Le facteur tissulaire (FT), protéine centrale de la coagulation plasmatique, joue un rôle direct dans le développement tumoral. Nous avons étudié l’expression génique et protéique du FT dans des échantillons de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) et avons recherché une relation entre le niveau d’expression du FT, l’angiogénèse tumorale, les mutations de K- RAS, p53, PTEN et LKB1 et l’expression de l’héparanase. Nos résultats montrent que l’expression de FT est plus importante dans les tumeurs de grande taille et dans les stades avancés. Aucune relation n’a été retrouvée entre l’expression de FT, de VEGF165, de VEGF189, d’héparanase ou avec la microdensité vasculaire. Par contre, l’expression génique de FT était plus importante en cas de mutations touchant l’oncogène K-RAS ou les gènes suppresseurs de tumeur p53 et PTEN et l’expression du FT augmentait avec le nombre de lésions géniques. Enfin, la survie des patients était plus courte quand l’expression tumorale de FT était élevée et quand p53 était muté. Dans le CBNPC, l’expression tumorale de FT est donc régulée par les altérations géniques, caractéristiques du cancer et est un facteur pronostic. / Tissue Factor (TF), the main initiator of blood coagulation, is also a signaling protein that regulates tumour development. In this study, we studied TF gene and protein expressions in biopsies of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). We also looked for a relationship between TF expression and tumour angiogenesis, heparanase gene expression and the status of K-RAS, p53, PTEN and LKB1 genes. TF expression was significantly higher in T3-T4 tumours and in stages III-IV. No relationship was evidenced between TF, VEGF165, VEGF189 and heparanase gene expressions or with tumour microvessel density. TF tumour gene expression was higher when K-RAS, p53 and PTEN were mutated and tumour TF mRNA levels increased progressively with the number of gene alterations. Finally, the median survival time was shorter in patients with tumour TF mRNA levels above the median value and when p53 was mutated. In conclusion, these results provide clear evidence that combined oncogene events affecting TSG dramatically increase TF gene expression. Moreover, the results of this study indicate that TF expression could be used as a prognostic marker in NSCLC.

L’hémostase est un processus physiologique permettant de préserver l’intégrité du système vasculaire et de prévenir une perte de sang en réponse à une blessure. En situation pathologique, comme dans le cas de cancers, d’infections ou de maladies cardiovasculaires, il peut y avoir activation de la cascade de coagulation entraînant la formation d’un thrombus.Dans cette étude, nous avons utilisé la microscopie intravitale dans un modèle de blessure au rayon laser pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans la formation d’un thrombus plaquettaire en conditions physiologiques et pathologiques lors du développement d’un cancer. La première partie de ce travail a consisté à décrire l’implication des polynucléaires neutrophiles dans la formation d’un thrombus. Nous montrons que les neutrophiles sont les premières cellules à s’accumuler au niveau du site de blessure et représentent la principale source de facteur tissulaire menant à la génération de fibrine et à la formation du thrombus. Ces neutrophiles sont nécessaires au recrutement de cellules endothéliales progénitrices (Endothelial colony- forming cells, ECFCs), qui sont des cellules capables de jouer un rôle important dans la réparation vasculaire. Dans une seconde partie, nous avons déterminé, dans des modèles murins adaptés, l’implication de l’activation du FT et des plaquettes dans la thrombose associée au cancer. En conclusion, notre travail donne de nouvelles perspectives dans la compréhension du rôle pathophysiologique des neutrophiles, des cellules progénitrices endothéliales et des plaquettes. / Hemostasis is a physiological process to preserve the integrity of the vascular system and to prevent blood loss in response to injury. In pathological conditions, such as cancers, infections or cardiovascular diseases, the blood coagulation cascade can be activated, leading to the formation of a platelet thrombus.Using a laser-injury model coupled with a high-definition, high-speed camera, we explored the cellular and molecular mechanisms involved in thrombus formation in physiological and in pathological conditions associated with the development of a cancer. The first part of this work describes the role of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in thrombus formation. We show that PMNs are the first cells to accumulate at the site of injury and represent the main source of blood-borne tissue factor (TF), leading to the generation of fibrin and thrombus formation. We also show that once present at the site of injury, PMNs recruit Endothelial Progenitor Cells (endothelial colony-forming cells, ECFCs), which play a key role in vascular repair. The second part of this work we determined, in dedicated mouse models, the involvement of TF and platelet activation in thrombosis associated with cancer. Together, our findings provide new perspectives in the understanding of the pathophysiological role of polymorphonuclear neutrophils, Endothelial Progenitor Cells and platelets.

L'objectif de ce travail est d'évaluer le rôle du facteur tissulaire (FT) dans l'initiation de la coagulation d'un circuit d'hémodialyse. A partir de l'analyse des membranes d'hémodialyse, nous avons observé que les leucocytes et, majoritairement les polynucléaires neutrophiles (PNN) adhéraient aux membranes hémocompatibles (de type AN69ST). Ces cellules expriment un FT fonctionnel. Nous avons développé différents modèles d'étude de l'expression du FT par les PNN. A partir de PNN humains obtenus chez des sujets sains, nous montrons que les PNN expriment le FT après stimulation par le TNF. L'IL-8, chemokine chimioattractante des PNN augmentent, par un effet de priming, l'expression de FT en réponse au TNF. L'inhibition de l'adhésion par un anticorps dirigé contre les β2-intégrines, induit une diminution de l'expression de FT en réponse au TNF. L'inhibition de la voie de signalisation MEK1/2, la p38 MAPK, et des radicaux libres oxygénés, inhibe également cette expression. A partir de PNN provenant de péritonites secondaires à une dialyse péritonéale, nous avons mis en évidence une forte expression de FT par ces PNN (ARNm et protéine). Le FT possède un fort potentiel pro-coagulant. Ce modèle physiopathologique est la conséquence d'une migration et d'une activation inflammatoire comparable au modèle que nous avons développé in-vitro. Dans l'objectif de faire la preuve de ce nouveau concept, nous avons évalué un facteur VII humain recombinant inactivé (FVIIai) dans un modèle d'hémodialyse chez le mouton. Nos résultats sont en faveur d'un effet anticoagulant du circuit d'hémodialyse, sans effet anticoagulant mesurable chez l'animal. / The objective of this study is to analyse the role of Tissue Factor, the unique physiological trigger on thrombin generation. Analysing haemodialysis membranes, we found that leukocytes, mainly polymorphonuclear neutrophils (PMN) adhere to hemocompatible (AN69ST) membranes. These cells express a functional TF. We next showed that human PMN obtained from healthy subjects expressed TF in response to TNF. IL-8, a major chemokine involved in PMN chemoattraction primed TNF-induced TF by PMN. TF expression was down regulated when 2 integrins were blocked by a potent antibody. The inhibition of MEK1/2, p38 MAPK and free radicals reduced TF expression. We observed, that PMN obtained from patients experiencing peritonitis, expressed high levels of TF (mRNA and protein). Functional assays measuring Xa generation and kinetics of thrombinn generation (thrombinography) indicate the stong procoagulant potential of these cells. This physiopathological model is close to our in vitro model as it results from PMN migration and inflammatoty activation. For proof of concept, we evaluated the effect of an inactivated human recombinant factor VIIa ( FVIIai) in a sheep model of hemodialysis. Our results show that FVIIai limits haemodialysis circuit coagulation without any measurable systemic anticoagulant effect

L'hypothèse que l'hypertension peut conférer un état d'hypercoagulabilité découle des principales complications liées à l'hypertension, l'infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Notre objectif était de déterminer si l'hypertension spontanée confère des changements dans les protéines de la coagulation et de la capacité de production de thrombine dans le sang et la paroi vasculaire. Nous avons utilisé le modèle de rats spontanément hypertendus (SHR) par rapport aux rats Wistar. La génération de thrombine est plus faible dans le plasma riche en plaquettes et plasma sans plaquettes de SHR par rapport à Wistar. Ceci est lié aux faibles concentrations en facteur tissulaire (TF) et en prothrombine, ainsi qu?un taux plus élevé de TFPI dans le plasma des SHR. En revanche, l'ajout d'anneaux d'aorte thoracique de SHR à un pool de plasma Wistar a donné lieu à une augmentation plus importante dans la génération de thrombine par rapport à l'ajout d'anneaux équivalent du Wistar. Alors qu'aucune différence n'a été observée pour les cellules endothéliales, la formation de thrombine était plus élevée à la surface de culture CML aortiques des SHR que des Wistar. L'exposition des phospholipides chargés négativement est plus élevée sur les anneaux et les CML des SHR que les Wistar. Les activités TF et TFPI étaient plus élevés chez les CML des SHR. Ces résultats montrent une opposition de génération de thrombine à la surface de la paroi artérielle et dans le plasma des rats SHR par rapport aux rats Wistar. Le phénotype thrombotique plus élevé de la paroi vasculaire SHR est dû à la capacité du CML à soutenir la génération de thrombine. Ces résultats suggèrent que le remodelage de la membrane phospholipidique et la synthèse de molécules pro-coagulantes induites par hypertension dans les CML sont des substrats pour une formation de thrombine accrue dans la paroi vasculaire / The hypothesis that hypertension may confer a hypercoagulable state arises from the main complications associated with hypertension, stroke and myocardial infarction. Our objective was to determine whether spontaneous hypertension confers changes in the coagulation proteins and the thrombin generating capacity in blood and the vascular wall. We used the model of spontaneously hypertensive rats (SHR) compared with Wistar rats. Thrombin generation was lower in platelet-rich plasma and platelet-free plasma from SHR compared to Wistar. This was related to lower tissue factor (TF) and prothrombin as well as higher TFPI levels in SHR plasma. In contrast, the addition of thoracic aorta rings of SHR to a Wistar plasma pool resulted in a higher increase in thrombin generation compared to the addition of equivalent rings from Wistar. Whereas no difference was observed for endothelial cells, thrombin formation was higher at the surface of cultured SHR aortic SMCs than from Wistar. Exposure of negatively-charged phospholipids was higher on SHR than on Wistar rings as well as on SMCs. TF and TFPI activities were higher in SHR SMCs. These results show opposite thrombin generating capacity of plasma and vessel walls in SHR compared to Wistar. The higher prothrombotic phenotype of the SHR vessel wall was due to the ability of SMCs to support thrombin generation. These findings suggest that the hypertension-induced membrane phospholipid reorganization and synthesis of procoagulant molecules in SMCs provide substrates for increased thrombin formation within the vessel wall

La thèse décrit, dans le premier chapitre, les effets opposés sur la régulation de l'expression du gène du facteur tissulaire (TF) par la voie PI3K/Akt et la voie Erk1/2 in vitro. TF est une molécule clé pour initier la coagulation du sang. Son rôle est maintenant connu au développement embryonnaire, le maintien de l'intégrité vasculaire et la réparation tissulaire. De fait que divers cancers expriment des niveaux aberrantes du TF qui sont corrélés avec le pronostic, TF pourrait réellement favorise la croissance tumorale, l'angiogenèse et la métastase. En utilisant une lignée cellulaire épithéliale de cancer du sein MDA-MB-231, nous avons quantifié l'expression du gène du TF par le test luminescent, qPCR, western blot, et d'activité TF associée aux cellules in vitro. Nous avons constaté que 1) PI3K/Akt est la principale voie qui active l'expression des gènes TF. 2) L'activité Erk1 / 2 inhibe l'expression du gène TF; 3) le blocage de la voie Erk1/2par PD98059 induit une expression aberrante du gène du TF via sur-activation du récepteur du EGF; 4) cette sur-expression du TF peut être neutralisé par le blocage de l'EGFR et de la voie PI3K/Akt; 5) cette sur-expression induite par l'inhibition de Erk1/2est une caractéristique commune pour les lignées de cellules épithéliales cancéreuses testés, comme SKOV-3-3 et OVCAR ; 6) la forme soluble du TF suite à l'épissage alternatif représente une faible proportion de l'ARNm de TF totale et 7) Le niveau d’expression duTF des cellules MDA-MB-231 est corrélée à une activité procoagulante cellulaire et à l'invasivité des cellules in vitro. Cette étude a révélé une boucle de régulation négative de l’Erk1/2 vis-à-vis du l’activité du EGFR, ce qui suggère un effet indésirable des agents thérapeutiques ciblant l’Erk dans la clinique.La thèse décrit, dans le deuxième chapitre, les éléments de preuve de la fonction angiogénique de Hypb, une H3K36 méthyltransférase avec Hypb-/ - knockout souris.Ces souris ont montré une létalité embryonnaire à E10.5-E11.5 et de graves anomalies vasculaires dans le sac vitellin d'embryons et le placenta. Les expériences avec des cellules endothéliales HMEC-1 in vitro utilisant l’anti-Hypb siARN ont démontré défaut de migration et d’invasion cellulaire. En outre, les cellules traitées ont perdu la capacité de former des vaisseaux. Ces données sont bien cohérente avec l'analyse histologique de embryons Hypb-/- de souris dont le réseau complexe de ramification vaisseaux embryonnaires et la circulation sanguine étaient absentes. L'analyse génétique sur sac vitellin avec microarray ont suggéré une association entre le défaut de l'angiogenèse dans Hypb-/ - souris et la déréglementation de la sécrétion des protéines Angptl3 etCyr61, qui pourraient se lier à avß3. Il a également souligné le rôle de l'angiogénine,Angptl3 et Gja4 dans ce défaut, parce que lien de ces gènes à l'angiogenèse étaient démontrés. Mécanismes plausibles sont explorés. La régulation épigénétique de l'angiogenèse est une question importante parce qu'elle contrôle la régulation spatiale et temporelle de l'expression de milliers de gènes. Notre étude suggère clairement un rôle clé de Hypb et H3K36 méthylation et Hypb mécanismes liés aux processus de vascularisation chez les mammifères (vasculogenèse et l'angiogenèse). L'angiogenèse est importante pour la recherche fondamentale et application médicale dans les maladies cardio-vasculaires et de la thérapie anti-cancereuse. Nous espérons que de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les voies épigénétiques permettra d'offrir de nouvelles voies thérapeutiques. / The thesis described, in the first chapter, an opposite regulatory effects of PI3K/Akt pathway and Erk1/2 pathway on tissue factor(TF) gene expression in vitro. TF is a keymolecule required to initiate blood coagulation, and is now accepted to be essential forembryo development, maintenance of vascular integrity and tissue repair. Since a variety of cancers show aberrant prognostics-correlated high levels of TF expression, it is believed that TF promotes tumor growth, angiogenesis and metastasis. Using an epithelial breast cancer cell line MDA-MB-231, we quantified TF gene expression by luminescent test, qPCR, western blot, and cell-associated TF activity in vitro. We found that 1) PI3K/Akt is the major pathway that activates TF gene expression. 2) Erk1/2activity inhibits TF gene expression; 3) blocking Erk1/2 by PD98059 aberrant lyupregulates TF gene expression via enhancing EGFR activity; 4) this enhanced TF expression can be neutralized by blocking EGFR and PI3K/Akt pathway activation; 5) TF upregulation induced by Erk inhibition is a common feature in the tested epithelial cancer cell lines SKOV-3 and OVCAR-3; 6) Soluble form of TF due to alternative splicing represents a small proportion of total TF mRNA and 7) The level of TF gene expression in MDA-MB-231 cells is correlated to cell procoagulant activity and cell invasiveness in vitro. This study revealed a negative feedback loop of Erk-mediated EGFR inhibitions,suggesting an undesirable effect of the agents targeting Erk in clinic.The thesis described, in the second chapter, the evidence of angiogenic function of Hypb,a H3K36 methyltransferase with Hypb-/- knockout mice. These mice demonstrated embryonic lethality at E10.5-E11.5 and severe vascular defects in the Hypb−/− embryo,yolk sac, and placenta. The experiments with endothelial cells HMEC-1 in vitro using anti-Hypb siRNA demonstrated defective cell migration and invasion. Furthermore, the treated cells lost the capacity of vessel formation. These data were well coherent with histological analysis of Hypb-/- mice embryos that lacked the intricate network of branching embryonic vessels and showed disrupted blood flow. The genetic microarray analysis on yolk sac suggested an association between the defect of angiogenesis inHypb-/- mice and deregulated Angptl3 and Cyr61 protein release, since both of which could bind to αvβ3. It also suggested the roles of angiogenin, Angptl3 and Gja4 in this defect because these angiogenesis-related genes were downregulated. Plausible mechanisms are discussed. The epigenetic regulation of angiogenesis is an important issue because it controls the spatial and temporal regulation of expression of thousands of genes. Our study clearly suggests a key role of Hypb and H3K36 methylation and Hypb-related mechanisms in the processes of mammalian vascularization (vasculogenesis and angiogenesis). Angiogenesis is important for both basic researchand medical application in cardiovascular diseases and cancer therapeutics. We believe that novel therapeutic strategies targeting epigenetic pathways will achieve real benefit in medical practices.

Définie comme étant le rétrécissement de la valve, la sténose aortique (SA) est la 3ème pathologie cardiovasculaire dans les pays industrialisés. Touchant essentiellement les personnes âgées de plus de 65 ans, cette pathologie représente un véritable problème de santé publique compte tenu du vieillissement de la population. Considérée initialement comme issue d’un processus passif de dégénérescence, il est désormais établi que la sténose aortique est une pathologie dite « atherosclerosis-like » caractérisée par les processus d’inflammation, de fibrose, de néo-angiogenèse et de calcification. Certaines protéines de la voie de coagulation tel que le facteur tissulaire (FT) sont connues pour avoir un rôle pro-fibrotique et participent activement au développement des lésions athéroscléreuses. Leurs rôles dans la SA semblent donc probables et restent à être identifiés.Composante cellulaire majeure de la valve aortique, les VICs présentent 5 sous-populations distinctes : les cellules progénitrices embryonnaires (EPCs), les cellules progénitrices (pVICs), quiescentes (qVICs), activées (aVICs) et ostéoblastiques (obVICs). Au cours de la valvulogenèse, les EPCs permettent la cellularisation de la valve en se différenciant en qVIC. Celles-ci maintiennent l’homéostasie valvulaire et, en cas de lésion, s’activent (aVICs) pour réparer efficacement le tissu valvulaire. L’inflammation valvulaire et l’activation des VICs initient la sécrétion de protéines pro-calcifiantes induisant la différenciation des aVICs en obVICs. Enfin, les pVICs, naturellement présentes au sein de la valve (appelées résidantes) ou issues de la circulation sanguine (appelées hématopoïétiques), semblent favoriser le renouvellement cellulaire et peuvent être impliquées dans les processus angiogénique et ostéoblastique.Bien que décrites, la validation de la culture primaire des VICs par le suivi de ces sous-populations n’avait pas été réalisé et à constituer notre premier objectif. Nous avons ensuite étudié l’implication des voies de signalisation du FT dans le développement de la SA.Dans le cadre du suivi longitudinal des VICs depuis les valves aortiques humaines contrôles et pathologiques jusqu’à la culture in vitro réalisée sur plastique et sur collagène, nous avons tout d’abord montré que les différentes sous-populations étaient présentes au sein de ces valves avec des localisations et des proportions différentes selon l’état physiopathologique du tissu. Après digestion enzymatique de la valve, elles sont toutes retrouvées mais lors de la mise en culture, les pVICs hématopoïétiques ont disparu, quel que soit le support. Nous avons ainsi validé le modèle de culture primaire des VICs tout en mettant en lumière ses limites : absence des pVICs hématopoïétique, activation et différenciation ostéoblastique spontanée des VICs au cours de la culture.Dans le cadre de l’’étude de l’implication du FT dans le développement de la SA, nous avons montré sa colocalisation avec la thrombine et les calcifications de valves pathologiques. A partir de la culture primaire de VICs issues de valves humaines contrôles et pathologiques, nous avons montré que l’expression et l’activité du FT étaient constitutivement plus importantes pour les VICs pathologiques et que son expression pouvait être induite par l’IL1β. De plus, l’activation du FT, en présence de son ligand le facteur VII, induit, directement et via le récepteur PAR2, différentes voies de signalisation impliquées dans la prolifération cellulaire et les processus de fibrose et de calcification. Cette étude suggère ainsi que le FT produit par les VICs est un médiateur clef dans le développement de la sténose aortique. / Defined as the narrowing of the aortic valve, aortic stenosis (AS) is the third cardiovascular pathology in industrialized countries. Affecting mainly people aged over 65 years, AS represents a major public health problem because of the aging of the population. After initially been considered as a passive degenerative process, it is now established that AS is an "atherosclerosis-like " disease characterized by the processes of inflammation, fibrosis, neo-angiogenesis and calcification. Some proteins of the coagulation pathway such as tissue factor (TF) are known to have a pro-fibrotic role and actively participate in the development of atherosclerotic lesions. Their implication in AS seems, therefore, probable and remain to be identified.Prevalent cellular component of the aortic valve, VICs have five distinct subpopulations: embryonic progenitor cells (EPCs), progenitor cells (pVICs) quiescent (qVICs), activated (aVICs) and osteoblastic (obVICs). During the valvulogenesis, EPCs allow the cellularization of the valve, differentiating into qVICs. These cells maintain the valvular homeostasis and, in case of damage, are activated (aVICs) to effectively repair the valve tissue. The valvular inflammation and VICs activation initiate the secretion of pro-calcifying proteins inducing the differentiation of aVICs into obVICs. Finally, pVICs, naturally present within the valve (called resident) or from the blood circulation (called hematopoietic), seem to promote cell renewal and may be involved in the angiogenic and osteoblastic processes.Although described, these subpopulations have never been studied longitudinally, in respect to their behavior in vitro. Our first objective was to perform this investigation. Our second objective was to study the potential role of TF pathway in the deleterious mechanisms of AS.As part of the longitudinal follow-up of VICs from control and pathological human aortic valves to the in vitro culture performed on plastic and collagen, we first showed that different subpopulations were present in these valves with different locations and proportions according to the pathophysiological state of the tissue. After enzymatic digestion, all subpopulations are found but, in culture, hematopoietic pVICs disappeared, whichever the support. Thus, we validated the primary culture model of VICs while highlighting its limitations: lack of hematopoietic pVICs, spontaneous osteoblastic differentiation and activation of VICs in culture.As part of the study the involvement of FT in the AS development, we showed its colocalization with thrombin and calcifications of pathological valves. We showed that the expression and activity of TF were constitutively more important in VICs from fibrocalcified valves than control ones and that IL-1β for pathological VICs and that its expression could be induced by IL1 beta. In addition, TF activation in the by its ligand FVII, induced, directly and via the PAR-2 receptor, different signaling pathways involved in cell proliferation and the processes of fibrosis and calcification. Thus, our findings suggest that the FT expressed by VICs mediates fibrocalcific processes of aortic stenosis.

Ce travail est consacré au rôle pléotropique des microparticules endothéliales dans la réponse et l'homéostasie vasculaire. Un modèle de sénescence réplicative a été caractérisé en utilisant des cellules endothéliales de coronaires de porc en culture primaire. Ce modèle a mis en évidence des changements drastiques du phénotype endothélial avec la production de ROS, la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la surexpression de régulateurs clés du cycle cellulaire incluant p53, p21 et p16. La sénescence a transformé le phénotype endothélial vers un statut procoagulant indiqué par la libération de microparticules (MP). L'induction d'activité Facteur Tissulaire (FT) et une réduction drastique de l'inhibition de l'agrégation plaquettaire due à la sécrétion réduite de NO endothélial. Simultanément, une augmentation importante des protéines du système de l'angiotensine à la surface des cellules sénescentes et des MPs qu'elles émettent a été mesurée. D'autres résultats obtenus avec les MPs circulantes de patients transplantés ou atteints de syndrome coronarien suggèrent l'existence dune boucle d'amplification des effets délétères des MPs au travers de la signalisation Redox et l'altération des fonctions vasculaires résultant d'une sénescence exacerbée. En plus de ses qualités reconnues d'immunosuppresseur, la cyclosporine A (CsA) est un inhibiteur puissant de l'ouverture des pores mitochondriaux (mPTP). Certaines études ont présenté le traitement bref et contrôlé par CsA comme un moyen de limiter les dommages vasculaires de l'ischémie reperfusion.Nos données suggèrent une possible modulation de la sénescence endothéliale induite par les MPs grâce au préconditionnement avec des concentrations faibles de CsA. nos résultats suggèrent aussi que de faibles doses de Cs A peuvent avoir un effet bénéfique dans les pathologies cardiovasculaires lorsque la sénescence est exacerbée et contribue les fonctions vasculaires de l’endothélium. / This scientific work has tackled the issue of the pleitropic role mediated by endothelial microparticles function and homeostasis. A replicative model of senescence using coronary endothelial cells was set showing drastic phenotype changes characterized by ROS production, mitochondrial membrane depolarization and the up-regulation of key regulators of cell cycle arrest including p53, p21 and p16.Replicative senescence shifted the coronary endothelial phenotype toward a procoagulant status as evidenced by (i) procoagulant MP shedding (ii) enhanced tissue factor (TF) expression and (iii) a marked decrease in the endothelial NO-mediated inhibition of platelet aggregation. In parallel, a drastic up regulation of the angiotensin system could be evidenced at the surface of senescent cells or derived MP. Results obtained with MPs from patients with acute coronary artery syndrome and from grafted patients,suggested a feedback loop disseminating the deleterious effect of circulating MPs redox signaling and alteration of vascular function owing to exaggerated senescence. In addition to its well-known immunosuppressive properties, cyclosporine A (Cs A) is a potent inhibitor of the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), and several reports have indicated that a brief and timely administration of Cs A can limit ischemia-reperfusion injuries. Our data evidenced the possible pharmacological modulation of endothelial MP-mediated senescence by cell preconditioning with low concentrations of Cs A. our data are thus suggestive of a beneficial effect of CsA in cardiovascular disorders where senescence is altering the endothelial vascular functions.

Objectifs: Etude de l'influence des cellules du pancréas d'adénocarcinome (BXPC3) et des cellules de carcinome du sein humain (MCF7) sur l'efficacité antithrombotique de l'apixaban, du fondaparinux et de l'énoxaparine. Recherche des mécanismes procoagulants des BXPC3 et MCF7.Méthodes: Les cellules sont cultivées sur plaques 96 puits. Un plasma normal pauvre ou riche en plaquettes est surchargé par des anticoagulants. La génération de thrombine (GT) est réalisée dans différentes conditions par le test CAT. Le facteur tissulaire alternatif épissé (asTF), l'activité du FT (FTa) et le cancer procoagulant (CP) sont évalués. Les cellules HUVEC servent de contrôle normal.Résultats: La comparaison sur la base de l’IC50 a montré qu'en présence de BXPC3 ou de MCF7, l'efficacité de l'apixaban a été préservée. Le fondaparinux est plus vulnérable par la présence de cellules cancéreuses. Le FTa et l’asTF sont plus abondants pour les BXPC3 que les cellules MCF7. La GT est médiée plus fortement par le FVII pour les BXPC3 que les MCF7. Le facteur XII était plus important pour la GT médiée par les MCF7. La présence de MPs augmente considérablement la production de thrombine et cet effet est fonction du type de cellules et leur origine.Conclusion: Le type de cellules cancéreuses est déterminant pour l'efficacité anti-thrombotique des inhibiteurs spécifiques du facteur Xa. La GT par les BXPC3 est dominée par la voie du FT. Le rôle du FXII est plus impliqué pour les MCF7. L'hypercoagulabilité induite par les cellules cancéreuses est la résultante de la combinaison des propriétés procoagulantes des cellules cancéreuses elles-mêmes et des éléments procoagulants du microenvironnement. / Aims: study of influence of pancreas adenocarcinoma cells (BXPC3) and human breast carcinoma cells (MCF7) on the antithrombotic efficiency of apixaban, fondaparinux and enoxaparin. Dissection of procoagulant mechanisms of BXPC3 and MCF7.Methods: Cells were cultured and adhered in 96-well plates. Normal platelet poor or rich plasma were spiked whit apixaban, fondaparinux or enoxaparin. Thrombin generation (TG) was done with CAT¨ assay in different conditions. Alternatively spliced TF (asTF), TF activity (TFa) and cancer procoagulant (CP) were assessed. Primary human umbilical vein cells (HUVEC) were used as normal control.Results: Comparison on the basis of IC50 showed that in the presence of BXPC3 or MCF7 the efficiency of apixaban was preserved. Fondaparinux was more vulnerable to the presence of cancer cells. The TFa and asTF were found in abundant amounts in BXCP3 than MCF7 cells. TG enhancement by BXPC3 and MCF7 was mediated by FVII. Factor XII was more important for TG enhancement by MCF7.The presence of MPs drastically increases the generation of thrombin and this effect depending of the type of their original cells.Conclusion: The type of cancer cells is determinant for the antithrombotic efficiency of the specific factor Xa inhibitors. The mechanism of activation of blood coagulation by the BXPC3 is dominated by the TF pathway, MCF7 additionally imply also FXII activation. The hypercoagulability induced by cancer cells is the resultant of the combination of the procoagulant properties of cancer cells with procoagulant elements of the plasma microenvironment and highlight that circulating MVs are key players in the pathogenesis of cancer-associated thrombosis.

L'insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une importante morbidité et mortalité cardio-vasculaire, à laquelle participent la dysfonction endothéliale. Les patients IRC présentent de plus une susceptibilité accrue aux thromboses qu’elles soient veineuses ou artérielles. Les toxines urémiques sont des solutés s'accumulant dans le sérum et les tissus des patients IRC. Parmi elles, les toxines urémiques liées aux protéines ont une toxicité endothéliale démontrée in vitro. Nous avons démontré que l’indoxyl sulfate (IS) et l’indole acetic acide (IAA), deux toxines liées aux protéines provoquent un phénotype pro coagulant de cellules endothéliales en culture via une production accrue de facteur tissulaire (FT). Le facteur tissulaire est un facteur membranaire procoagulant qui initie la cascade de la coagulation en activant le facteur VII via la voie extrinsèque. Nous avons aussi démontré que la production de FT passe par une voie cellulaire préalablement connue pour son implication dans les processus de detoxification : la voie de l’aryl hydrocarbon receptor (AHR). Dans notre travail, nous montrons que l’IS et l’IAA ont un comportement similaire à l’intoxication par la dioxine. Le lien entre FT et AHR n’avait jamais été démontré auparavant. En conclusion, l’IS et l’IAA participent à la dysfonction endothéliale des patients IRC et à la surmortalité cardiovasculaire, en augmentant la production endothéliale de FT et ainsi en provoquant un phénotype pro coagulant des cellules endothéliales. La voie AHR constitue une cible thérapeutique très intéressante dans la problématique de la surmortalité cardiovasculaire des patients IRC. / Chronic kidney disease (CKD) is associated with significant morbidity and cardiovascular mortality, which involves chronic inflammation, oxidative stress and endothelial dysfunction. CKD patients have a higher risk of venous or arterial thrombosis compared to general population. Uremic toxins are molecules that accumulate in the serum and organs of CKD patients. Among them, protein-bound uremic toxins are poorly removed by dialysis, and their endothelial toxicity had been well demonstrated in vitro. In this thesis, we demonstrated that indoxyl sulfate (IS) and indole acetic acid (IAA ), two protein-bound toxins can cause a pro coagulant phenotype of cultured endothelial cells through an increased production of tissue factor (TF ) Tissue factor is a membrane procoagulant factor that initiates the coagulation cascade by activating factor VII via the extrinsic pathway. We also demonstrated that TF increase was produced via a cellular pathway previously known to be involved in the detoxification processes: the aryl hydrocarbon receptor pathway (AHR) . The canonical ligand of AHR is dioxin, well known for its cardiovascular adverse effects. In this work, we showed that IS and IAA had a “dioxin- like effect”. The link between FT and AHR had never been shown earlier. CKD constitutes an endogenous situation similar to dioxin poisoning. In conclusion, the IS and IAA are involved in endothelial dysfunction in CKD patients and cardiovascular mortality by increasing the endothelial production of TF and thus causing a pro- coagulant phenotype of endothelial cells. AHR pathway is a very interesting therapeutic target in the problematic of cardiovascular mortality in CKD patients .

Le cancer colorectal (CRC) est le plus fréquent des cancers digestifs. Cependant, il est moins grave et moins fréquemment associé à une complication thrombo-embolique que le cancer du pancréas (PC). Les microparticules (MPs) sont de petites vésicules produites par bourgeonnement de la membrane cellulaire. Les MPs sont impliquées dans la croissance tumorale, le développement de métastases et l’activité pro-coagulante associée aux cancers. Les objectifs de ces travaux étaient d’identifier et de caractériser les différentes MPs dans le CRC and le PC, afin de décrire une signature microparticulaire, puis d’évaluer leur implication dans la survenue de complications thrombo-emboliques. Nous avons donc rapporté une signature microparticulaire spécifique dans le CRC et le PC par rapport à des pathologies bénignes colorectales et pancréatiques, ainsi que des sujets sains, que nous avons appelé “microparticulosome”. Le microparticulosome se modifie avec l’évolution de la maladie, pour se rapprocher des formes bénignes voire des sujets sains, en cas de rémission du CRC. De plus,il varie en présence ou non d'une complication thrombo-embolique. Nous avons également rapporté le cas d’un cancer du sein diagnostiqué grâce à des taux élevés de MPs exprimant la fibrine. En conclusion, les MPs pourraient constituer de nouveaux bio-marqueurs pertinents en cancérologie, dans le diagnostic, le pronostic de survie et de survenue d’une complication thrombo-embolique. La connaissance des interactions des MPs avec le microenvironnement tumoral permettra de mettre au point des thérapeutiques adaptées et efficaces dans la croissance tumorale et l’extension métastatique. / Colorectal cancer (CRC) is the most common gastrointestinal cancer. It is less serious and less frequently associated with thrombo-embolic event than pancreatic cancer (PC). Microparticles (MPs) are small vesicles produced and released by exocytic blebbing of the activated and apoptotic cell membrane from most, if not all, types of cells. They are known to be implicated in the tumor growth, the development of metastases and the cancer-associated procoagulant activity. Our objectives were to identify and to characterize the different concentrations of circulating MPs in CRC and PC, in order to describe a MPs hallmark, and to evaluate their implication in the occurrence of a venous thromboembolism. We have thus reported a specific hallmark of MPs in CRC and PC, comparing to benign colorectal and pancreatic diseases and healthy subjects, so-called the “microparticulosome”. We have observed that microparticulosome changed with the evolution of the disease, and tended to the signature observed for benign diseases or healthy subject in case of CRC remission. We also reported variations in the microparticulosome in case of an occurrence of a thrombo-embolic event.In conclusion, MPs may constitute new pertinent biomarkers in cancers, in the diagnosis, the survival prognostic and the prognostic of the occurrence of thrombo-embolic events. Understanding the interactions of MPs with tumor environment will allow to find efficient treatments against tumor growth and metastases development.