Das Ziel der Arbeit war eine Charakterisierung der Angiogenese im unveränderten Stutenovar sowie in equinen Granulosazelltumoren (GZTt). In diesem Zusammenhang sollte das Vorkommen und die Bedeutung ausgewählter angiogener Faktoren und ihrer Rezeptoren in den genannten Geweben ermittelt werden. Darüber hinaus war zu klären, inwieweit histomorphologische und immunhistologische Untersuchungen bezüglich der Angiogenese einen Beitrag zur Charakterisierung der biologischen Wertigkeit equiner Granulosazelltumoren liefern können. Für die Untersuchungen standen 71 Granulosazelltumoren 70 einseitig ovariektomierter Tiere und einer euthanasierten Stute, bei der eine ausgedehnte abdominale Metastasierung des Tumors festgestellt wurde, zur Verfügung. Als Kontrolle dienten die unveränderten Ovarien von 20 Stuten (Sektion n=8, Ovariektomie n=2, Schlachthof n=10). Darüber hinaus wurden bei 46 Stuten mit GZTt die Serumhormonwerte (Östradiol, Progesteron und Testosteron) bestimmt. Die unveränderten Ovarien sowie die GZTt wurden zunächst pathologisch-anatomisch untersucht, in Formalin (4%) fixiert und routinemäßig für die Histologie aufgearbeitet. Mittels konventioneller Lichtmikroskopie (Hämalaun-Eosin-Färbung) erfolgte anschließend eine repräsentative Auswahl von verschiedenen Funktionskörpern (n=66) des unveränderten Ovars sowie von GZTt unterschiedlicher Wachstumsformen (n=21 sowie eine Metastase des malignen GZT), an welchen die immunhistolo-gischen Untersuchungen (vascular endothelial growth factor A (VEGF A), vascular endothelial growth factor B (VEGF B), vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGF-R1), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF-R2), Angiopoietin 1 (Ang1), Angiopoietin 2 (Ang2), Angiopoietinre-zeptor (Tie2), von Willebrand Factor) durchgeführt wurden. Es kann festgestellt werden, dass im unveränderten zyklischen Stutenovar die intensivste Koexpression der angiogenen Faktoren VEGF A, VEGF B, Ang1, Ang2 und ihrer Rezeptoren VEGF-R1, VEGF-R2 und Tie2 in den Granulosa- und Thekazellen sowie den vaskulären Strukturen der Thekazellschicht im periovulatorischen (Tertiär-/Graaf´sche Follikel bis Corpora haemorrhagica) Zeitraum, der Phase der am deutlichsten ausgeprägten Angiogenese im Ovar, nachgewiesen werden kann. Zum einen ist dies für die Erhaltung und Reifung eines Follikels bis zum sprungreifen Tertiärfollikel essentiell, zum anderen findet kurz nach der Ovulation eine so ausgeprägte Angiogenese statt, dass schließlich alle Luteinzellen des reifen C. luteum mindestens einen Kontakt zu den neugebildeten Gefäßen besitzen. Somit wird eine optimale Erfüllung der Funktion des C. luteum als temporär endokrine Drüse für die Progesteronsynthese gewährleistet. Im eigenen Untersuchungsgut können hinsichtlich des Expressionsmusters gewisse Ähnlichkeiten zwischen dem unveränderten zyklischen Ovar und den benignen GZTt festgestellt werden. Insbesondere die neoplastischen Granulosazellen und Leydig-like cells erinnern in ihrem Expressionsverhalten bezüglich der untersuchten angiogenen Faktoren/Rezeptoren an die Granulosazellen beziehungsweise die luteinisierten Thekazellen des periovulatorischen zyklischen unveränderten Ovars. Zum einen lassen diese Befunde den Schluss zu, dass die neoplastischen Granulosazellen und Leydig-like cells der untersuchten Tumoren, entsprechend den periovulatorischen Granulosazellen und Thekazellen des zyklischen Ovars, infolge der Expression der angiogenen Faktoren und ihrer Rezeptoren einen wesentlichen Beitrag zur Angiogenese und damit zur Durchblutung, zur Versorgung und zum Wachstum der GZTt leisten. Andererseits kann durch die Ähnlichkeit im Expressionsmuster der genannten Zellen auch mittels der durchgeführten Untersuchungen gezeigt werden, dass es sich bei den equinen Granulosazelltumoren um weitgehend gut differenzierte Neoplasien handelt. Trotzdem ist in Einzelfällen mit einer Metastasierung zu rechnen. Die konventionelle Histopathologie liefert diesbezüglich jedoch keine verwertbaren Anhaltspunkte. Mittels der immunhistologischen Untersuchungen kann aufgezeigt werden, dass zwischen benignen und malignen Granulosazelltumoren partiell ein verändertes Expressionsverhalten bezüglich der untersuchten angiogenen Faktoren und ihrer Rezeptoren existiert. Inwieweit diese Abweichung jedoch als hinweisend für eine potenzielle Malignität interpretiert werden kann, ist aufgrund der zu geringen Probenanzahl maligner Neoplasien abschließend nicht beurteilbar und Bedarf einer Konkretisierung der bisherigen Ergebnisse an einem größeren Untersuchungsgut.

Das Ovarialkarzinom weist von allen gynäkologischen Tumorerkrankungen die höchste Sterblichkeit auf. Die Therapie umfasst eine radikale Operation sowie eine adjuvante, platin-basierte Chemotherapie. Darüber hinaus kommen seit einigen Jahren zielgerichtete Therapien wie der antiangiogenetische Antikörper Bevacizumab oder PARP-Inhibitoren bei Patientinnen mit einer homologen Rekombinationsdefizienz (HRD) zum Einsatz. Trotz dieser neuen Ansätze weisen vor allem Patientinnen mit einem fortgeschrittenen Ovarialkarzinom eine schlechte Prognose auf. Für Bevacizumab konnte zwar eine Verlängerung des progressionsfreien Überlebens nachgewiesen werden, es bleibt jedoch unklar, welche Patientinnen von einer Therapie mit Bevacizumab profitieren. Die Suche nach einem prädiktiven Biomarker für das Ansprechen auf Bevacizumab war Gegenstand verschiedener Studien. Auch wenn einige vielversprechende Ansätze publiziert wurden, konnte bislang keiner dieser Ansätze in der klinischen Praxis etabliert werden. In meiner Arbeit habe ich das molekulare Ziel von Bevacizumab, VEGF‑A, untersucht. VEGF‑A besteht aus verschiedenen Isoformen mit unterschiedlichen pro- und antiangiogenetischen Eigenschaften. Das Gleichgewicht zwischen pro- und antiangiogenetischen VEGF‑A-Isoformen scheint direkt mit der angiogenetischen Aktivität eines Tumor assoziiert zu sein. Daher war mein Ziel, die klinische Relevanz der Isoform VEGF‑A165b in Hinblick auf ihre prognostische Aussagekraft sowie ihr Potenzial als prädiktiver Marker für das Ansprechen auf Bevacizumab zu untersuchen. Die VEGF‑A165b-Expression wurde hierfür mittels Immunhistochemie in formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe von 413 Patientinnen untersucht, welches in Form eines Tissue Microarrays vorlag. Die Patientinnen waren Teil der deutschen Kohorte der internationalen, multizentrischen ICON7-Studie und wurden entweder mit der Standardchemotherapie oder mit der Standardchemotherapie und zusätzlich Bevacizumab behandelt. Die Ergebnisse der Immunhistochemie wurden mittels Lichtmikroskopie beurteilt. Mittels Kaplan-Meier- sowie Cox-Analysen wurde die Assoziation zwischen der VEGF‑A165b-Expressions und dem Ansprechen auf Bevacizumab untersucht. Die Kaplan-Meier- sowie die univariate Cox-Analyse zeigte keinen Unterschied im PFS sowie im Gesamtüberleben (OS) zwischen der Gruppe der Patientinnen mit einer niedrigen und der Gruppe der Patientinnen mit einer hohen VEGF‑A165b-Expression. Dies galt sowohl für die Gesamtkohorte als auch für die beiden Therapiegruppen bei getrennter Analyse. Somit zeigte sich die VEGF‑A165b-Expression als nicht prognostisch relevant in der untersuchten Kohorte. Anschließend erfolgte eine getrennte Analyse der Patientinnen mit einer niedrigen sowie der Patientinnen mit einer hohen VEGF‑A165b-Expression. Für jede der beiden Gruppen wurde das PFS und das OS zwischen den beiden Behandlungsarmen (Standardchemotherapie mit oder ohne Bevacizumab) verglichen. Für die Gruppe der Patientinnen mit einer hohen VEGF‑A165b-Expression konnte in der Kaplan-Meier- sowie der univariaten Cox-Analyse kein signifikanter Einfluss von Bevacizumab auf das PFS (HR: 0,759; 95%KI = 0,530 – 1,089; p = 0,134) oder das OS (HR: 0,898; 95%KI = 0,597 – 1,350; p = 0,606) nachgewiesen werden. Für die Gruppe der Patientinnen mit einer niedrigen VEGF‑A165b-Expression konnte in der univariaten Cox-Analyse eine signifikante Verbesserung sowohl des PFS (HR: 0,727; 95%KI = 0,538 – 0,984; p = 0,039) als auch des OS (HR: 0,662; 95%KI = 0,458 – 0,958; p = 0,029) unter Therapie mit Bevacizumab nachgewiesen werden. In der multivariaten Cox-Analyse erwies sich dieser Effekt sowohl für das PFS (HR: 0,610; 95%KI = 0,446 – 0,834; p = 0,002) als auch für das OS (HR: 0,527; 95%KI = 0,359 – 0,775; p = 0,001) als unabhängig von den etablierten prognostischen Faktoren. Damit zeigt meine Arbeit erstmals, dass die immunhistochemisch detektierte VEGF‑A165b-Expression prädiktiv ist für ein Ansprechen auf Bevacizumab bei Patientinnen mit einem Ovarialkarzinom. Die Ergebnisse stammen aus der retrospektiven Analyse eines umfangreichen Patientinnenkollektivs, welches Teil der internationalen ICON7-Studie war, und sind von hoher klinisch-translationaler Relevanz. Da der immunhistochemische Nachweis von VEGF‑A165b leicht in die pathologische Routinediagnostik zu integrieren ist, könnte dieser neue prädiktive Biomarker bei der Entscheidung helfen, ob eine Behandlung mit Bevacizumab für am Ovarialkarzinom erkrankte Patientinnen infrage kommt. Da der aktuelle Therapiestandard für HRD-positive Patientinnen eine Kombination von Bevacizumab mit einem PARP-Inhibitor vorsieht, ist eine prospektive Validierung der Ergebnisse in einem so behandelten Kollektiv notwendig, um die Relevanz der VEGF‑A165b-Expression als prädiktiver Marker für das Ansprechen auf diese Kombinationstherapie zu evaluieren. / Among female malignancies, ovarian cancer has the highest mortality rate. Therapy comprises radical tumor debulking, followed by adjuvant platinum-based chemotherapy. In recent years, targeted treatment approaches have been integrated into the standard treatment of ovarian cancer, such as the addition of the anti-angiogenic antibody bevacizumab or the addition of PARP inhibitors in patients with homologous repair deficiency (HRD). However, most patients with advanced ovarian cancer continue to face a poor prognosis. Although an improvement in progression-free survival (PFS) has been shown for bevacizumab, it remains hard to predict which patients can profit from an addition of bevacizumab to standard chemotherapy. Several study groups have been looking for a predictive marker for bevacizumab response in ovarian cancer patients. While promising approaches have been suggested, none of these have been implemented into clinical practice. In my thesis, I focussed on the molecular target of bevacizumab, VEGF‑A, which consists of several isoforms with pro- or antiangiogenic properties. It has been proposed that the balance of pro- and antiangiogenic VEGF‑A isoforms is directly linked to the angiogenic activity of a tumor. Therefore, the objective of my thesis was to investigate the clinical relevance of the VEGF‑A165b isoform in ovarian cancer patients with regard to i) its prognostic relevance and ii) its potential to predict response to bevacizumab. Expression of VEGF‑A165b was detected by immunohistochemistry using formalin-fixed paraffin-embedded tissue from 413 patients, arranged in a tissue microarray. The patients were participants in the German contribution to the ICON7 multicenter phase III trial and were each treated with standard platinum-based chemotherapy either with or without bevacizumab. Staining results were evaluated using optical microscopy. Kaplan-Meier analysis and Cox regression analysis were performed in order to explore the association between response to bevacizumab and VEGF‑A165b expression. Kaplan-Meier and univariate Cox regression analysis did not show a difference in PFS and overall survival (OS) between the VEGF‑A165b-low- and the VEGF‑A165b-high-expressing group. This was the case for the overall cohort as well as for both treatment arm groups separately. Thus, VEGF‑A165b expression in itself did not show a prognostic relevance in the study cohort. Subsequently, patients were stratified in a VEGF‑A165b-low- and a VEGF‑A165b-high-expressing group. For each group, PFS and OS were compared between the two treatment arms: standard platinum-based chemotherapy with or without bevacizumab respectively. For VEGF‑A165b-high-expressing patients, Kaplan-Meier and univariate Cox regression analyses did not show a significant effect of bevacizumab on PFS (HR: 0.759; 95%CI = 0.530 – 1.089; p = 0.134) or OS (HR: 0.898; 95%CI = 0.597 – 1.350; p = 0.606). However, for the VEGF‑A165b-low-expressing group, univariate Cox regression analysis showed a significant improvement in PFS (HR: 0.727; 95%CI = 0.538 – 0.984; p = 0.039) and OS (HR: 0.662; 95%CI = 0.458 – 0.958; p = 0.029) under bevacizumab. This effect was independent of established risk factors for both PFS (HR: 0.610; 95%CI = 0.446 – 0.834; p = 0.002) and OS (HR: 0.527; 95%CI = 0.359 – 0.775; p = 0.001). Therefore, the results of my thesis suggest for the first time that VEGF‑A165b protein expression as detected by immunohistochemisty is predictive for response to bevacizumab treatment in ovarian cancer patients. These findings were obtained from a retrospective analysis of a comprehensive patient cohort from an international clinical trial (ICON7) and are of high clinical-translational relevance. Since VEGF‑A165b detection is possible by standard immunohistochemistry, it can be envisioned that this novel predictive biomarker may guide bevacizumab related treatment decisions in ovarian cancer patients. Given the retrospective nature of my approach, a prospective validation of my results will be imperative to determine whether VEGF‑A165b expression also predicts response to combined treatment with beacizumab and PARP inhibitors, which is the new treatment standard for HRD-positive ovarian cancer patients.

Das Kolonkarzinom besitzt aufgrund seiner hohen Inzidenz und der zahlreichen Möglichkeiten, mittels moderner Therapiestrategien auf den Krankheitsverlauf Einfluss zu nehmen, eine hohe Relevanz für den klinischen Alltag. Etwa die Hälfte der an einem kolorektalen Karzinom erkrankten Patienten weisen Lebermetastasen auf, welche entweder bereits bei der primären Diagnosestellung vorliegen oder sich im weiteren Krankheitsverlauf ausbilden. Bei der Mehrzahl der Patienten mit Lebermetastasen ist derzeit nur eine palliative Therapie möglich. Die genaue Analyse kolorektaler Lebermetastasen ist somit unerlässlich, um eine gezielte Entwicklung neuer, effizienter Therapiestrategien für dieses große Patientenkollektiv zu ermöglichen. Ziel dieser Arbeit war es, möglichst genau Zytokinprofil, lymphozytäres Infiltrationsmuster und Verhältnis von pro- zu antiangiogenetischen Faktoren im Lebermetastasengewebe über einen biologisch maßgeblichen Wachstumszeitraum zu charakterisieren, um zu einem besseren Verständnis von Tumorimmunologie und Wachstumsverhalten kolorektaler Lebermetastasen beizutragen. Zu diesem Zweck wurde in einem Mausmodell die Ausbildung kolorektaler Lebermetastasen nach intraportaler Injektion von Tumorzellen (CT26.WT) untersucht. / Because of its high incidence and the numerous therapeutic strategies which allow the clinician to influence the course of the disease colorectal carcinoma figures prominently in the clinical daily routine. About half the patients with colorectal carcinoma suffer from hepatic metastasis, which is either already present at the primary diagnosis or develops later in the course of the disease. At present the majority of patients with hepatic metastasis can only be offered palliative therapy. A detailed analysis of hepatic metastasis is therefore essential for the specific development of new and efficient therapeutic strategies for this group of patients. The objective of this work was to characterize the cytokine profile, the lymphocytic infiltration patterns and the ratio of angiogenic and antangiogenic factors in the tissue of colorectal hepatic metastases as precisely as possible over a biologically significant timespan, thus contributing to a better understanding of tumor immunology and tumor growth. With this aim in view we analyzed the development of colorectal hepatic metastases in a mouse model after the intraportal injection of tumor cells (CT26.WT).

Angiogenese ist entscheidend für die meisten physiologische Prozesse und viele pathologische Umstände. Dabei wird Angiogenese durch die Interaktion zwischen der extrazellulären Matrix (ECM) und endothelialen Zellen reguliert. Während der kardiovaskulären Entwicklung im Zebrafisch fördert Klf2, ein blutstrom-sensitiver Transkriptionsfaktor, die VEGF-abhängige Angiogenese. Der Mechanismus, bei dem biophysikalische Reize die Klf2 Expression regulieren und Angiogenese kontrollieren, ist größtenteils unbekannt. In meiner Studie zeige ich, dass erhöhte klf2 mRNA Expression den molekularen und morphogenetischen kardiovaskulären Defekten in Zebrafisch ccm Mutanten zugrundeliegen. Desweiteren zeige ich, dass diese Defekte durch verstärkte egfl7-Expression und Angiogenese vermittelt werden. Meine Studie zeigt ausserdem, dass die Klf2-Expression unabhängig vom Blutstrom durch den Extrazellularmatrix-bindenden Rezeptor beta1 Integrin reguliert wird. Der CCM-Protein-Komplex, zusammen mit dem ihm verbundenden Integrin-regulierenden Protein ICAP-1 verhindert ein verstärktes Angiogenese-Signal in endothelialen Zellen, indem es die beta1 Integrin-abhängige Klf2 Expression begrenzt. Zusammenfassend zeigt meine Arbeit einen neuen beta1 Integrin-Klf2-Egfl7 Signalweg, der durch zerebrale kavernöse malformations (CCM) Proteine reguliert wird / Angiogenesis is critical to most physiological processes and many pathological conditions. This process is controlled by physical interactions between the extracellular matrix (ECM) and endothelial cells. Klf2, a blood flow–sensitive transcription factor, promotes VEGF-dependent angiogenesis during zebrafish cardiovascular development. However, the mechanism by which biophysical stimuli regulate Klf2 expression and control angiogenesis remains largely unknown. In my study, I show that elevated klf2 mRNA levels underlie the molecular and morphogenetic cardiovascular defects in zebrafish ccm mutants. Furthermore, I demonstrate that these defects are mediated by enhanced egfl7 expression and angiogenesis signaling. My study also revealed that Klf2 expression is regulated by the extracellular matrix-binding receptor beta1 integrin in the absence of blood flow. The CCM protein complex and its associated beta1 integrin-regulatory protein ICAP-1 prevents increased angiogenesis signaling in endothelial cells by limiting beta1 integrin-mediated expression of Klf2. ln sum, my work uncovered a novel beta1 integrin-Klf2-Egfl7 signaling pathway, which is regulated by the cerebral cavernous malformations (CCM) proteins.

Die Blutgefäßentwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, der durch verschiedenste Signalwege und Zellmechanismen bestimmt wird. Murale Zellen sind mit dem Endothel assoziiert und wichtig für die Stabilisierung von Blutgefäßen. Ein essentieller Faktor für die Blutgefäßentwicklung ist die Bestimmung der Zellmigrationsrichtung durch verschiedene Faktoren. Einige dieser Faktoren wurden ursprünglich für die neurale Entwicklung beschrieben. Die Proteinfamilie der Neuron Navigators (NAV) sind neue Akteure, die die Migration von Zellen während des Neuronenwachstums beeinflussen. Ein möglicher Einfluss auf die Blutgefäßentwicklung ist bisher unbekannt. Wir nehmen an, dass das Protein NAV1 in Zellmigrationsprozessen während der Angiogenese eine Rolle spielt und verwendeten zur Aufklärung der Funktion von NAV1 Modelle in der Maus und im Zebrafisch. Das Blutgefäßnetzwerk in der Retina von neonatalen NAV1-/--Mäusen, als auch in einem aortic ring assay zeigte Defekte der Gefäßremodellierung durch eine verringerte Anzahl an Verzweigungspunkten der Blutgefäße auf. Es konnte erstmals eine Expression von NAV1 in muralen Zellen gezeigt werden. Die NAV1-defizienten Mäuse zeigten eine verringerte Anzahl von muralen Zellen auf Blutgefäßen auf. Dieser Defekt ging mit einer verstärkten Regression von Blutgefäßen einher, welche für die geringere Verzweigung dieser verantwortlich sein kann. In vitro Experimente mit primären muralen Zellen deuten auf einen zellautonomen Einfluss von NAV1 auf die Bewegung von Zellen in Abhängigkeit von Netrin-1 und der extrazelluären Matrixkomponente Kollagen I hin. Nav1-depletierte Zebrafische wiesen eine verringerte Komplexität von bestimmten zerebralen Blutgefäßen auf. Dies deutet darauf hin, dass der Einfluss von Nav1 auf die Blutgefäßausbildung konserviert ist. Wir konnten NAV1 als einen neuen zelleigenen Faktor der Motilität von muralen Zellen identifizieren, der in Folge als positiver Modulator zur Regulation der Gefäßstrukturierung beiträgt. / Vessel development is a multistep process orchestrated by different cellular and signaling mechanisms. Mural cells are associated with the endothelium and thought to be important for vessel stabilization. Cell guidance is an essential factor during vascular development, accomplished by different attractive and repulsive factors. Some of these were originally described in neural development. The Neuron Navigator (NAV) protein family is a novel player in regulating cell migration events during neuron growth, but their potential impact in vessel development is unknown. We hypothesized that the family member NAV1 plays a role in cell migration events during angiogenesis and examined the function of NAV1 in vascular development using loss-of-function models in mouse and zebrafish. Analysis of the vessel network phenotype in neonatal retina and an aortic ring assay of NAV1-/--mice revealed defective vessel remodeling in the absence of NAV1, indicated by reduced branch point numbers of vessels. Characterization of cellular expression domains point to a prominent, so far unknown, NAV1 expression in mural cells and NAV1-knockout mice exhibited reduced mural cell numbers on vessels. Decreased mural cell recruitment accompanies with increased vessel regression in the retina that may be attributable for the vascular phenotype. In vitro data of primary mural cells indicate a cell-autonomous influence of NAV1 on cell locomotion in response to Netrin-1 and/or the extracellular matrix component Collagen I. Analysis of Nav1 depleted zebrafish embryos revealed less complex vessel networks of specific cerebral vessels, the central arteries, suggesting that the impact of Nav1 on vessel development is conserved in vertebrates.

Im Fokus der Dissertation stand die Evaluierung molekularer Möglichkeiten zur Findung geeigneter Biomarker für das Prostatakarzinom (PCa). Zunächst wurde die epigenetische Promotormethylierung der Gene GSTP1, RARbeta2, APC und PITX2 im Hinblick eines möglichen Methylierungsfeldeffektes untersucht. Die RARβ2-Promotormethylierung konnte als potentieller Marker zur Tumorvorhersage im histologisch normal erscheinenden Gewebe bestimmt werden. GSTP1 zeigte eine äußerst spezifische Tumormethylierung, was dessen diagnostisches Potenzial unterstreicht. Die Methylierung korrelierte zudem mit pathologischen Parametern. Ein Screening im Array-Format identifizierte weitere Gene, deren Promotormethylierung diagnostisch interessant sein könnten. Des Weiteren wurden Genexpressionsanalysen angiogenetischer und Endothel-assoziierter Faktoren durchgeführt, deren diagnostische und prognostische Aussagekraft für das PCa ermittelt wurden. Dabei konnte für Caveolin-1 (CAV1) eine signifikante Herunterregulierung der mRNA-Menge im Tumor gezeigt werden. Die Bisulfit-Sequenzierung von sieben CpG-Dinukleotiden im CAV1-Promotor ergab zwischen Tumor- und tumorangrenzendem Gewebe differenzielle Methylierungsmuster, die zu einer verminderten CAV1-Transkription führen könnten. Zudem führte eine 5-Aza-2-desoxycytidin-Behandlung der CAV1-defizienten LNCaP-Zelllinie zur Reexpression. Weiterhin assoziierte CAV1 invers mit pathologischen Parametern und zeigte prognostische und diagnostische Relevanz. Immunhistologisch wurde CAV1 z.T. deutlich verringert in Endothelzellen und Fibroblasten des Tumors nachgewiesen. Ko-Kultivierungsversuche von HUVEC mit konditionierten Zellmedien ergaben z.T. signifikant reduzierte CAV1-Mengen in HUVEC. Die Ergebnisse zeigen, dass epigenetische Veränderungen wertvolle Informationen zur Diagnostik, Prognostik und Progression des PCa liefern. Zudem konnte CAV1 als potentieller Marker des PCa identifiziert werden. / The focus of the thesis was to evaluate molecular possibilities to find suitable biomarkers for prostate cancer (PCa). First, the epigenetic promoter methylation patterns of several genes (GSTP1, RARbeta2, APC and PITX2, respectively) were investigated for a possible methylation field effect. The RARbeta2 promoter methylation could be determined as a possible marker for tumor prediction in histologically normal-appearing tissue. GSTP1 showed a highly specific tumor methylation, underlining its diagnostic potential. The methylation also correlated with pathological parameters. Screening in an array format identified other genes whose promoter hypermethylation could be diagnostically interesting. Furthermore, gene expression analysis of angiogenic and endothelial-associated factors was performed to determine their diagnostic and prognostic potentials for PCa. For CAV1, a significant down-regulation of its mRNA level could be determined in the tumor. Bisulfite sequencing of seven CpG dinucleotides in the CAV1 promoter showed different methylation patterns between tumor and tumor adjacent tissue that could cause a reduced transcription. Furthermore, treatment of the CAV1-deficient LNCaP cell line with 5-aza-2-deoxycytidine led to CAV1 reexpression. Additionally, CAV1 inversely associated with pathological parameters and showed prognostic and diagnostic relevance. Immunohistochemical analysis clearly demonstrated decreases in CAV1 protein expression in endothelial cells and fibroblasts of the tumor. Conditioned media of cultivated tumor cells partly induced downregulation of the CAV1 protein level in HUVEC. The results show that epigenetic and angiogenic processes play crucial roles and provide valuable information for diagnosis, prognosis and progression of PCa. Moreover, CAV1 could be identified as a potential marker of prostate cancer.

O ultra-som terapêutico é um recurso físico muito empregado como coadjuvante na promoção do reparo tecidual. Neste trabalho, foi estudada a influência do ultra-som terapêutico na integração dos enxertos de pele total num modelo experimental em coelhos. Foram utilizados 20 coelhos adultos, fêmeas, nos quais foram realizadas cirurgias de enxerto autógeno de pele total nas regiões escapulares, pela ressecção de dois retalhos quadrados de pele de 2 cm de lado, invertendo sua posição, o enxerto retirado do lado direito sendo colocado na área receptora esquerda e vice-versa. O enxerto do lado direito era submetido ao tratamento efetivo com o ultra-som (3 MHz, 0,5 W/cm2, 5 minutos) e o enxerto do lado esquerdo, a tratamento placebo, iniciado no 3o dia pós-operatório e aplicado diariamente por sete dias. Os animais eram sacrificados no 11o dia pós-operatório e os enxertos, ressecados com uma margem de segurança, para análise histopatológica, com cortes de 5 µm. Foram obtidos cortes histológicos corados com técnicas específicas (Tricrômico de Gomori, PCNA e Picrosirius) e analisados ao microscópio de luz, sendo realizada a contagem das células em proliferação e dos vasos neoformados e a morfometria das áreas da epiderme e derme. Os resultados mostraram um significativo aumento no número de células em proliferação na epiderme e vasos neoformados na camada reticular da derme, mas isto não implicou em uma diferença entre as áreas da epiderme e derme, nos enxertos irradiados e não irradiados. Concluímos que o ultra-som terapêutico induz alterações morfológicas nos processos biológicos, como proliferação celular da camada germinativa da epiderme e neoangiogênese, envolvidos na integração de enxertos de pele total, com um potencial de aplicação clínica em humanos. / Therapeutic ultrasound is a widely used co-adjuvant physical mean to promote tissue repair. In the present investigation, the influence of therapeutic ultrasound on the integration of full-thickness skin graft was studied in rabbits. Twenty female adult rabbits were used, two 2x2 cm square-shaped full-thickness skin grafts being obtained from both scapular regions and swapped, the one cut out on the right being placed on the left and vice-versa. The graft on the right was effectively irradiated with the therapeutic ultrasound (3 MHz, 0,5 W/cm2, 5 minutes) for seven days beginning on the third postoperative day. The graft on the left was submitted to a sham irradiation. The animals were killed on the 11th day and the grafted areas were resected (graft + safety margin) for histologic examination by means of 5 µm-thick sections alternatively stained with Gomori's trichrome, PCNA and Picrosirius and examined on the light microscope. Eider proliferating cells and new blood vessels were counted, as well as the epidermic and dermic areas were measured. The results showed a significant increase in the number of epidermic proliferating cells and new blood vessels, but this did not imply any difference between the epidermic and dermic areas between irradiated and non-irradiated grafts. We conclude that the therapeutic ultrasound induces morphologic alterations in the biologic processes, as epidermic germinative layer cell proliferation and neo-angiogenesis, involved in the integration of full-thickness skin grafts and this has a potential for clinical use in humans.

3-bromophenyl 6-acetoxymethyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-carboxylate (IK9) was recently reported to be a potent inhibitor of cancer cell invasion and angiogenesis. It markedly reduced in vitro invasion of human HT1080 fibrosarcoma cells through collagen-coated porous membranes (Boyden chamber assay) and in vivo tumour growth in athymic nude mice. It was furthermore able to decrease angiogenesis ex vivo in a rat aortic ring assay and in vivo in a choroidal neovascularisation mice model. It nevertheless presents some water solubility and stability problems, which should be taken into account for further investigations. In the first part of the project, we synthesized original IK9 derivatives, modulated at the 3- and 6-positions, by introducing functional groups able to improve water solubility and metabolic stability. Their anti-invasive potency was screened in the Boyden chamber assay and the generated results highlighted some structure-activity relationships. A second part of the project was devoted to the elucidation of the actually unknown mechanism of action of IK9. Anti-invasive or anti-proliferative effects against endothelial cells, main actors of the angiogenic process, were not emphasised. We showed that IK9 acts likely not as an inhibitor of receptor tyrosine kinases (EGFR, PDGFR and VEGFR). The compound generates a weak decrease of mRNA coding for metalloproteinases (MMPs) 2 and 9, and on the other hand a substantial diminution of MMP 2 and 9 secretions by HT1080 fibrosarcoma cells. In conclusion, the consideration of anti-invasive properties together with the worked out solubility and stability profiles highlights several series, notably 6-hydroxycoumarins, 6-hydroxymethylcoumarins and coumarin-3-sulfonamides, whose interest as potential successors to IK9 is undeniable. Le 6-acétoxyméthyl-2-oxo-2H-1-benzopyrane-3-carboxylate de 3-bromophényle (IK9) est un dérivé coumarinique décrit comme inhibiteur puissant de linvasion tumorale et de langiogenèse. Il inhibe linvasion des cellules HT1080 de fibrosarcome humain in vitro à travers une membrane poreuse recouverte dune couche de collagène (test en « chambres de Boyden ») et la croissance tumorale in vivo chez des souris athymiques nues. Il est par ailleurs capable de bloquer langiogenèse, à la fois dans un modèle ex vivo danneaux daorte de rats et dans un modèle in vivo de néovascularisation choroïdale chez la souris. Il présente pour autant une problématique dhydrosolubilité et de stabilité, dont il faudra tenir compte lors dinvestigations futures. Dans une première partie du projet, nous avons synthétisé des dérivés originaux de lIK9, modulés en position 3 et 6 du noyau coumarinique, en introduisant des fonctions susceptibles daugmenter lhydrosolubilité et la stabilité métabolique des molécules obtenues. Leur pouvoir anti-invasif a été évalué dans le test en « chambres de Boyden », ce qui nous a permis de mettre en évidence différentes relations structure-activité. Une deuxième partie du projet fut consacrée à létude du mécanisme daction de lIK9, qui est non identifié jusquà présent. Un effet anti-invasif ou anti-prolifératif envers les cellules endothéliales, actrices principales du processus dangiogenèse, na pu être observé. LIK9 nagit vraisemblablement pas en tant quinhibiteur de plusieurs récepteurs de type tyrosine kinase (EGFR, PDGFR et VEGFR). Le composé engendre une légère baisse de lexpression de lARNm codant pour les métalloprotéases matricielles (MMPs) 2 et 9 mais par contre entraîne une diminution substantielle de la sécrétion des MMPs 2 et 9 par les cellules HT1080 de fibrosarcome humain. En conclusion, la prise en compte simultanée de lactivité anti-invasive, de lhydrosolubilité et de la stabilité met en avant plusieurs séries de dérivés, notamment des 6-hydroxycoumarines, des 6-hydroxyméthylcoumarines et des coumarine-3-sulfonamides, dont lintérêt en tant que successeurs potentiels de lIK9 est indéniable.

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Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Paulo Roberto de M Reis.pdf: 1933722 bytes, checksum: 7d817f5376870e9e403094af501ffaa7 (MD5) Previous issue date: 2009-11-27 / Synadenium umbellatum Pax (1894) is a vegetable species from Euphorbiaceae‟s family. The species of this family produce latex. The latex extracted from S. umbellatum has been used by the Brazilian people as anti-tumoral, anti-inflammatory and wound healing agents. However, this latex presents toxic substances and proteolic enzymes. The aim of this work was to evaluate the possible genotoxic, antigenotoxic, cytotoxic, angiogenic and wound healing activities of S. umbellatum latex (SuL) in rats. The genotoxic and antigenotoxic activities were evaluated by mouse bone marrow micronucleus test. An alkylant agent mitomycin C (4 mg.kg-1 body weight) was used as a positive control. For all doses, micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) frequency was evaluated after 24 hours of treatment. To evaluate the antimutagenic activity, animals were treated with 10, 30, 50 and 100 mg.kg-1 and 4 mg. kg-1 of mitomycin C (MMC) simultaneously. The frequency of MNPCE was evaluated 24 hours after exposure. Cytotoxicity was evaluated by the polychromatic and normochromatic erythrocytes ratio (PCE/NCE). Angiogenic activity of the SuL was evaluated in chorioallantoic membrane (CAM) of fertilized chicken eggs. The concentrations of the SuL were of 10 and 20 mg/mL. Wound healing activity was evaluated in skin of rats. The skin fragment was removed with area 3 x 2,5 cm and submitted to topic application with 5 mL of SuL (concentration 10 mg/mL) and positive and negative controls. The results showed that the SuL was strongly mutagenic, cytotoxic, and antimutagenic, and a moderate activity of anticytotoxicity. In the evaluation of the angiogenesis, the SuL has promoted the increase of the proliferation of blood vessels in the chorioallantoic membrane of fertilized chicken eggs and it also induced the increase of velocity of wound healing in rat skin lesion. / A espécie vegetal Synadenium umbellatum Pax (1894), conhecida vulgarmente por cola-nota, pertencente à família das Euphorbiaceae e apresenta uma seiva leitosa conhecida por látex. Na medicina popular o látex extraído do gênero Synadenium apresenta substâncias tóxicas e enzimas proteolíticas. Devido ao uso popular do látex dessa planta como antiinflamatório, cicatrizante, antineoplásico e outros, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade genotóxica, antigenotóxica, citotóxica, angiogênica e o potencial de indução de cicatrização do látex da Synadenium umbellatum (SuL). Na avaliação da atividade genotóxica e antigenotóxica utilizou-se o Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos. Um agente alquilante, mitomicina C, foi utilizado como controle positivo. Na avaliação da atividade angiogênica, o ensaio utilizado foi a membrana corio-alantóidea do ovo embrionado de galinha e no estudo da cicatrização em feridas limpas em dorso de rato foi medida a velocidade de cicatrização da ferida do grupo tratado com SuL e dos grupos controles. Para o teste do micronúcleo, os animais foram tratados com diferentes doses (10, 30, 50, e 100 mg.kg-1 ) do SuL, via intraperitoneal. Para o teste de antimutagenicidade, os animais foram tratados com as mesmas doses utilizadas na avaliação da mutagenicidade juntamente com uma dose única de Mitomicina C (4 mg.Kg-1). Para o teste da angiogênese utilizou-se a membrana corio-alantóide do ovo embrionado de galinha e as concentrações utilizadas do látex foram de 10 e 20 mg/mL. Para o estudo da cicatrização foi utilizada a técnica de feridas limpas em dorso de ratos que foram submetidos a uma lesão padronizada na pele de 3 x 2,5 cm e posteriormente tratados com 5 mL do SuL, na concentração de 10 mg/mL, como controle positivo utilizou-se a biomembrana de látex da Hevea brasiliensis e controle negativo, a salina 0,9%. Foram avaliadas a velocidade de cicatrização do SuL e controles negativo e positivo. Os resultados mostraram que o látex da S. umbellatum foi altamente mutagênico, citotóxico, e antimutagênico e uma ação moderada de anticitotoxicidade. Na avaliação da atividade angiogênica, o látex promoveu um aumento na proliferação de vasos sangüíneos na membrana corio-alantóidea do ovo embrionado de galinha e também induziu um aumento na velocidade de cicatrização nas feridas limpa na pele do dorso de ratos.