Le traitement de lanémie par érythropoïétine humaine recombinante est efficace et entraîne une amélioration de la survie et de la qualité de vie et une diminution du risque de complications cardio-vasculaires chez les patients insuffisants rénaux chroniques et dialysés. Lefficacité de ce traitement dépend toutefois principalement dune fourniture adéquate de fer à la moelle érythropoïétique. Chez les sujets sains, chez qui les besoins en fer sont moindres que dans linsuffisance rénale, la nécessité dune supplémentation martiale a été démontrée dans la stimulation érythropoïétique. Lors de stimulations érythropoïétiques importantes, comme celles créées par le don de sang autologue dans les programmes dautotransfusion supporté par rHuEPO, la disponibilité du fer peut également limiter lérythropoïèse. En labsence de supplémentation martiale, le succès de tels programmes est conditionné par la quantité de fer circulant mobilisable de départ mais ne dépend que peu du fer de réserve dont la mobilisation est trop lente. Cela démontre limportance dun apport extérieur de fer chez les sujets normaux engagés dans un programme dautotransfusion. Nos travaux montrent que, malgré une utilisation dune partie du fer de réserve, les collectes de sang étaient dépendantes dune absorption digestive de fer qui augmentait de façon considérable. Nous avons démontré que lactivité érythropoïétique était un stimulant de labsorption digestive de fer au moins aussi puissant que la déplétion des réserves. Labsorption digestive de fer chez les patients hémodialysés et IRC est souvent diminuée et il a été démontré quelle est insuffisante pour rencontrer les besoins associés à un traitement par rHuEPO. De plus la tolérance digestive est mauvaise et la compliance est donc médiocre. Ladministration intraveineuse de fer est, de ce fait, nécessaire, mais non dépourvu de risques. Le dépistage du déficit martial fonctionnel est donc indispensable mais les paramètres classiques utilisés dans ce but peuvent se révéler sub-optimaux. La ferritine sérique, utilisée pour lestimation du fer de réserve, est une protéine de la phase aiguë de linflammation. Elle peut donc surévaluer les réserves de fer dans lurémie, considérée comme un état inflammatoire. Dans une population de sujets sains, nous avons montré que lactivité érythropoïétique et ladministration intraveineuse de fer pouvaient également fausser lévaluation des réserves de fer. Lactivité érythropoïétique diminue le pool labile de fer contenu dans les macrophages et la diminution de la production de ferritine qui sensuit peut donner une sous-estimation des réserves en fer. Lors dune stimulation érythropoïétique intense, dans un état déquilibre martial entre entrées et sorties, nous avons observé une augmentation de la FRT et donc une surestimation de lévaluation du fer de réserve qui en est dérivée. Alors que dans ces conditions, la FRT devrait rester stable ou diminuer suite à la mobilisation du fer pour lérythropoïèse stimulée, ladministration de fer intraveineux semble entraîner une augmentation de ce pool labile de fer intracellulaire, avec une stimulation de la production de ferritine qui ne représente alors plus de façon précise les stocks de fer de lorganisme. Le pourcentage de globules rouges hypochromes est considéré comme le meilleur prédicteur simple de la réponse à une charge martiale chez les patients hémodialysés traités par rHuEPO, témoignant de sa valeur diagnostique dans le déficit martial. Ce paramètre serait également le meilleur prédicteur en présence dun syndrome inflammatoire. Nous avons pu démontrer, pour la première fois, que la présence dune CRP augmentée influence positivement %HYPO. Dans cette étude, établissant les facteurs modulant %HYPO, ce paramètre était, comme attendu, influencé par les paramètres du monitoring martial, principalement le fer sérique et la saturation de la transferrine, mais moins la ferritine, pour les raisons déjà exposées. Des valeurs pathologiques de %HYPO étaient dailleurs retrouvées pour toutes les valeurs de ferritine jusquà 900 ng/mL. %HYPO était également corrélé à la dose de rHuEPO, reflétant le déficit martial induit par la stimulation érythropoïétique mais également la stimulation érythropoïétique en tant que telle. Le meilleur prédicteur simple de %HYPO était le taux de récepteurs solubles de la transferrine. Ce paramètre, connu pour être plus influencé par lactivité érythropoïétique que par le déficit martial, était lui-même corrélé, dans cette étude, à la fois à TSAT et à la réticulocytose. %HYPO semblait donc positivement influencé par lactivité érythropoïétique. Cette observation représente un désavantage pour le monitoring des besoins en fer des patients traités par rHuEPO chez qui le déficit martial fonctionnel cohabite avec laugmentation de lactivité érythropoïétique. Chez les patients donneurs de cellules souches, chez qui la stimulation érythropoïétique a été poussée à lextrême par de hautes doses de rHuEPO et des phlébotomies répétées, %HYPO sélevait de manière très importante jusquà des valeurs de 40%. Cette élévation était présente malgré une supplémentation martiale adéquate, comme en témoignent les courbes superposables de fer prélevé et de fer injecté. De plus, laugmentation de %HYPO débutait plus précocément que la chute de CHr. Il ne peut être exclu que le déficit martial participe à ce phénomène mais nous avons démontré que le rôle de la stimulation érythropoïétique était plus important. Nous avons établi une corrélation entre la production érythrocytaire et lapparition de nouveaux globules rouges hypochromes, confirmant cette hypothèse. Lactivité érythropoïétique induite par le traitement de lanémie rénale est, cependant, nettement moins importante que dans la situation précédente. Dans la population de patients dialysés, nous avons montré une augmentation moindre de %HYPO en réponse à lintroduction de rHuEPO malgré une supplétion martiale adéquate (CHr constant). Cette augmentation était due à lapparition dune population érythrocytaire plus jeune avec un volume cellulaire plus grand et un contenu en hémoglobine normal, résultant en une diminution artificielle de la concentration en hémoglobine. Grâce à la technologie des nouveaux compteurs cellulaires, les indices cellulaires peuvent être déterminés séparément dans les populations réticulocytaires et érythrocytaires matures. Létude des paramètres des érythrocytes matures semblait pouvoir répondre aux biais causés par lactivité érythropoïétique. Nous en avons donc determiné les valeurs de référence. La comparaison entre les indices réticulocytaires et ceux des globules rouges matures montrent que les réticulocytes sont 20% plus grands avec une concentration en hémoglobine 10% inférieure aux érythrocytes matures. Ces différences expliquent les biais qui peuvent être rencontrés dans linterprétation des paramètres de routine. Par létude de diverses pathologies hématologiques, nous avons pu valider linterprétation de ces paramètres. Dans lanémie hémolytique autoimmune, dans laquelle lactivité érythropoïétique est importante sans déficit martial, linterprétation des paramètres de routine menait à penser à un statut ferriprive alors que les paramètres des érythrocytes matures montraient une anémie plutôt macrocytaire et hyperchrome. Dans lanémie ferriprive %HYPO et %HYPOm augmentaient de façon superposable en raison de la faible réticulocytose. De manière générale, toutes les pathologies étudiées, dans lesquelles la réticulocytose est normale ou basse, présentent les mêmes caractéristiques pour les indices des érythrocytes matures que pour les paramètres déterminés sur la population érythroïde globale. Létude de corrélations a également montré que %HYPO était corrélé avec la réticulocytose mais pas avec le fer sérique, alors que %HYPOm était corrélé avec le fer sérique mais pas avec la réticulocytose. Ce paramètre rencontrait donc le but que nous recherchions. La détermination de la sensibilité et de la spécifité des indices globulaires matures dans la prédiction de la réponse à une charge martiale plaide en faveur de lutilisation de %HYPOm dans ce but. Le fait que les patients inclus dans cette étude soient dans la phase de maintenance du traitement par rHuEPO fait que les différences entre les paramètres de routine et les paramètres des érythrocytes matures sont peu importantes et non significatives. Une étude dans la phase dinduction du traitement par rHuEPO pourrait augmenter la différence entre ces paramètres. Une telle étude est toutefois difficile à réaliser car les critères de réponse à la charge martiale devraient être établis différemment. Pour confirmer lintérêt de ces paramètres dans le monitoring martial des patients dialysés traités par rHuEPO, une étude pharmaco-économique comparant les coûts du traitement par rHuEPO et des doses de fer administrées soit en fonction des directives internationales soit en fonction de %HYPOm pourrait être réalisée. Cependant, un nombre important de patients devraient être inclus pour que les résultats soient significatifs. En conclusion, ce travail confirme la nécessité, même dans une population considérée comme saine, dun apport extérieur de fer lors de la stimulation érythropoïétique par érythropoïétine humaine recombinante, étant donné la mobilisation trop lente du fer de réserve. Dans cette situation, labsorption digestive de fer est régulable et lactivité érythropoïétique semble être un stimulateur au moins aussi puissant que la déplétion martiale pour labsorption intestinale de fer. La ferritine, habituellement utilisée dans le monitoring des réserves de fer, est un paramètre médiocre dans lanémie rénale traitée par rHuEPO. En effet, en plus de leffet bien connu de linflammation sur ce marqueur, nous avons montré que ladministration intraveineuse de fer entraîne une production de ferritine sérique inadéquate, probablement en réponse à laugmentation du pool labile de fer. Ce phénomène semble plus important que leffet de la diminution de ce pool labile en réponse à la stimulation érythropoïétique. La mesure de la ferritine surestime donc le fer de réserve dans lanémie rénale traitée par rHuEPO et fer intraveineux. Le pourcentage de globules rouges hypochromes est un paramètre sensible et spécifique du déficit martial fonctionnel. Toutefois, nous avons démontré linfluence de linflammation et de lactivité érythropoïétique sur ce paramètre, pouvant biaiser son interprétation, pour le moins dans la phase de correction de lanémie, quand une réticulocytose élevée cohabite avec un nombre dérythrocytes matures faible. Les paramètres des érythrocytes matures ont été démontrés comme plus fiables pour linterprétation des données dans diverses pathologies hématologiques. Ils présentent lavantage dexclure, au moins en grande partie, les biais entraînés par une réticulocytose élevée. La sensibilité et la spécificité de %HYPOm dans la prédiction de la réponse à une supplémentation martiale étaient supérieures à celles des autres paramètres habituellement utilisés, mais cette différence nétait pas significative en raison de la stabilité des patients étudiés. Son intérêt en clinique quotidienne reste à démontrer.

Myelodysplastic syndromes (MDS) are regarded as clonal disorders of haematopoietic stem cells (HSC). Recent evidence demonstrates that stromal microenvironment, in addition to HSC defects, plays a particular role via its direct contact with haematopoietic precursor cells (HPC). This thesis aims at evaluating the putative growth deficiencies of mesenchymal stromal cells (MSC) from MDS individuals compared with normal controls, exploring their adhesion profile, assessing the adhesion process-involved molecular substrates, and establishing correlations with their growth patterns and HPC dysfunctions. Functional assays revealed that MSC from MDS are intrinsically pathological, show a continuous decline of proliferation over a 14-day culture and a reduced clonogenic capacity in the absence of signals from HPC. MSC growth defects significantly correlate with decreased CD44 and CD49e expression. Moreover, stroma-dependent adhesion mechanisms control HPC clonogenic potential and CD49e might be one of the molecules involved in this process. Qualitative and quantitative abnormalities of focal adhesion (FA) proteins paxillin and pFAK [Y397] and of two regulatory proteins, HSP90αβ and p130CAS were identified via immunofluorescence analysis. Paxillin, pFAK [Y397] and HSP90αβ increased expression, besides its stronger nuclear colocalization in MSC from RAEB correlates with a consistent proliferative advantage and has a negative impact on HPC clonogenic capacity. These results open interesting opportunities, e.g. HPC-to-MSC interactions involve FA proteins signalling, and, as FAK is an HSP90αβ-client protein, it may enhance the utility of HSP90αβ inhibitors as adjuvant therapy in MDS

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont considérés comme des maladies clonales des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Le microenvironnement joue un rôle important par ses contacts direct avec les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH). Notre objectif était d'évaluer les défauts de croissance des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) dans les MDS, d’explorer les molécules d’adhérence impliquées, et d'effectuer des corrélations avec leurs dysfonctionnements de croissance et les anomalies des CPH. Les CSM de MDS sont intrinsèquement pathologiques, montrant une baisse continue de la prolifération pendant 14 jours de culture et une capacité clonogénique réduite. Ces anomalies sont corrélés à une diminution des molécules d'adhérence CD44 et CD49e. Par ailleurs, le potentiel clonogénique des CPH est contrôlé par des mécanismes d'adhérence dépendant du stroma, CD49e pouvant être une des molécules impliquées. L’analyse en immunofluorescence des protéines d'adhérence focale (FA), paxilline et pFAK [Y397], et des deux protéines régulatrices, HSP90αβ et p130CAS permet l'identification d’anomalies qualitatives et quantitatives. Une expression accrue de paxilline, pFAK et HSP90αβ et leur forte co-localisation nucléaire dans les CSM d'anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB) sont corrélées avec un avantage prolifératif et un impact négatif sur la capacité clonogénique de CPH. Ces résultats ouvrent des possibilités intéressantes : la signalisation via les protéines FA pourrait être impliquée dans les interactions HPC-MSC ; par ailleurs, FAK étant une protéine cliente d’HSP90, les inhibiteurs d’HSP90 sont une potentielle thérapie adjuvante dans les myélodysplasies / Myelodysplastic syndromes (MDS) are regarded as clonal disorders of haematopoietic stem cells (HSC). Recent evidence demonstrates that stromal microenvironment, in addition to HSC defects, plays a particular role via its direct contact with haematopoietic precursor cells (HPC). This thesis aims at evaluating the putative growth deficiencies of mesenchymal stromal cells (MSC) from MDS individuals compared with normal controls, exploring their adhesion profile, assessing the adhesion process-involved molecular substrates, and establishing correlations with their growth patterns and HPC dysfunctions. Functional assays revealed that MSC from MDS are intrinsically pathological, show a continuous decline of proliferation over a 14-day culture and a reduced clonogenic capacity in the absence of signals from HPC. MSC growth defects significantly correlate with decreased CD44 and CD49e expression. Moreover, stroma-dependent adhesion mechanisms control HPC clonogenic potential and CD49e might be one of the molecules involved in this process. Qualitative and quantitative abnormalities of focal adhesion (FA) proteins paxillin and pFAK [Y397] and of two regulatory proteins, HSP90αβ and p130CAS were identified via immunofluorescence analysis. Paxillin, pFAK [Y397] and HSP90αβ increased expression, besides its stronger nuclear colocalization in MSC from RAEB correlates with a consistent proliferative advantage and has a negative impact on HPC clonogenic capacity. These results open interesting opportunities, e.g. HPC-to-MSC interactions involve FA proteins signalling, and, as FAK is an HSP90αβ-client protein, it may enhance the utility of HSP90αβ inhibitors as adjuvant therapy in MDS