts the transient inter-domain interactions and restores the complete phosphatase catalytic properties. As well, we identified a PTPN4 endogenous ligand, the MAP Kinase p38, which may participate in the regulation of the cellular homeostatic through its interaction with PTPN4. Thus, in addition to its phosphatase regulatory role, the PDZ domain also allows the recruitment of partners and the introduction of substrates to the PTPN4 phosphatase active site. This study contributes to our understanding of the role played by PDZ domains in cell signaling pathways.

VIH-1, l’agent étiologique du Syndrome de l’Immunodéficience Acquise, est un rétrovirus qui infecte les cellules immunitaires et détourne leur machinerie cellulaire pour se répliquer rapidement. Lors de l’infection, le génome ARN est rétrotranscrit en ADN par la transcriptase inverse virale (RT), puis l’insertion du génome proviral dans l’ADN de la cellule hôte est une étape obligatoire du cycle viral catalysée par l’enzyme virale Intégrase (IN). L’interaction de l’IN avec son cofacteur essentiel, la protéine nucléaire LEDGF/p75, dirige l’intégration à l’intérieur de gènes dans des régions fortement exprimées de la chromatine, ce qui permet la production efficace de nouveaux virions. Les Inhibiteurs Allostériques Intégrase-LEDGF (INLAIs) sont une nouvelle classe de molécules antirétrovirales se liant à l’IN au site de liaison de LEDGF/p75. Conçus pour inhiber compétitivement l’interaction protéine-protéine IN-LEDGF/p75, ils inhibent également les activités enzymatiques de l’Intégrase et augmentent son niveau de multimérisation.Nous avons étudié plusieurs nouvelles séries d’INLAIs de la société Mutabilis, et avons pu démontrer que ces molécules inhibent l’intégration, mais ont aussi un effet antirétroviral plus puissant et indépendant de LEDGF/p75 post-intégration au cours de la maturation des virions, qui conduit à la production de virus non infectieux, ayant une morphologie excentrique caractérisée par un défaut d’encapsidation du génome viral. Lors de l’infection de cellules par ces virus, le cycle viral s’arrête à l’étape de rétrotranscription du génome viral. Nous avons montré que ces virions contiennent pourtant un génome viral stable et fonctionnel, une RT active et l’ARNtLys3 qui sert d’amorce à la rétrotranscription, et ont également conservé leur immunoréactivité pour les lymphocytes B et T. En évaluant l’impact du polymorphisme de l’IN au voisinage du site de liaison, nous avons identifié le variant polymorphe Ala125, pour lequel l’INLAI MUT-A perd concomitamment son effet sur la maturation des virions et sur la multimérisation de l’IN, tandis qu’il inhibe aussi bien l’intégration et l’interaction IN-LEDGF, prouvant que l’effet tardif des INLAIs est associé à l’induction de la multimérisation de l’IN. Nous avons pu associer la multimérisation de l’IN à une déstabilisation du dimère par les INLAIs en analysant les co-structures de MUT-A avec les intégrases polymorphes. Les INLAIs, outre leur intérêt thérapeutique sont de remarquables réactifs qui ont permis de démontrer le rôle essentiel de l’intégrase à trois étapes clés du cycle viral du VIH-1 : la rétrotranscription, l’intégration et la maturation des virions. / HIV-1, the causative agent of AIDS, is a retrovirus that infects immune cells and hijacks their cell machinery to achieve rapid replication. In the course of infection, the RNA genome is reverse transcribed into DNA by the viral Reverse Transcriptase (RT) before the obligatory insertion of the proviral genome into the host cell DNA catalyzed by the viral enzyme Integrase (IN). The interaction of IN with its essential cofactor, the nuclear protein LEDGF/p75, targets integration within gene introns in highly transcribed chromatine regions, which allows efficient production of new virions. IN-LEDGF Allosteric Inhibitors (INLAIs) are a novel class of antiretroviral molecules binding IN at the LEDGF/p75-binding site. Designed to competitively inhibit IN-LEDGF/p75 protein-protein interaction, they are also capable of inhibiting IN enzymatic activities and raising the IN multimerization level.We studied several new INLAI series from the company Mutabilis. We could demonstrate that these molecules inhibit integration, but also have a more potent, LEDGF-independent, antiretroviral effect during virion maturation, resulting in the production of non-infectious virions. Virions produced upon INLAI treatment have an eccentric morphology characterized by an encapsidation defect of the viral genome, and lead to an infection block at reverse transcription. Yet, we showed that these virions package a stable and functional viral genome, an active RT and the tRNALys3 primer for reverse transcription, and also keep their immunoreactivity towards B- and T-cell lymphocytes. When evaluating the influence of polymorphism at the edge of the binding site, we identified the IN Ala125 polymorphic variant which causes the concomitant loss of MUT-A effect on virion maturation and IN multimerization, whereas inhibition of integration and IN-LEDGF interaction are maintained. This proves that INLAIs exert their late stage effect through induction of IN multimerization. We could associate IN multimerization to INLAI-induced dimer destabilization by analyzing MUT-A co-structures with polymorphic integrases. Beside their therapeutic interest INLAIs are highly valuable reagents that allowed to demonstrate the essential role of integrase at three key steps of the HIV-1 replication cycle, reverse transcription, integration and virus maturation.

Le DEET (N, N-diéthyl-m-toluamide), est connu comme le répulsif le plus utilisé au monde. Bien qu'il soit efficace contre un large groupe d'arthropodes, son mode d'action exact et sa cible moléculaire ne sont pas encore connus précisément. Grâce à l'utilisation des techniques d'électrophysiologie (patch-clamp et oil-gap), d'imagerie calcique et biochimique, nous avons étudié le mode d'action du DEET sur des cellules neurosécrétrices identifiées, les DUM neurones de la blatte Periplaneta americana. Le DEET, à forte concentration, inhibe l'activité de l'acétylcholinestérase (AChE) au niveau du DUM neurone. A faible concentration, il induit une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire via l'activation des récepteurs cholinergiques de type muscariniques (mAChRs). Dans un deuxième temps, les interactions synergiques entre le DEET et le propoxur, un carbamate connu pour inhiber l'AChE, ont été étudiées. Les résultats ont révélé que les mAChRs, correspondent bien à une nouvelle cible potentielle pour le DEET et qu'ils sont impliqués dans l'effet synergique. Le DEET, à faible et à forte concentration, agit sur des sites allostériques positifs et négatifs des mAChRs respectivement. L'action du DEET sur le site allostérique positif des mAChRs est responsable de l'effet synergique via une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire qui potentialise l'effet anti-AChE du propoxur. L'utilisation d'outils pharmacologiques sélectifs a permis l'identification de la voie de signalisation intracellulaire (PLC, PI-PLC, CaMKinase II, récepteurs IP3) impliquée dans l'effet synergique du propoxur. Les résultats présentés dans ce mémoire vont contribuer au développement de nouvelles stratégies basées sur l'utilisation de combinaisons d'insecticides de familles chimiques différentes afin de réduire les doses des traitements tout en augmentant l'efficacité.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluRs) sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) modulant la transmission synaptique au sein du système nerveux central. D'un point de vue structural, ils ont la particularité de posséder un large domaine extracellulaire, le Venus Flytrap (VFT), où se lie leur ligand endogène, le glutamate. Leur domaine transmembranaire à 7 hélices, commun à tous les RCPGs, est connu pour être la cible d'une nouvelle classe de molécules à visée thérapeutique, les modulateurs allostériques. Au contraire, le VFT est le siège du développement de ligands compétitifs du glutamate et peu de choses sont connues quant à l'existence de modulateurs allostériques du VFT. Des études récentes ont mis en évidence une sensibilité des mGluRs aux ions extracellulaires et en particulier au chlore (Cl-), sans que son site de liaison ne soit identifié. Dans ce contexte, ce travail de thèse explore la possibilité d'une modulation allostérique endogène des mGluRs par les ions Cl-, en identifiant leur(s) site(s) de liaison(s) et leur effet sur la dynamique conformationnelle et la fonction des récepteurs. En combinant une approche pharmacologique, biophysique basée sur la technique de FRET, et la modélisation, nous avons tout d'abord confirmé que le Cl- potentialise l'action du glutamate sur tous les mGluRs et qu'il favorise la conformation active des récepteurs en se liant au niveau du VFT. Les mGluRs présentent également une sensibilité différente au Cl-, mGlu4 étant le plus sensible et mGlu2 le moins. Ceci s'explique notamment par le nombre de sites fonctionnels, tous les mGluRs dont mGlu4 possédant 2 sites par monomère à l'exception de mGlu2 qui n'en possède qu'un, en raison d'une mutation « clé » d'une sérine en aspartate dans le lobe 1 du VFT. D'autre part, le récepteur mGlu3 est apparu comme un cas particulier ayant une sensibilité accrue au Cl-, son domaine VFT cumulant la présence et l'orientation adéquate d'acides aminés formant un « verrou » Cl-, qui favorise de manière drastique la conformation active et une activité basale élevée de ce récepteur. Enfin, la modélisation de la variation de la concentration extracellulaire en Cl- lors d'une activité synaptique GABAergique est compatible avec une modulation des mGluRs les plus sensibles. En conclusion, le Cl- est un modulateur allostérique endogène des mGluRs et l'exploitation de ses sites de liaison au sein du VFT pourrait permettre le développement de nouveaux agents thérapeutiques. / Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are G coupled-protein receptors (GPCRs) playing key roles in synaptic transmission in the central nervous system. They display a large extracellular domain, the Venus Flytrap (VFT) where the endogenous ligand, glutamate, binds. Their 7 transmembrane helices spanning domain, common to all GPCRs, is known to be the target of new therapeutic compounds, called allosteric modulators. In contrast, VFT domain is used to develop glutamate competitive ligands and there are only few data about allosteric modulators targeting the VFT. Recent studies have shown mGluRs are sensitive to extracellular ions, particularly to chloride (Cl-), although its binding site has not been elucidated. This thesis work explores the possibility of an endogenous allosteric modulation of mGluRs by Cl-, aiming to delineate its binding site(s) and its effect on receptor conformational dynamics and function. Using pharmacological, FRET based biophysical approaches and modelling, we have first confirmed that Cl- potentiates glutamate action in all mGluRs and that this ion favors agonist induced active conformation by binding to the VFT. mGluRs are also differently sensitive to Cl-, mGlu4 being the most and mGlu2 the least. This difference is notably explained by the number of Cl- functional sites within the VFT, all mGluRs including mGlu4 displaying 2 sites per monomer whereas mGlu2 has only 1 site due to a serine-aspartate “key” mutation in VFT lobe 1. Besides, mGlu3 receptor appears to be a “special case”, as this receptor is highly sensitive to Cl- because its VFT domain is carrying amino acids creating a “Cl- lock”, which dramatically favors active conformation and a high level of basal activity. Finally, modelling of extracellular Cl- concentration variations in a GABAergic synapse is compatible with a modulation of the most sensitive mGluRs. In conclusion, Cl- is an endogenous allosteric modulator of mGluRs and exploiting its binding sites may yield to the development of innovative therapeutic tools.

Les prostaglandines modulent d’importants rôles physiologiques. Elles sont aussi impliquées dans le développement d’une variété de conditions pathologiques telles l’inflammation, la douleur et le cancer. La prostaglandine PGF2α et son récepteur (récepteur FP) se trouvent impliqué dans la modulation de nombreuses pathologies tels lors de l’accouchement préterme et le cancer colorectal. Récemment, nous avons fait partie d’un groupe de recherche ayant développé des modulateurs allostériques du récepteur FP. Dans une première étude, l’action du PGF2α sur le déclenchement des contractions myométriales a été évaluée, car peu d’information est connue sur la signalisation de cette prostaglandine lors de l’accouchement. Ainsi, nous avons utilisé un peptidomimétique de la deuxième boucle extracellulaire, dénommée PDC113.824. Nos résultats ont démontré que le PDC113.824 permettait de retarder la mise bas chez des souris gestantes, mais agissait de manière différente sur les multiples voies de signalisation de la PGF2α. Ainsi, le PDC113.824 inhibait la voie RhoA-ROCK, dépendante de l’activation de la protéine Gα12 par le. Les protéines RhoA-ROCK sont des acteurs clés dans le remodelage du cytosquelette d’actine et des contractions myométriales lors de l’accouchement. De plus, le PDC113.824 en présence de PGF2α agit comme un modulateur positif sur la voie dépendante de l’activation de la protéine Gαq. Le PDC113.824 serait donc un modulateur allostérique non compétitif possédant des actions à la fois de modulateurs positifs et négatifs sur la signalisation du récepteur FP Dans une seconde étude, des analogues du PDC113.824 ont été conçus et analysés dans un second modèle pathologique, le cancer colorectal. Ce cancer possède de hauts niveaux de récepteur FP. Nous avons donc étudié le rôle du récepteur FP dans le développement et la progression du cancer colorectal et l’effet de modulateurs allostériques. Il est généralement accepté que dans le cancer colorectal, la prostaglandine PGE2 permet la croissance et l’invasion tumorale, ainsi que l’angiogenèse. Toutefois, peu d’informations sont connues sur le rôle du PGF2α dans le cancer colorectal. C’est dans ce contexte que nous avons décidé d’examiner la contribution de ce récepteur dans la progression du cancer colorectal et cherché à déterminer si la modulation des fonctions du récepteur FP a un impact sur la croissance de tumeurs colorectales. Nos recherches ont révélé que l’activation du récepteur FP permet la migration et la prolifération de plusieurs lignées cellulaires humaines et murines d’adénocarcinomes colorectaux. Dans ce contexte, nos expériences ont démontré que la migration des cellules cancéreuses était dépendante de l’activation de la voie Rho. Nos résultats démontrent qu’en effet, l’activation de RhoA, une petite GTPase clé de la voie Gα12, est inhibée de façon sélective par nos composés. De plus, nos molécules allostériques sont également efficaces pour inhiber la voie de signalisation de la ß-caténine, une protéine impliquée dans la genèse du cancer colorectal. In vivo, le traitement de souris avec un des ces modulateurs a permis une inhibition effective de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent donc que les modulateurs allostériques des récepteurs FP pourraient constituer une nouvelle classe de médicaments utilisés pour le traitement du cancer colorectal. / Prostaglandins play many important physiological roles. They are also involved in the development of a variety of pathological conditions such as inflammation, pain and preterm labor. The prostaglandin PGF2α and the FP receptor are implicated in the modulation of many pathological diseases, for example in preterm labor and in colorectal cancer. Our group has recently developed FP receptor allosteric modulators and focused on the role of this receptor and its ligand PGF2α in different models. In a first study, the action of PGF2α on myometrial contraction was evaluated because there is little information about the pathway signalling regulating these contractions. We used a peptidomimectic whose structure is based on the second extracellular loop of the FP receptor and who is an inhibitor of parturition in mice, the PDC113.824. Our results have demonstrated that PDC113.824 is able to delay parturition in mice, affecting multiple pathways activated by the FP receptor and PGF2α. PDC113.824 inhibited the PGF2α mediated activation of the Gα12 dependent activation of the RhoA-ROCK signalling pathway. RhoA and ROCK proteins are keys actors in the remodelling of actin cytosqueleton and in myometrial contractions. Furthermore, PDC113.824 with the presence of PGF2α acted positively by increasing the activation of the Gαq pathway. Our finding suggests that PDC113.824 is an allosteric modulator with dual actions, acting in a positive and negative way on the FP receptor signalling. In a second study, analogues of PDC113.824 were made and analysed in a second pathological model, colorectal cancer development and progression. Colorectal cancer seems to posses high levels of FP receptor but it is generally accepted that PGE2 promotes tumor growth, invasion and angiogenesis. However, little is known about the effect of PGF2α in colorectal cancer and only one report has suggested that this prostaglandin can stimulate motility and invasion. Its in this context, whether modulation of FP receptor function can impact colorectal tumors growth remains to be defined. Using our allosteric modulator, we investigated the contribution of FP receptor in the malignant progression of colorectal cancer. Our findings indicate that activation of FP receptors promote migration and proliferation of different human and murine colorectal cell lines. In this context, we demonstrated that this migration was dependent upon the activation of the Rho signalling pathway. Our results indicate that the activation of RhoA, a key small GTPase of the Gα12/13 pathway, is selectively inhibited by our compounds. We also showed that our allosteric modulator could act negatively on the β-catenin pathway, which is a protein with multiple effects on the progression of colorectal cancer. In vivo, treatment of mice with one this allosteric modulator is effective in inhibiting colorectal tumor growth in a xenograph mouse model. Together these findings suggest that PGF2α and the receptor FP, may play a considerable role in the development and progression of colorectal cancer.