Plusieurs mécanismes peuvent réduire l’angiogenèse tumorale d’où les stratégies visant à bloquer les cellules endothéliales (CE). Les cellules tueuses naturelles (NK) (natural killer cells) stimulées, s’arment pour l’élimination des cellules « dangereuses ». Notre hypothèse est qu’en conditions pathologiques (tumeur), les CE, acteurs de l’angiogenèse tumorale seraient reconnues comme telles et candidates à l’attaque par les NK. Les interactions entre les NK et les CE sont abordées à l’aide de CE humaines in vitro, quant aux mécanismes moléculaires de l’adhésion des NK en conditions statiques et conditions de flux. Ceci montre que les NK activées par l’IL-2 reconnaissent et adhérent aux CE selon leur origine tissulaire. Ce mécanisme est indépendant des sélectines mais dépend soit des intégrines, soit des co-récepteurs similaires aux lectines de type C. La cytotoxicité des NK vis-à-vis des CE s’exerce par la voie perforine-granzyme. En outre, stimulées par l’IL-2, les NK induisent la translocation de Bid et libération du cytochrome C dans les CE cibles lesquelles expriment les récepteurs de “mort”, voie alternative d’apoptose. Ce modèle in vitro est validé avec des NK du sang humain. A visée in vivo, les expériences réalisées avec des CE murines et des NK de la rate de souris indiquent que l’efficacité des NK activées par l’IL-2 est directement reliée à leur adhésion, laquelle dépend de l’origine tissulaire des CE. Nous démontrons que l’IL-12 (interleukine connue pour inhiber l’angiogenèse tumorale) active les NK en synergie avec l’IL-2. Les NK reconnaissant et tuant les CE in vitro suggère l’hypothèse qu’in vivo elles inhibent l’angiogenèse tumorale. / There are several mechanisms by which tumor angiogenesis may be reduced. They are addressed to tumor endothelial cell (EC) to block their activation and proliferation. Among the natural protection mechanisms, natural killer (NK) cells play an important role. Stimulated NK cells may eliminate potentially “dangerous” cells. Hence, we hypothesized that ECs involved in tumor angiogenesis may be recognized as “dangerous” cells and killed by NK cells. First, the adhesive interactions between NK cells and ECs were investigated. Using human in vitro cell lines, molecular mechanisms of NK cells adhesion to ECs under static and flow in vitro conditions were examined, showing that IL-2 activated NK cells were able to adhere to ECs. The molecular mechanism was shown not to be selectin - dependent but integrin and/or C type lectin like - dependent. Subsequently, cytotoxicity of NK cells toward ECs was analyzed. Its molecular mechanism was mainly perforin-granzyme dependent. NK cells were shown to induce in target ECs Bid translocation and cytochrome c releasing. To validate in vitro cellular model most of these experiments were repeated with freshly isolated human blood NK cells. The in vivo approach necessitated that adhesion and cytotoxicity were performed using murine ECs lines and freshly isolated NK cells from murine spleen. It was found that IL-12 synergizes with IL-2 to stimulate NK cells killing activity toward ECs. The demonstration that, under specific conditions stimulated NK cells are able to kill ECs in vitro allows hypothesizing that in vivo NK cells may participate in tumor angiogenesis inhibition.

L’athérosclérose est caractérisée par la formation d’une plaque d’athérome au niveau de la paroi d’un vaisseau sanguin. L’infiltration monocytaire participe à la phase précoce du développement de la plaque d’athérome. Le risque de rupture de la plaque est accru suite à sa néo-vascularisation. La chimiokine Regulated upon Activation, Normal T-cell, Expressed and Secreted (RANTES/CCL5) est impliquée dans le recrutement monocytaire. De plus, elle exerce un effet pro-angiogénique de manière dépendante de sa fixation aux glycosaminoglycanes (GAG) endothéliaux. Les syndécanes (SDC) sont des protéoglycanes transmembranaires à chaînes GAG exprimés par les cellules endothéliales. Le but de cette étude est de déterminer l’implication du domaine intracellulaire du SDC-4 dans l’angiogenèse et le recrutement monocytaire induits par la chimiokine RANTES/CCL5. Des mutants intracellulaires du SDC-4 ont été développés pour étudier le rôle de la PKC-α, de la liaison du PIP2 ou de protéines à domaine PDZ dans l’angiogenèse et le recrutement monocytaire induits par RANTES/CCL5. Nos résultats montrent que la chimiokine RANTES/CCL5 stimule l’angiogenèse et le recrutement monocytaire par le biais d’une signalisation intracellulaire induite par le domaine intracellulaire du SDC-4, activant notamment la PKC-α. Le développement de thérapies ciblant l’activation du SDC-4 pourrait permettre de réguler les effets physiopathologiques exercés par RANTES/CCL5. / Atherosclerosis is a pathology characterized by the formation of an atheroma plaque in the blood vessel wall. Monocyte infiltration participates to the early phase of atheroma plaque development. Plaque rupture is induced by its neovascularization. The chemokine Regulate upon Activation, Normal T-cell, Expressed and Secreted (RANTES/CCL5) is involved in monocyte recruitment. Moreover, RANTES/CCL5 induces angiogenesis through its binding to endothelial glycosaminoglycans (GAG) chains. Syndecans (SDC) are transmembrane proteoglycans with GAG chains expressed at the membrane of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the involvement of SDC-4 intracellular domain in RANTES/CCL5-induced angiogenesis and monocyte recruitment. SDC-4 intracellular mutants were developed to analyze the role of PKC-α, PIP2 binding or PDZ domain proteins in RANTES/CCL5-induced angiogenesis and monocyte recruitment. Our data show that RANTES/CCL5 induces angiogenesis and monocyte recruitment through intracellular signaling, including the activation of PKC-α, mediated by SDC-4 intracellular domain. The development of new therapeutic strategy targeting SDC-4 activation may counteract RANTES/CCL5 physiopathological effects.

Les tumeurs sécrètent un grand nombre de facteurs pro et anti-angiogéniques conduisant à la formation d'un réseau vasculaire venant soutenir leur croissance. Depuis 2004, les inhibiteurs de l'angiogenèse sont utilisés dans les traitements de plusieurs types de cancers avancés. Cependant, ces traitements ont échoué à augmenter la survie dans les cancers du sein métastatiques. Notamment à cause de l'apparition de résistances et d'un risque potentiel d'augmentation de l'invasivité tumorale et d'échappement métastatique. Dans ce contexte, je me suis intéressé au rôle des anti-angiogéniques endogènes lorsqu'ils sont surexprimés par la tumeur. La thrombospondine-1 (TSP1), anti-angiogénique endogène majeur et activateur du TGFß-latent, est réprimée lors des stades précoces de tumorigenèse, mais est fortement exprimée et corrélée avec l'agressivité et une réduction de la survie dans les stades tardifs de cancers du sein. J'ai démontré que l'expression de la TSP1 dans ces stades est un puissant promoteur de la dissémination métastatique. De plus, l'augmentation de l'expression de la TSP1 au cours de la progression tumorale résulte d'une boucle d'auto-amplification entre le TGFß et l'hypoxie, augmentant conjointement l'expression de la TSP1. Pour caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans ce rôle pro-métastatique de la TSP1 et déterminer si son effet pro-métastatique est dépendant de sa capacité à activer le TGFß et/ou de son activité anti-angiogénique, j'ai généré des lignées tumorales mammaires métastatiques invalidées pour des fonctions précises de la TSP1 en utilisant des techniques de genome editing. L'invalidation de la séquence de la TSP1 qui permet l'activation du TGFß-latent inhibe la transition épithélio-mésenchymateuse, la migration et l'extravasation des cellules tumorales. De plus, cette inactivation restaure la réponse immunitaire de l'hôte, inhibant fortement la croissance tumorale. Cependant, de façon remarquable, ces tumeurs métastasent chez des souris immunodéficientes. A l'inverse, l'invalidation du site de liaison de la TSP1 à son récepteur CD36 abolit son activité antiangiogénique sans affecter la capacité de migration ou d'extravasation des cellules tumorales. Les tumeurs se développant à partir de ces cellules sont fortement vascularisées, mieux perfusées, peu hypoxiques et ne forment pas de métastases spontanées. Nos résultats montrent donc que l'hypoxie induite par la TSP1 est le déclencheur critique de la dissémination métastatique et nous proposons le ciblage de la TSP1 comme nouvelle stratégie thérapeutique " anti-anti-angiogénique " pour inhiber la TEM, normaliser la vascularisation tumorale à long terme, augmenter la perfusion des chimiothérapies et surtout diminuer la dissémination métastatique. / Tumors secret pro and anti-angiogenic factors leading to the formation of a vascular network which fosters tumor growth. Since 2004, inhibitors of angiogenesis were used in the treatment of several types of advanced cancers. However, these treatments failed to increase patient survival in metastatic breast cancers. Particularly because of the development of resistances and a potential risk of increased tumor invasiveness and metastasis. In this context, I focused my work on the role of endogenous anti-angiogenic factors when they are overexpressed by the tumor. Thrombospondin-1 (TSP1), a potent endogenous anti-angiogenic factor and activator of latent-TGFß, is repressed in the early steps of tumorigenesis, but is strongly expressed and correlated with aggressiveness and decrease in survival of late stage breast cancers. I have demonstrated that TSP1 expression is a potent driver of metastasis at this stage. Furthermore, both TGFß and hypoxia increase TSP1 expression during tumor progression in a self-amplifying positive-feedback loop. To characterize the molecular mechanisms involved in this pro-metastatic role of TSP1 and exanimate if a dissociation between the anti-angiogenic and pro-metastatic effects of TSP1 exists, I used genome editing techniques to generate breast cancer metastatic cell lines knock-out for specific functions of TSP1. Knocking-down the TGFß activating sequence in TSP1 gene inhibited EMT, migration, extravasation. Furthermore, this restored the immune response of the host, strongly inhibiting tumor growth. However, in immune-compromised mice, these tumors developed and metastasized efficiently. In sharp contrast, knocking-down TSP1 antiangiogenic activity by mutating its CD36 binding site, without impairing ability of tumor cells to migrate and extravasate. Tumors raised from those cells were highly vascularized, well perfused, less hypoxic and haven't led to metastasis formation. Our results place TSP1-dependent hypoxia as a primal trigger of metastasis and we thus propose silencing TSP1 as an "anti-anti-angiogenic" therapeutic modality that inhibits EMT, enhances and normalizes the tumor vasculature in the long term, improves the efficacy of chemotherapy, and most importantly robustly impairs metastatic dissemination.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

De nombreuses équipes se sont intéressées aux fonctions antiangiogéniquesde PF4 (Platelet Factor 4 ou Facteur Plaquettaire 4). Ses capacités inhibitrices vis-àvisde la prolifération et de la migration des cellules endothéliales in vitro et son effetinhibiteur sur lʼangiogenèse in vivo ne sont plus à démontrer. En revanche, il existeencore de nombreuses interrogations sur les mécanismes dʼaction responsables deson activité antiangiogénique. La chimiokine PF4v1 (Platelet Factor 4 variant 1)mature ne diverge de PF4 que par trois acides aminés mais son potentielangiostatique est beaucoup plus élevé que celui de PF4. Lʼétude comparative de PF4et PF4v1 est donc susceptible de fournir des éclairages intéressants sur lesmécanismes dʼaction de lʼactivité antiangiogénique de PF4. La question se pose desavoir si la différence dʼactivité antiangiogénique entre ces deux chimiokines pourraitsʼexpliquer par des différences dʼaffinité aux GAGs (Glycoaminoglycans), à unrécepteur ou bien aux voies de transduction utilisées pour médier leurs effets ?Comme les mécanismes dʼaction de PF4v1 demeurent très largement incompris(bien que son utilisation comme agent thérapeutique antiangiogénique soit trèsprometteuse), nous avons adopté plusieurs axes de travail pour élucider lescaractéristiques spécifiques de cette chimiokine.Dans un premier temps, nous avons étudié les caractéristiques de diffusibilité etde biodisponibilité des facteurs PF4 et PF4v1. Nous avons déterminé que cesparamètres étaient liés aux affinités de PF4 et PF4v1 pour lʼhéparine et les GAGs, etnous avons identifié lʼacide aminé principalement responsable des différencesobservées.Sur le plan de lʼactivité antiangiogénique de ces deux chimiokines, nousmontrons une absence de corrélation avec lʼaffinité respective aux GAGs. Par contre,nous identifions que la liaison avec un récepteur spécifique pourrait être à lʼorigine dela différence dʼactivité antiangiogénique. Nous avons mené une étude permettant decomprendre le rôle de chaque acide aminé variant entre ces deux chimiokines dansla liaison spécifique au récepteur.Enfin, nous avons développé le premier anticorps monoclonal spécifique de laprotéine PF4v1 qui, de plus, neutralise son activité antiangiogénique. Ce nouvel outilapporte des informations sur la structure et sur lʼactivité biologique de PF4v1. Il nousa aussi permis de démontrer que la protéine PF4v1 est un nouveau biomarqueur ducancer du pancréas. Grâce à ce nouvel outil, nous avons aussi développé un dosageELISA anti-PF4v1. Dans le cadre de la recherche de nouveaux biomarqueurs pour ladétection précoce des cancers, nous pouvons envisager une utilisation de cet ELISAen collaboration avec des services cliniques. / Abstract :

Les métastases représentent l’étape ultime de la progression tumorale. Les traitements inhibiteurs de l’angiogenèse offrent de nouvelles perspectives thérapeutiques, notamment pour les stades invasifs, mais cependant ils n’apportent qu’une prolongation modeste de la survie des patients. La faible réponse de certains types de cancers aux traitements ciblant l’angiogenèse tumorale, comme le carcinome de la prostate chez l’homme ou du sein chez la femme, est due au développement de résistances tumorales d’une part, et à l’accélération du processus métastatique mise en évidence par certaines études précliniques et cliniques d’autre part. L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier le rôle d’une protéine anti-angiogénique endogène, la thrombospondine 1 (TSP1), dans l’invasion et la dissémination métastatique dans le carcinome de la prostate et du sein. Notre laboratoire a montré que la densité microvasculaire est inversement corrélée à l’expression de la TSP1 dans les stades précoces de ces carcinomes. Cependant, cette corrélation est perdue aux stades avancés où l’expression de la TSP1 devient associée à un mauvais pronostic. Les travaux de ma thèse ont permis de montrer que la TSP1 stimule un ensemble de processus intervenant dans la progression tumorale, dont la migration et l’invasion cellulaires, l’extravasation et la dissémination métastatique. Nous avons aussi pu mettre en évidence que l’hypoxie induite par l’inhibition de l’angiogenèse est un activateur majeur de l’invasion et de la formation de métastases, que cette hypoxie soit produite par des molécules endogènes comme la TSP1 ou par des inhibiteurs pharmacologiques de ce processus. De plus, nous démontrons que la TSP1 est un facteur de mauvais pronostic puisque son expression est corrélée avec l’augmentation de l’invasion et de la rechute des patients atteints de cancers de la prostate androgéno-résistants. En conclusion, nos résultats suggèrent que l’expression de la TSP1 pourrait être un facteur prédictif de l’invasion et de l’occurrence de métastases, et que le ciblage de la TSP1 présente un fort potentiel thérapeutique pour bloquer à terme ces processus. / Prognosis is poor once tumors developed metastasis, and overall survival has been only modestly improved by the development of drugs inhibiting angiogenesis. The poor response of certain types of cancer to therapies that target tumor angiogenesis, including prostate and breast carcinomas, is due to the development of an evasion and to the acceleration of the metastatic process noted in some preclinical and clinical studies. The objective of this thesis was to study the role of an endogenous anti-angiogenic factor, thrombospondin 1 (TSP1), in the process of invasion and metastasis of prostate and breast carcinomas. Our laboratory has previously shown that microvessel density is inversely correlated with the expression of TSP1 in primary stages of breast and prostate carcinomas. However, this correlation is lost in advanced cancers, where TSP1 expression becomes associated with poor prognosis. We show that TSP1 stimulates a set of processes involved in tumor progression, including cell migration and invasion, extravasation and metastatic dissemination. We also demonstrate that hypoxia induced by an inhibition of angiogenesis resulting from the activity of endogenous or pharmacological molecules is a major activator of invasion and metastasis. In addition, we demonstrate that TSP1 is a poor prognostic factor since its expression is correlated with increased invasion and relapse in patients with androgen-resistant prostate cancer. In conclusion, our results suggest that the expression of TSP1 could be a predictor of invasion and metastasis occurrence, and that targeting TSP1 could be a great therapeutic potential to block these processes.

Plusieurs mécanismes peuvent réduire l'angiogenèse tumorale d'où les stratégies visant à bloquer les cellules endothéliales (CE). Les cellules tueuses naturelles (NK) (natural killer cells) stimulées, s'arment pour l'élimination des cellules " dangereuses ". Notre hypothèse est qu'en conditions pathologiques (tumeur), les CE, acteurs de l'angiogenèse tumorale seraient reconnues comme telles et candidates à l'attaque par les NK. Les interactions entre les NK et les CE sont abordées à l'aide de CE humaines in vitro, quant aux mécanismes moléculaires de l'adhésion des NK en conditions statiques et conditions de flux. Ceci montre que les NK activées par l'IL-2 reconnaissent et adhérent aux CE selon leur origine tissulaire. Ce mécanisme est indépendant des sélectines mais dépend soit des intégrines, soit des co-récepteurs similaires aux lectines de type C. La cytotoxicité des NK vis-à-vis des CE s'exerce par la voie perforine-granzyme. En outre, stimulées par l'IL-2, les NK induisent la translocation de Bid et libération du cytochrome C dans les CE cibles lesquelles expriment les récepteurs de "mort", voie alternative d'apoptose. Ce modèle in vitro est validé avec des NK du sang humain. A visée in vivo, les expériences réalisées avec des CE murines et des NK de la rate de souris indiquent que l'efficacité des NK activées par l'IL-2 est directement reliée à leur adhésion, laquelle dépend de l'origine tissulaire des CE. Nous démontrons que l'IL-12 (interleukine connue pour inhiber l'angiogenèse tumorale) active les NK en synergie avec l'IL-2. Les NK reconnaissant et tuant les CE in vitro suggère l'hypothèse qu'in vivo elles inhibent l'angiogenèse tumorale.

Le facteur tissulaire (FT), protéine centrale de la coagulation plasmatique, joue un rôle direct dans le développement tumoral. Nous avons étudié l’expression génique et protéique du FT dans des échantillons de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) et avons recherché une relation entre le niveau d’expression du FT, l’angiogénèse tumorale, les mutations de K- RAS, p53, PTEN et LKB1 et l’expression de l’héparanase. Nos résultats montrent que l’expression de FT est plus importante dans les tumeurs de grande taille et dans les stades avancés. Aucune relation n’a été retrouvée entre l’expression de FT, de VEGF165, de VEGF189, d’héparanase ou avec la microdensité vasculaire. Par contre, l’expression génique de FT était plus importante en cas de mutations touchant l’oncogène K-RAS ou les gènes suppresseurs de tumeur p53 et PTEN et l’expression du FT augmentait avec le nombre de lésions géniques. Enfin, la survie des patients était plus courte quand l’expression tumorale de FT était élevée et quand p53 était muté. Dans le CBNPC, l’expression tumorale de FT est donc régulée par les altérations géniques, caractéristiques du cancer et est un facteur pronostic. / Tissue Factor (TF), the main initiator of blood coagulation, is also a signaling protein that regulates tumour development. In this study, we studied TF gene and protein expressions in biopsies of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). We also looked for a relationship between TF expression and tumour angiogenesis, heparanase gene expression and the status of K-RAS, p53, PTEN and LKB1 genes. TF expression was significantly higher in T3-T4 tumours and in stages III-IV. No relationship was evidenced between TF, VEGF165, VEGF189 and heparanase gene expressions or with tumour microvessel density. TF tumour gene expression was higher when K-RAS, p53 and PTEN were mutated and tumour TF mRNA levels increased progressively with the number of gene alterations. Finally, the median survival time was shorter in patients with tumour TF mRNA levels above the median value and when p53 was mutated. In conclusion, these results provide clear evidence that combined oncogene events affecting TSG dramatically increase TF gene expression. Moreover, the results of this study indicate that TF expression could be used as a prognostic marker in NSCLC.

Le myélome multiple est une néoplasie plasmocytaire caractérisée par une prolifération clonale de plasmocytes malins au niveau de la moelle osseuse. Il correspond à environ 13% des cancers hématologiques et la survie médiane à 10 ans est d’environ 30%. Le CD146 est une molécule d’adhésion (CAM) qui est surtout exprimée au niveau des jonctions des cellules endothéliales. A l’origine, le CD146 a été identifié comme un marqueur tumoral du mélanome (MCAM) et, par la suite, il a été étudié dans de nombreux cancers tels que les cancers du rein, du sein, du poumon, les cancers gastriques et les ostéosarcomes. Son expression est le plus souvent associée à un mauvais pronostic. Nous avons montré pour la première fois, que cette molécule s’exprimait aussi à la surface des plasmocytes normaux, cette expression apparaissant tardivement au cours de la différenciation B. Nous avons montré que cette expression était modulée sur des plasmocytes tumoraux de gammapathie monoclonale avec une forte diminution voire le plus souvent une disparition sur les plasmocytes malins de Myélome Multiple (MM). De plus, nous avons montré que CD146 constituait un facteur de bon pronostic indépendant dans cette maladie et qu’il était un des mécanismes permettant à la cellule tumorale d’avoir un avantage en termes de survie. Un second axe de recherche a consisté à la mise en place d’une technique de détection des cellules endothéliales circulantes dans le sang et in situ dans la moelle osseuse dans le myélome multiple afin de disposer d’un outil permettant l’étude de l’angiogenèse dans cette pathologie ainsi que son suivi en clinique. / Multiple Myeloma is a neoplastic plasma-cell disorder that is characterized by clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow microenvironment. It accounts for approximately 13% of hematologic cancer and the ten year survival rate is approximately 30%. CD 146 is an adhesion molecule (CAM) that is essentially expressed at endothelial junctions. At first, CD 146 was identified as a tumor marker of melanoma. It subsequently was studied in conjunction with cancer of the kidney, the breast, the lung, as well as gastric cancers and osteosarcomas. Its expression is most often associated with a bad prognosis. For the first time we have shown that this molecule is expressed at the surface of normal plasma cells, this expression appearing during the late stages of B cell differentiation. We have demonstrated that this expression was modulated on Multiple Myeloma (MM) plasma cells, and and was significantly decreased or disappeared in malignant plasma cells. Moreover, we have shown that CD146 was an independent good prognostic marker and that it was implicated in mechanisms that confers a survival advantage to the tumor cell. The next part of the project consisted to set up a detection protocol for circulating endothelial cells in blood and bone marrow in multiple myeloma in order to develop a tool for studying angiogenesis in this pathology which can also be used during therapeutic monitoring.