Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Hemisynthèse stéréosélective d’acides aminés hétérosubstitués sur la chaîne latérale.Applications au radio-fluoromarquage pour l’imagerie de peptides.Ce travail de thèse, qui a été réalisé à l’Institut de Chimie Moléculaire de l’Université de Bourgogne et en collaboration avec l’Institut de Neuroscience Cognitives et Intégrative d’Aquitaine, porte sur la mise au point de nouvelles méthodes de synthèse d’acides aminés hétérosubstitués sur la chaine latérale par des groupements phosphorés ou silylés, ainsi que sur leurs applications. Dans une première partie, la synthèse d’acides aminés silylés sur la chaine latérale est réalisée sans racémisation par réaction de Wittig entre un sel de phosphonium, dérivé d’acide L-aspartique, avec un aldéhyde aromatique porteur du groupement silylé. Ces acides aminés ont été utilisés en synthèse peptidique pour donner des di- et tripeptides silylés par réaction avec des dérivés d’alanine et de phénylalanine. Il a été montré que les acides aminés et peptides silylés pouvaient être fluorés par réaction avec des fluorures, et que dans le cas de dérivés di-t-butylsilylés, les composés fluorés obtenus se révèlent d’une très grande stabilité à pH physiologique. L’étude de la fluoration des peptides di-t-butylsilylés par K18F/K222 a permis d’obtenir les dérivés radiomarqués avec des rendements radiochimiques et des activités molaires atteignant respectivement 39% et 410 GBq.mmol-1. Dans la seconde partie, la synthèse d’acides aminés et peptides hétérosubstitués ou fonctionnalisés sur la chaine latérale, a été mise au point. Le principe de cette synthèse repose sur une cycloaddition [3+2] entre un acide aminé porteur d’un groupement azido avec un alcyne disubstitué. Alors que la réaction par catalyse avec un sel de cuivre ou un complexe de ruthénium ne conduit pas aux produits recherchés, la cycloaddition a été mise au point sous microondes en utilisant le glycérol comme solvant. Dans ces conditions, 13 nouveaux acides aminés porteurs d’un noyau triazole en position γ, et des substituants silylés, phosphorés, amines, amides …ont été préparés sans racémisation et ce avec des rendements atteignant 89%. Les méthodologies mises au point dans ce travail de thèse offrent de nouvelles voies pour la synthèse de dérivés acides aminés silylés ou phosphorés utiles pour la chimie de coordination, la catalyse asymétrique et pour le radiomarquage par les ions fluorure 18F-.Mots clés : Phosphoniums, acides aminés, silanes ; [18F]-radiofluoration, triazoles. / Stereoselective hemisynthesis of lateral chain heterosubstituted aminoacids.Applications on radiofluorolabeling for peptide imaging.This thesis work, which was carried out at the Institute of Molecular Chemistry of the University of Burgundy and in collaboration with the Institute of Cognitive and Integrative Neurosciences of Aquitaine, focuses on the development of new methods for the synthesis of side chain heterosubstituted amino acids including phosphine containing or silyl groups, as well as on their applications. In a first part, the synthesis of side chain silylated amino acids is achieved without racemization using a key Wittig reaction between a phosphonium salt, derived from L-aspartic acid, and an aromatic aldehyde bearing the silyl group. These aminoacids have been used in peptide synthesis to give silylated di- and tripeptides by reaction with alanine and phenylalanine derivatives. It has been shown that the silylated aminoacids and peptides can be fluorinated by reaction with fluorides, and that in the case of di-t-butylsilyl derivatives, the fluorinated compounds obtained are found to be very stable at physiological pH. The study of the fluorination of di-t-butylsilyl peptides by K18F / K222 allowed to obtain radiolabelled derivatives with radiochemical yields and molar activities reaching 39% and 410 GBq.mol-1, respectively. In the second part, the synthesis of aminoacids and peptides heterosubstituted or functionalized on the side chain, was developed. The principle of this synthesis is based on a [3 + 2] cycloaddition between an aminoacid bearing an azido group with disubstituted alkyne. While the reaction catalyzed using a copper salt or a ruthenium complex does not lead to the desired products, the cycloaddition was developed under microwave irradiation using glycerol as a solvent. Under these conditions, 13 new amino acids carrying a triazole ring at the γ position, and bearing silyles, phosphines, amines, amides.. substituents were prepared without racemization and with yields up to 89%. The methodologies developed in this thesis offer new efficient ways for the synthesis of silyl or phosphorus amino acid derivatives, useful for coordination chemistry, asymmetric catalysis and radiolabeling by the fluoride ion18F-.Key words: Phosphoniums, aminoacids, silanes, [18F]-radiofluorination, triazoles

En milieu marin, toute surface immergée est soumise à une colonisation par de nombreux organismes (biofouling). Le développement de biofilms est une étape clé du phénomène. Les systèmes de communication y sont contrôlés par le biais de signaux chimiques. Dans ce travail, l’étude de la signature métabolique de biofilms naturels formé in situ a été réalisée selon un gradient de pollution en contaminants métalliques dans la rade de Toulon et selon la nature du revêtement de la surface immergée. De nettes variations chimiques des biofilms prélevés sont observées et sont corrélées avec des variations en termes de communauté microbiennes. L’étude in vitro de 4 souches bactériennes issues de biofilms naturels a permis, après optimisation des méthodologies d’analyse, une discrimination selon leur profil métabolique. Des biomarqueurs ont été mis en évidence, avec notamment la production de lipides ornithine par la souche Pseudoalteromonas lipolytica. La réponse biologique de cette souche en fonction de son phénotype et face à un stress cuprique a été étudiée par métabolomique et protéomique révélant d’importantes modulations de certaines voies biosynthétiques. / In the marine environment, any immersed surface is subjected to colonization by many organisms (biofouling). The biofilms development is a key stage of this phenomenon. Communication systems are controlled in these structures by chemical signals. In this work, the study of the chemical signature of natural biofilms formed in situ was carried out among a gradient of contamination of metal contaminants in the bay of Toulon and according to the nature of the coating on the immersed surface. Clear chemical variations of the biofilms collected were observed and were correlated with variations in microbial community. The in vitro study of 4 bacterial strains harvested from natural biofilms allowed, after optimization of the analysis methodologies, their discrimination according to their metabolic profile. Biomarkers were highlited, particularly ornithine lipids production by the Pseudoalteromonas lipolytica strain. The biological response of this strain depending on its phenotype and face to copper stres was studied by metabolomics and proteomics revealing important modulations of certain biosynthetic patways.

Au cours de ce travail, la génération de second harmonique optique des molécules biologiques a été étudiée. Cette technique optique non linéaire possède un caractère cohérent qui permet d'accéder aux propriétés de symétrie des molécules dont la taille est très inférieure aux longueurs d'onde optiques visibles utilisées et l'hyperpolarisabilité quadratique des acides aminés aromatiques a été mesurée en solution par diffusion non linéaire. L'hyperpolarisabilité des acides aminés non aromatiques a été obtenue de manière indirecte grâce à des mesures effectuées sur le collagène, une protéine ne contenant pas d'acide aminé aromatique. Le collagène possède en fait une très forte réponse non linéaire et fait l'objet d'études intenses en microscopie optique non linéaire. Par un modèle de sommation cohérente des champs harmoniques réémis, l'origine de la très forte efficacité non linéaire de cette protéine, liée à sa grande rigidité et à son organisation spatiale en triple hélice, a pu être obtenue. En parallèle, l'étude de plusieurs petits peptides synthétiques possédant de un à quatre tryptophanes a permis de comprendre la construction de la réponse optique non linéaire de ces objets à partir de motifs répétés. Par ailleurs, pour apporter des informations supplémentaires sur les nano systèmes, un nouveau montage expérimental a été développé. La grande sensibilité du montage a permis notamment d'atteindre la sensibilité d'une seule particule dans le volume sondé et de mettre en place un système de cartographie en trois dimensions par diffusion Hyper Rayleigh. La démonstration a été réalisée pour des nanoparticules métalliques uniques d'argent piégées dans une matrice de gélatine.

La qualité nutritionnelle des protéines alimentaires dépend de deux paramètres clés : la digestibilité iléale vraie et l'utilisation métabolique des acides aminés (AA) absorbés. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer l'influence de deux facteurs alimentaires (facteurs antinutritionnels et peptides) sur les flux iléaux de protéines endogènes; de valider la technique d'intubation utilisée chez l'homme pour prélever des effluents iléaux; de comparer le métabolisme postprandial d'AA alimentaires suivant leur forme d'ingestion; d'évaluer la validité du modèle porc pour prédire la digestibilité protéique chez l'homme. Les investigations se sont déroulées chez le rat, le porc et l'homme. Les effluents iléaux étaient collectés chez le rat après euthanasie, chez le porc vivant équipé d'une canule en aval de la valve iléo-caecal et chez l'homme conscient équipé d'une sonde naso-iléale. L'azote (N) et les AA endogènes iléaux étaient déterminés suite à un repas protéiprive (PP), un repas contenant de la caséine, intacte (C) ou hydrolysée (HC), marquée avec l'isotope stable 15N ou un repas à base d'AA libres (A) mimant la composition de la caséine et privé de certains AA non essentiels afin de mesurer directement leur flux endogènes. De plus, la centrifugation et ultrafiltration des effluents HC permettaient de déterminer les protéines endogènes iléales et le recyclage d'N alimentaire (15N). Les facteurs antinutritionnels issus d'un extrait brut de haricots (Phaseolus vulgaris), ingérés au niveau habituel de consommation chez l'homme, augmentaient les flux iléaux de protéines endogènes (rat, repas PP). Après adaptation au repas, le bilan azoté corporel per se n'avait pas d'influence sur les flux iléaux de protéines endogènes (rat, repas PF et A) mais les peptides alimentaires (repas HC) augmentaient les flux iléaux d'AA et N endogènes par rapport au repas PP. Les peptides alimentaires (HC), comparés aux peptides libérés naturellement dans l'intestin au cours de la digestion (C), n'augmentaient pas les flux iléaux de protéines endogènes (rat, porc, homme). Le recyclage d'N alimentaire dans les protéines endogènes était maximal chez le rat nourri en continu, plus faible chez le porc nourri en aigu et minimum chez l'homme nourri en aigu (respectivement : 65, 21 et 11%). Par ailleurs, ces recherches ont montré que l'intubation naso-iléale utilisée pour prélever des effluents iléaux chez l'homme était une méthode juste et que le porc était un modèle valide pour prédire la digestibilité iléale vraie chez l'homme. Enfin, la forme d'ingestion des AA alimentaires (HC ou C) influençaient le devenir métabolique des AA alimentaires, en particulier par rapport aux cinétiques de catabolisme des AA. Cependant, la valeur nutritionnelle était, au final, similaire pour HC et C.

Le virus de l'immunodéficience bovine (VIB) est un rétrovirus qui partage des propriétés similaires avec les autres lentivirus, dont le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). L'expression des gènes lentiviraux dépend des protéines régulatrices virales Tat et Rev qui interviennent, dans le cycle de réplication virale, aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel, respectivement. Les longues répétitions terminales (LTR) du génome viral fournissent, quant à elles, les signaux d'initiation, d'amplification et de terminaison de la transcription. La protéine Tat, pour exercer son activité transactivatrice, interagit avec une séquence d'ARN appelée TAR ("transactivaton response element") présente sur tous les transcrits viraux. Tat recrute le facteur positif de l'élongation de la transcription b (pTEFb) au niveau du promoteur viral des LTR pour augmenter l'efficacité de transcription de l'ARN polymérase II. La protéine nucléaire Rev est impliquée dans le transport nucléo-cytoplasmique des ARN viraux mono- et non épissés. Récemment, une protéine hybride Tat/Rev constituée de 236 acides aminés (Tat 236) a été découverte à partir de virions isolés de la rate de lapins qui avaient été infectés trois ans auparavant, suggérant une évolution temporelle du virus in vivo. L'objectif de ce travail était de déterminer si des variations génétiques et/ou fonctionnelles pouvaient se retrouver dans d'autres parties du génome du variant du VIB impliquées dans la régulation de l'expression génique virale, notamment au niveau du LTR et du gène accessoire rev du VIB. Ainsi, en utilisant la technique d'amplification en chaîne des gènes (PCR), une séquence LTR mutante (LTRm) fut mise en évidence, démontrant la présence de trois mutations aux positions 191, 250 et 271 lorsque comparée à celle du LTR pré-infection obtenue du génome des virus ayant servi à l'infection des lapins. La séquence du LTR pré-infection était 100% identique à celle du LTR sauvage (LTRs) retrouvée dans la littérature. En utilisant un test de transactivation CAT in vitro avec la protéine Tat103 comme agent transactivateur, le LTRm démontra une activité promotrice d'au moins deux fois supérieure à celle obtenue avec le LTRs. Pour tenter d'associer ces mutations au nouveau caractère phénotypique de LTRm, des mutants de restauration furent développés par PCR-mutagenèse pour revenir au phénotype LTRs. L'ensemble des résultats obtenus suggère que les mutations en positions 250 et 271 seraient impliquées dans l'activité promotrice augmentée de LTRm. Finalement, l'analyse de séquences du gène rev pré- et post- infection a montré deux mutations aux positions 48 (Val → Ile) et 76 (Pro → Leu), la dernière étant localisée dans un domaine riche en arginine. Fait intéressant, la mutation à la position 76 avait aussi été rapportée auparavant dans la portion Rev de Tat236. Les résultats obtenus suggèrent une évolution temporelle du VIB dans le cours d'infections in vivo au niveau du LTR et du gène rev, similaire à celle antérieurement décrite pour le gène tat. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lentivirus, région du LTR, gène rev, diversité génétique

Les mécanismes de complexation et d'accumulation des radionucléides au niveau cellulaire et moléculaire sont complexes et mal connus car les études sur ces sujets sont peu nombreuses. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié les interactions de l'europium (analogue des actinides trivalents) et d'un actinide : l'uranium (VI), avec des molécules biologiques d'intérêt : les phytochélatines. Leur rôle est de protéger les cellules contre les intrusions de métaux lourds non essentiels (donc toxiques). Ces protéines sont donc susceptibles d'être impliquées dans les mécanismes de séquestration des radionucléides chez le vivant. Elles ont toutefois une structure complexe, c'est pourquoi, afin de mieux comprendre leur réactivité, nous avons étendu nos études aux sous entités qui les constituent (acides aminés et glutathion). <br />Nous avons en particulier déterminé la spéciation en solution (stoechiométrie, structure) ainsi que les constantes d'équilibre associées à la formation de ces espèces. Ces études ont été menées par Spectrofluorimétrie Laser à Résolution Temporelle (SLRT), ElectroSpray-Spectrométrie de Masse (ES-SM), Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), spectroscopie Infra-Rouge à Transformée de Fourier (IRTF) et Spectroscopie d'Absorption X (EXAFS). La détermination des constantes d'équilibre nous a permis de conclure que le pouvoir complexant de ces molécules vis-à-vis des radionucléides était modéré (log10K1 < 3, à pH 3 ou 6), les espèces formées sont mononucléaires avec une seule molécule de ligand (1:1). L'interaction se fait via les groupements durs (oxygénés). La complexation directe de l'europium par des molécules de phytochélatines à pH acide a été étudiée conjointement par SLRT et ES-SM. Le pouvoir complexant de ces molécules est bien supérieur à celui du GSH dont elles sont pourtant issues. Outre les travaux menés sur des solutions synthétiques reproduisant les conditions « biologiques » (pH proche de la neutralité, force ionique 0,1 mol/L, etc.), des tests de contamination cellulaire ont été réalisés. La quantification de l'europium intégré a montré que celles-ci sont capables d'incorporer significativement l'europium.