Las Amebas de Vida Libre (AVL) son protozoos anfizoicos de amplia distribución en la naturaleza. Cuatro géneros pertenecientes a este grupo han demostrado ser patógenos para el hombre y animales de experimentación: Naegleria, Balamuthia, Acanthamoeba y Sappinia. En particular, a Acanthamoeba se la considera una AVL “ubicuista”, ya que se la ha hallado en todos los ambientes y lugares donde se la ha investigado. El objetivo de esta tesis fue la búsqueda, aislamiento e identificación de AVL aguas. Los sitios de muestreo correspondieron a la Ciudad de Bahía Blanca y a otros sitios geográficos de la Republica Argentina. En Bahía Blanca se analizaron muestras de agua corriente y de tanques de reserva domiciliarios, de aguas recreacionales (piscinas cubiertas) y arroyos. Se tomaron muestras del Rio Sauce Grande en la localidad bonaerense de Sierra de la Ventana. Se muestrearon aguas de consumo y recreación de la Localidad de Sarmiento, provincia del Chubut. Se analizaron muestras de diversas fuentes en distintas provincias de la Republica Argentina. En total se procesaron 274 muestras de aguas de diferentes fuentes y localizaciones. Las muestras fueron clasificadas en aguas tratadas (cloradas u otro tratamiento: tanques, grifos, piscinas, etc) y naturales (de ríos, lagos, canales, arroyos, etc.). Dentro de esta clasificación solo el 30% de las aguas tratadas analizadas fueron positivas para el aislamiento de AVL, mientras que dentro de las aguas naturales se obtuvo un 92,6% de positividad en los cultivos. Del total de estos aislamientos, el 98,7% correspondió al género Acanthamoeba, tanto por clasificación morfológica como por métodos moleculares; mientras que 1,3% restante correspondió a una cepa que denominamos “No A, no N”, sin ubicación genérica determinada y de cuyo análisis ultraestructural se desprendió la existencia de endosimbiontes compatibles con partículas virales. Se analizaron también muestras clínicas procedentes de 4 posibles casos de queratitis amebiana humana, resultando 2 de ellos positivos para AVL, y que correspondieron al género Acanthamoeba. Se investigó la presencia de AVL en líquidos comerciales para lentes de contacto, y en diversas muestras biológicas procedentes de un hospital de Bahía Blanca. En ambos tipos de muestras los aislamientos resultaron negativos. En todas las cepas aisladas se realizaron análisis morfométricos, ultraestructurales y moleculares, tendientes a caracterizar los aislamientos y confirmar su ubicación genérica. Además se realizaron pruebas de resistencia a diferentes desinfectantes. Nuestros resultados refuerzan la adjetivación de “ubicuista” para las AVL del género Acanthamoeba, ya que fueron demostradas en todos la ambientes estudiados. Su amplia distribución, el hallazgo en aguas recreacionales y de consumo y su participación como agentes etiológicos de enfermedad humana, refuerzan la necesidad de implementar medidas de control y prevención, así como su consideración por parte del personal de salud al momento de realizar un diagnostico clínico e instaurar un tratamiento específico. / The free-living amoebae (FLA) are amphizoic protozoa widely distributed in nature. Four genera belonging to this group have proved to be pathogenic to humans and experimental animals: Naegleria, Balamuthia, Acanthamoeba and Sappinia. In particular, Acanthamoeba is considered an FLA "ubiquitous" since it has been found in all environments and places where it has been investigated. The aim of this thesis was the search, isolation and identification of FLA in the waters. Sampling sites were for the city of Bahia Blanca and other geographical sites of Argentina. In Bahia Blanca samples of tap water tanks and household reserves, recreational water (indoor) and streams they were analyzed. Sauce Grande River samples were taken in the locality of Sierra de la Ventana. Drinking water and recreation of the town of Sarmiento, Chubut province were sampled. Samples from different sources in different provinces of Argentina were analyzed. In total 274 samples of water from different sources and locations were processed. The samples were placed in treated water (chlorinated or other treatment tanks, faucets, pools, etc.) and natural (rivers, lakes, canals, streams, etc.). Within this classification, only 30% of treated water tested positive for isolation of FLA, while natural waters within 92.6% positivity in the cultures was obtained. Of all the isolates, 98.7% were Acanthamoeba, both morphological classification by molecular methods; while remaining 1.3% corresponded to a strain called "non-A, non-N" without certain generic location and ultrastructural analysis which came off the existence of endosymbionts compatible with viral particles. Clinical samples from 4 possible human cases of amoebic keratitis were also analyzed, resulting in 2 of them positive for AVL, which corresponded to Acanthamoeba. FLA's presence in commercial liquid for contact lenses, and various biological samples from a hospital in Bahia Blanca was investigated. In both types of samples were negative isolates. Morphometric, ultrastructural and molecular, aimed to characterize the isolates and confirm your generic location analyzes were performed on all isolates. Additionally stress tests were conducted at different disinfectants. Our results reinforce the adjectives of "ubiquitous" for AVL, especially Acanthamoeba, as were demonstrated in all the studied environments. Its wide distribution, the finding in recreational waters and drinkig waters, and their participation as etiologic agents of human disease, reinforcing the need to implement prevention and control measures, as well as consideration by health personnel when making a clinical diagnosis and establish specific treatment.

Se estudió la presencia de Amebas de Vida Libre (AVL) (Acanthamoeba spp. y Naegleria spp.), y bacterias del orden Chlamydiales como agentes infecciosos en bovinos de la provincia de La Pampa, Argentina. Se obtuvo desarrollo de AVL en el 83,07 % de las muestras de agua destinada a consumo bovino (N=65). Se identificó por cultivo y técnicas moleculares la presencia de Acanthamoeba spp. en el 24,07 %. Se identificaron los genotipos T4, T5 y T15 del género Acanthamoeba. No se encontró asociación entre queratitis con la presencia de AVL. No se detectaron AVL del género Naegleria. Se estudiaron 709 muestras bovinas, para detectar la presencia de bacterias del orden Chlamydiales, y 656 sueros bovinos para estimar la prevalencia de infección por estas bacterias. Se detectó ADN de familia Chlamydiaceae en el 4,78 % de las muestras de órganos parafinados provenientes de pérdidas reproductivas y de Chlamydia abortus en el 1,99 % (N=251). Se determinó una prevalencia de anticuerpos séricos contra Chlamydia abortus del 25,00 % sobre 128 lotes bovinos, con una seroprevalencia individual (N=656) del 8,07 %. No se encontraron diferencias significativas entre categoría. Se detectó un 6 % de ADN del orden Chlamydiales y 2 % de la familia Chlamydiaceae sobre 50 muestras oculares de terneros estudiadas. Se identificó por secuenciación la presencia de Uncultured Chlamydiales. Se detectó ADN del orden Chlamydiales en el 30,76 % de las 104 muestras de cérvix estudiadas y el 3,84 % correspondió a la familia Chlamydiaceae. No se encontraron diferencias significativas entre las prevalencias de hembras con y sin problemas reproductivos a nivel de orden, pero si a nivel de familia. Se detectó en un 8% (1 muestra) de lavado de útero de vacas donadoras de embriones, ADN a nivel de orden Chlamydiales y de familia Chlamydiaceae sobre 12 muestras estudiadas. Se detectó ADN del orden Chlamydiales en el 30,00 % de las muestras de semen de toros de cabañas estudiadas y de familia Chlamydiaceae en el 6,00 % (N=50). Se detectó ADN del orden Chlamydiales en el 23,33% de las muestras de esmegma prepucial de toros provenientes de cabañas y servicio natural estudiadas (N=150). La familia Chlamydiaceae fue identificada en el 4,66% de ellas. Se encontraron diferencias significativas entre toros en servicio natural y de cabaña solo a nivel de orden. Se detectó ADN del orden Chlamydiales en el 4,76% de muestras de órganos formolados de fetos abortados y ADN de la familia Chlamydiaceae en el 2,38% de ellas (N=42). Se detectó en 50 muestras de órganos de fetos no abortados ADN del orden Chlamydiales en el 20,00 % y 10,00 % de la familia Chlamydiaceae. Se identificó por secuenciación la presencia de una clamidia ambiental (Neochlamydia spp.) en un cultivo de Acanthamoeba spp. (genotipo T5), probablemente como endosimbionte. Los resultados obtenidos indican la necesidad de profundizar el estudio de las AVL y las clamidias en ambientes ganaderos como agentes infecciosos con potenciales características zoonóticas. / The aim of this study was to evaluate the presence of free-living amoebae (FLA) (Acanthamoeba spp. and Naegleria spp.) and bacteria of the order Chlamydiales as infectious agents in cattle in the province of La Pampa, Argentina. FLA was isolated from 83.07% of the watering trough samples. The identification by Polymerase chain reaction was performed with genus-specific primers and followed by direct sequencing. The sequencing revealed the presence of genotypes T4, T5, and T15 of the genus Acanthamoeba in the samples studied. No association was found between keratitis and the presence of FLA. No FLA of the genus Naegleria was detected. A total of 709 bovine samples collected from paraffined organs of reproductive loss, eye, cervix, washing of uterus from cow donating embryos, semen, preputial smegma, formalin-fixed organs from aborted fetuses and organs from unborn were studied to detect the presence of bacteria of the order Chlamydiales.To assess the prevalence of infection by these bacteria serum samples from 656 cattle were analyzed for the presence of specific IgG antibodies. DNA of the family Chlamydiaceae was detected in 4.78 % of sample paraffin organs proceeding of reproductive loss and Chlamydia abortus in 1.99 % (N=251). Antibodies to Chlamydia abortus were found in 8.07% sera based on ELISA result (N= 656). The overall herd prevalence of anti-Chlamydia abortus antibodies in 128 bovine lots was 25.00%. No significant differences were found between categories. Six percent of DNA bacteria of the order Chlamydiales and 2 % of the family Chlamydiaceae were detected on 50 eye samples of calves studied. The presence of Uncultured Chlamydiales was identified by sequencing. DNA of the order Chlamydiales and the family Chlamydiaceae was detected in 30.76% and 3.84 % of the cervix samples studied (N=104). No significant differences were detected between the prevalence of females with and without reproductive problems at the order level, but yes at the family level. One of 12 samples (8.00%) of washing of uterus of cow donating embryos, DNA was detected at order and family level. DNA of the order Chlamydiales and the family Chlamydiaceae was detected in 30.00% and in 6.00% of the semen samples studied (N=50). The order Chlamydiales DNA was detected in 23.33% of the preputial smegma sample of bulls from breeders and natural service studied (N=150). DNA of the family Chlamydiaceae was identified in 4.66% of them. Significant differences were found between bulls in natural service and breeders only at the order level. DNA of the order Chlamydiales and the family Chlamydiaceae was detected in 4.76 % and 2.38 % of formalin-fixed organ samples of aborted fetuses (N=42). In unborn organ samples, DNA of the order Chlamydiales was detected in 20.00 %. The family Chlamydiaceae DNA was detected in 10% (N=50). The presence of Chlamydia-like organism in an Acanthamoeba spp. (genotype T5) was identified by sequencing, probably as an endosymbiont. The results obtained indicate the need to carry out more studies of FLA and chlamydia in cattle ranch environments as infectious agents with potential zoonotic characteristics.

En esta Tesis se estudia el posible papel de las FLA como reservorio de H. pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares. En primer lugar se realizó un ensayo de cocultivo entre la bacteria H. pylori y la ameba Acanthamoeba castellanii. Se comprobó, mediante técnicas moleculares específicas para la detección de células viables, PMA-qPCR y DVC-FISH, que la ameba es capaz de internalizar a la bacteria y que esta última permanece viable, demostrando que H. pylori se comporta como una bacteria ARB. Seguidamente, se analizaron un total de 120 muestras ambientales, 100 de agua y 20 de vegetales para comprobar la presencia, tanto de FLA como de H. pylori internalizado en estas FLA. En el caso de las muestras de agua, se analizaron 69 muestras de agua residual y 31 de agua potable. Un total de 55 (79,7%) muestras de agua residual y 12 (38,7%) de agua potable resultaron positivas para la presencia de FLA. Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA presentes en 28 (50,9%) y 11 (91,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Mediante DVC-FISH se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA presentes en las muestras eran viables en 16 (29,5%) y 5 (41,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Además, se consiguió recuperar formas viables cultivables de H. pylori procedente del interior de FLA en 10 (18,2%) de las muestras de agua residual analizadas. Las FLA aisladas e identificadas en las aguas residuales pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae y a la familia Vahlkampfiidae. En el caso del agua potable, las FLA aisladas e identificadas pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Echinamoeba y Vermamoeba. En el caso de las muestras de vegetales, concretamente lechugas, todas ellas resultaron positivas para el aislamiento de FLA (100%). Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA en 11 (55,0%) de las muestras y, mediante DVC-FISH, se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA eran viables en 5 (25,0%) de las muestras. En este caso no se recuperaron formas viables cultivables de la bacteria. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de las FLA presentes en 20 de las muestras analizadas en esta Tesis (11 de agua residual, 3 de agua potable y 6 de lechugas). Para ello, se eligieron los iniciadores, se evaluaron in silico e in vitro y, una vez comprobada su idoneidad, se emplearon para la secuenciación de las muestras. En los tres tipos de muestras, la clase bacteriana más abundante fue la Gammaproteobacteria. Para los tres tipos de muestras, los filos más abundantes de las bacterias del microbioma de las FLA fueron Proteobacteria y Bacteroidetes y, en el caso del agua residual, también lo fue el filo Planctomycetes. H. pylori se detectó mediante esta técnica en los tres tipos de muestra. Además, como parte del microbioma de FLA de muestras ambientales, se detectaron otras bacterias de interés para la salud pública, tales como Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran la presencia de FLA patógenas en las muestras ambientales, así como el hecho de que, en algunos casos, estas son transportadoras de bacterias patógenas. Este trabajo también confirma que H. pylori se comporta como una bacteria ARB y que se encuentra viable en el interior de FLA presentes, tanto en aguas residuales y potables como en vegetales. De esta forma, se postula que un modo de transmisión de esta bacteria podría ser a través de las FLA presentes en agua o vegetales. / In this Thesis, the possible role of FLA is studied as a reservoir of H. pylori and other pathogenic bacteria in waters and food by means of molecular techniques. Firstly, a coculture assay between the bacterium H. pylori and the amoeba Acanthamoeba castellanii was carried out. It was verified by means of molecular techniques specific for the detection of viable cells, PMA-qPCR and DVC-FISH, that the amoeba is capable of internalizing the bacterium and that the latter remains viable, demonstrating that H. pylori behaves as an ARB bacterium. Afterwards, a total of 120 environmental samples, 100 of water and 20 of vegetables, were analyzed to verify the presence FLA as well as internalized H. pylori into these FLA. In case of water samples, 69 samples of wastewater and 31 samples of drinking water were analyzed. A total of 55 (79,7 %) wastewater and 12 (38,7 %) of drinking water samples turned out to be positive for FLA's presence. By means of PMA-qPCR technique, the presence of FLA-internalized H. pylori was demonstrated in 28 (50,9 %) and 11 (91,7 %) of the wastewater and drinking water samples analyzed, respectively. By means of DVC-FISH it was demonstrated that the FLA-internalized H. pylori cells were viable in 16 (29,5 %) and 5 (41,7 %) of the wastewater and drinking water samples analyzed, respectively. In addition, viable cultivable forms of H. pylori coming from the inside of FLA were recovered from 10 (18,2 %) of the analyzed wastewater samples. The isolated and identified FLA from wastewater samples belonged to the genus Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae and to the family Vahlkampfiidae. In the case of drinking wáter, the isolated and identified FLA belonged to the genus Acanthamoeba, Echinamoeba and Vermamoeba. In the case of the vegetable samples, specifically lettuces, all of them turned out to be positive for FLA's isolation (100 %). By means of the PMA-qPCR technique, the presence of FLA-internalized H. pylori was demonstrated in 11 (55,0 %) of the samples and, by means of DVC-FISH, it was demonstrated that FLA-internalized H. pylori cells were viable in 5 (25,0 %) of the samples. In this case, viable cultivable forms of the bacterium could not be recovered. Finally, by means of amplicon-based metagenomics, the FLA microbiome of 20 previously analyzed samples in this Thesis (11 wastewater, 3 drinking water and 6 lettuce samples) was analyzed. To do so, a pair of primers were selected and evaluated in silco and in vitro and, once checked its suitability, they were used to perform the samples' sequencing. In the three types of samples, the most abundant bacterial class was the Gammaproteobacteria. For the three types of samples, the most abundant bacterial phylum of the FLA microbiome were Proteobacteria and Bacteroidetes and, in case of the wastewater, it was also the phylum Planctomycetes. H. pylori was detected by means of this technology in the three types of samples. In addition, as part of FLA's microbiome of environmental samples, other bacteria of public health interest were detected, such as Aeromonas, Legionella, Mycobacterium or Pseudomonas. The results obtained in this Thesis demonstrate the presence of pathogenic FLA in the environmental samples, as well as the fact that, in some cases, these they are carriers of pathogenic bacteria. This work also confirms that H. pylori behaves as an ARB bacterium and that it is viable inside the present FLA in wastewater as well as in drinking water and in vegetables. This way, it is postulated that a way of transmission of this bacterium might be through the FLA present in water or vegetables. / En esta Tesi s'estudia el possible paper de les FLA com a reservori de H. pylori i altres bacteris patògens en aigües i aliments per mitjà de tècniques moleculars. En primer lloc es va realitzar un assaig de cocultiu entre el bacteri H. pylori i l'ameba Acanthamoeba castellanii. Es va comprovar per mitjà de tècniques moleculars específiques per a la detecció de cèl¿lules viables, PMA-qPCR i DVC-FISH, que l'ameba és capaç d'internalizar al bacteri i que esta última roman viable, demostrant que H. pylori es comporta com un bacteri ARB. A continuació, es van analitzar un total de 120 mostres ambientals, 100 d'aigua i 20 de vegetals per a comprovar la presència tant de FLA com de H. pylori internalitzat en estes FLA. En el cas de les mostres d'aigua, es van analitzar 69 mostres d'aigua residual i 31 d'aigua potable. Un total de 55 (79,7%) mostres d'aigua residual i 12 (38,7%) d'aigua potable van resultar positives per a la presència de FLA. Per mitjà de la tècnica PMA-qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori internalitzat en les FLA presents en 28 (50,9%) i 11 (91,7%) de les mostres d'aigua residual i potable analitzades, respectivament. Per mitjà de DVC-FISH es va demostrar que les cèl¿lules d'H. pylori internalitzades dins les FLA presents en les mostres eren viables en 16 (29,5%) i 5 (41,7%) de les mostres d'aigua residual i potable analitzades, respectivament. A més, es va aconseguir recuperar formes viables cultivables d'H. pylori procedent de l'interior de FLA en 10 (18,2%) de les mostres d'aigua residual analitzades. Les FLA aïllades i identificades en les aigües residuals van pertànyer als gèneres Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae i a la família Vahlkampfiidae. En el cas de l'aigua potable, les FLA aïllades i identificades van pertànyer als gèneres Acanthamoeba, Echinamoeba i Vermamoeba. En el cas de les mostres de vegetals, concretament encisams, totes elles van resultar positives per a l'aïllament de FLA (100%). Per mitjà de la tècnica PMA-qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori internalitzat en les FLA en 11 (55,0%) de les mostres i, per mitjà de DVC-FISH, es va demostrar que les cèl¿lules d'H. pylori internalitzades dins les FLA eren viables en 5 (25,0%) de les mostres. En este cas no es van recuperar formes viables cultivables del bacteri. Finalment, per mitjà de metagenómica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de les FLA presents en 20 de les mostres analitzades en esta Tesi (11 d'aigua residual, 3 d'aigua potable i 6 d'encisams). Per tal de fer això, es van triar els iniciadors, es van avaluar in silico i in vitro i, una vegada comprovada la seua idoneïtat, es van emprar per a la seqüenciació de les mostres. En els tres tipus de mostres, la classe bacteriana més abundant va ser la Gammaproteobacteria. Per als tres tipus de mostres, els filos més abundants dels bacteris del microbioma de les FLA van ser Proteobacteria i Bacteroidetes i, en el cas de l'aigua residual, també ho va ser el filo Planctomycetes. H. pylori es va detectar per mitjà d'esta tècnica en els tres tipus de mostra. A més, com a part del microbioma de FLA de mostres ambientals, es van detectar altres bacteris d'interés per a la salut pública, com ara Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Els resultats obtinguts en esta Tesi demostren la presència de FLA patògenes en les mostres ambientals, així com el fet de que, en alguns casos, estes són transportadores de bacteris patògens. Este treball també confirma que H. pylori es comporta com un bacteri ARB i que es troba viable en l'interior de FLA presents, tant en aigües residuals i potables com en vegetals. D'esta manera, es postula que una manera de transmissió d'este bacteri podria ser a través de les FLA presents en aigua o vegetals. / Moreno Mesonero, L. (2018). Estudio del papel de las amebas de vida libre como reservorio de Helicobacter pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111952