Aims Cardiac dysfunction is a critical manifestation of severe sepsis/septic shock and is responsible for high mortality due to sepsis. Recent evidence suggests that angiogenic factors have a protective effect on sepsis-induced organ damage. Heat shock protein A12B (HSPA12B) is a newly discovered gene that is essential for angiogenesis. We hypothesized that overexpression of HSPA12B would induce protection against endotoxin-induced cardiac dysfunction.Methods and results To evaluate this hypothesis, we generated transgenic mice overexpressing the human hspa12b gene (Tg). Wild-type (WT) littermates served as controls. Tg and WT mice were treated with lipopolysaccharide (LPS) and cardiac function was measured after 6 h. LPS treatment caused cardiac dysfunction in WT mice. In contrast, cardiac function was significantly preserved in Tg mice following LPS administration. LPS increased the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)/intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and leucocyte infiltration into the myocardium of WT mice. In Tg mice, LPS-increased VCAM-1/ICAM-1 expression and leucocyte infiltration were significantly attenuated. Overexpression of HSPA12B also prevented the decrement in the activation of phosphatidlyinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signalling in the myocardium. Importantly, PI3K inhibition with Wortmannin abolished the protection of HSPA12B against LPS-induced cardiac dysfunction. Conclusion These results suggest that HSPA12B plays an important role in the attenuation of endotoxin-induced cardiac dysfunction and that the mechanisms involve the preserved activation of PI3K/Akt signalling, resulting in attenuation of LPS-increased expression of VCAM-1/ICAM-1 and leucocyte infiltration into the myocardium.

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L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire existant. C’est un phénomène essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. L’activation des cellules endothéliales est contrôlée par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son récepteur le VEGFR-2 ont été prouvés comme étant spécifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le récepteur auquel se lie l’Ang-1, est requis aussi bien dans le développement vasculaire que dans l’angiogenèse tumorale. Il est connu que l’activation de Tie2 est nécessaire à la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la perméabilité vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premièrement découvert que le facteur de croissance pro-angiogénique, l’Ang-1 contrecarre les effets de perméabilité cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothéliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de l’activité de l’enzyme eNOS. Suite à l’activation de Tie2 par l’Ang-1, eNOS devient fortement phosphorylé sur la Thr497 après la phosphorylation et l’activation de la PKCζ. Nos résultats suggèrent que l’inhibition, par Tie2, de la perméabilité vasculaire durant l’angiogenèse serait due, en partie, à l’inhibition de la production de NO. Deuxièmement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothéliale induits par l’Ang-1 et le VEGF. À l’opposé du VEGF qui promeut une migration individuelle aléatoire, l’Ang-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette étude, nous avons identifié la β-caténine comme un nouveau partenaire moléculaire de la PKCζ. Cette association de la PKCζ à la β-caténine amène le complexe de polarité Par6-aPKC et le complexe des jonctions d’adhérences cellulaires à interagir ensemble à deux localisations différentes au niveau de la cellule endothéliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKCζ/β-caténine maintien la cohésion et l’adhésion cellulaire nécessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothéliales afin d’assurer la directionalité et la persistance de la migration endothéliale en réponse à l’Ang-1. D’une manière intéressante, lors de l’inhibition de la PKCζ ou de la β-caténine on assiste à un changement du mode de migration en réponse à l’Ang-1 qui passe d’une migration directionnelle collective à une migration individuelle aléatoire. Ce dernier mode de migration est similaire à celui observé chez des cellules endothéliales exposées au VEGF. Ces résultats ont été corroborés in vivo par une polarité et une adhésion défectueuses au cours de la vasculogenèse chez le poisson zèbre déficient en PKCζ. En résumé, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les réponses biologiques endothéliales déclenchées par le VEGF/VEGFR-2. L’identification des mécanismes moléculaires en aval de ces deux récepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la compréhension des différentes voies de signalisation activées par ces complexes moléculaires nous permettra de mettre la lumière sur des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies angiogéniques. / Angiogenesis is the formation of new blood vessels from a pre-existing vascular network. It is an essential mechanism for many physiological and pathological conditions. Also, the general mechanism in both conditions remains the same. VEGF and its receptor VEGFR-2 have been proven to be specific and critical for blood vessel formation. The Angiopoietin-1 receptor, Tie2, is required for vascular development as well as in tumor angiogenesis. It is known that the activation of Tie2 is required for vascular stabilization by inhibiting vascular permeability induced by VEGFR-2. First, we found that the pro-angiogenic growth factor, Ang-1 counteracts the effects of VEGF-induced permeability by inhibiting NO production by endothelial cells. This inhibitory effect of Tie2 acts directly on eNOS activity. Following activation of Tie2 by Ang-1, eNOS becomes highly phosphorylated on the inhibitory site, the Thr497, following PKCζ phosphorylation and activation. Our results suggest that the inhibition by Tie2 of vascular permeability during angiogenesis is due, in part, to the inhibition of NO production. In our second study we distinguished between two types of endothelial cell migration induced by Ang-1 and VEGF. At the opposite of Ang-1 that induced collective and directional cell migration, VEGF promoted individual and random cell motility. We identified β-catenin as a new molecular partner of PKCζ. This association of PKCζ with β-catenin brings the Par6-aPKC polarity complex and the adherens junctions complex to interact with each other at two different locations in endothelial cells. PKCζ/β-catenin complex is located specifically at cell-cell contacts to maintain cohesion and cell adhesion necessary for the collective migration process. This complex was located also at the leading edge of endothelial cells during migration to ensure the directionality and the persistence of migration in response to Ang-1. In addition, inhibition of PKCζ or β-catenin switched the migration mode, in response to Ang-1, from directional and collective to a more random and individual cell migration which resembles the type of migration of endothelial cells exposed to VEGF. These results were confirmed in vivo by aberrant cell polarity and cell adhesion defects of tip cell during vascular sprouting of intersegmental vessels in PKCζ deficient zebrafish embryos. In summary, Ang-1/Tie2 modulates endothelial cell signaling and biological responses induced by VEGF/VEGFR-2. The identification of molecular mechanisms involved in the action of these two receptors, VEGFR-2 and Tie2, and the understanding of the different signaling pathways activated by these molecular complexes will allow us to identify new therapeutic targets for the treatment of angiogenic diseases treatment.

L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire existant. C’est un phénomène essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. L’activation des cellules endothéliales est contrôlée par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son récepteur le VEGFR-2 ont été prouvés comme étant spécifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le récepteur auquel se lie l’Ang-1, est requis aussi bien dans le développement vasculaire que dans l’angiogenèse tumorale. Il est connu que l’activation de Tie2 est nécessaire à la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la perméabilité vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premièrement découvert que le facteur de croissance pro-angiogénique, l’Ang-1 contrecarre les effets de perméabilité cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothéliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de l’activité de l’enzyme eNOS. Suite à l’activation de Tie2 par l’Ang-1, eNOS devient fortement phosphorylé sur la Thr497 après la phosphorylation et l’activation de la PKCζ. Nos résultats suggèrent que l’inhibition, par Tie2, de la perméabilité vasculaire durant l’angiogenèse serait due, en partie, à l’inhibition de la production de NO. Deuxièmement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothéliale induits par l’Ang-1 et le VEGF. À l’opposé du VEGF qui promeut une migration individuelle aléatoire, l’Ang-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette étude, nous avons identifié la β-caténine comme un nouveau partenaire moléculaire de la PKCζ. Cette association de la PKCζ à la β-caténine amène le complexe de polarité Par6-aPKC et le complexe des jonctions d’adhérences cellulaires à interagir ensemble à deux localisations différentes au niveau de la cellule endothéliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKCζ/β-caténine maintien la cohésion et l’adhésion cellulaire nécessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothéliales afin d’assurer la directionalité et la persistance de la migration endothéliale en réponse à l’Ang-1. D’une manière intéressante, lors de l’inhibition de la PKCζ ou de la β-caténine on assiste à un changement du mode de migration en réponse à l’Ang-1 qui passe d’une migration directionnelle collective à une migration individuelle aléatoire. Ce dernier mode de migration est similaire à celui observé chez des cellules endothéliales exposées au VEGF. Ces résultats ont été corroborés in vivo par une polarité et une adhésion défectueuses au cours de la vasculogenèse chez le poisson zèbre déficient en PKCζ. En résumé, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les réponses biologiques endothéliales déclenchées par le VEGF/VEGFR-2. L’identification des mécanismes moléculaires en aval de ces deux récepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la compréhension des différentes voies de signalisation activées par ces complexes moléculaires nous permettra de mettre la lumière sur des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies angiogéniques. / Angiogenesis is the formation of new blood vessels from a pre-existing vascular network. It is an essential mechanism for many physiological and pathological conditions. Also, the general mechanism in both conditions remains the same. VEGF and its receptor VEGFR-2 have been proven to be specific and critical for blood vessel formation. The Angiopoietin-1 receptor, Tie2, is required for vascular development as well as in tumor angiogenesis. It is known that the activation of Tie2 is required for vascular stabilization by inhibiting vascular permeability induced by VEGFR-2. First, we found that the pro-angiogenic growth factor, Ang-1 counteracts the effects of VEGF-induced permeability by inhibiting NO production by endothelial cells. This inhibitory effect of Tie2 acts directly on eNOS activity. Following activation of Tie2 by Ang-1, eNOS becomes highly phosphorylated on the inhibitory site, the Thr497, following PKCζ phosphorylation and activation. Our results suggest that the inhibition by Tie2 of vascular permeability during angiogenesis is due, in part, to the inhibition of NO production. In our second study we distinguished between two types of endothelial cell migration induced by Ang-1 and VEGF. At the opposite of Ang-1 that induced collective and directional cell migration, VEGF promoted individual and random cell motility. We identified β-catenin as a new molecular partner of PKCζ. This association of PKCζ with β-catenin brings the Par6-aPKC polarity complex and the adherens junctions complex to interact with each other at two different locations in endothelial cells. PKCζ/β-catenin complex is located specifically at cell-cell contacts to maintain cohesion and cell adhesion necessary for the collective migration process. This complex was located also at the leading edge of endothelial cells during migration to ensure the directionality and the persistence of migration in response to Ang-1. In addition, inhibition of PKCζ or β-catenin switched the migration mode, in response to Ang-1, from directional and collective to a more random and individual cell migration which resembles the type of migration of endothelial cells exposed to VEGF. These results were confirmed in vivo by aberrant cell polarity and cell adhesion defects of tip cell during vascular sprouting of intersegmental vessels in PKCζ deficient zebrafish embryos. In summary, Ang-1/Tie2 modulates endothelial cell signaling and biological responses induced by VEGF/VEGFR-2. The identification of molecular mechanisms involved in the action of these two receptors, VEGFR-2 and Tie2, and the understanding of the different signaling pathways activated by these molecular complexes will allow us to identify new therapeutic targets for the treatment of angiogenic diseases treatment.

Abstract Angiopoietins 1 and 2 (Ang1 and Ang2) are the ligands of the Angiopoietin/Tie signalling system, which is a binary pathway offering mechanisms for healthy vessels to reach and maintain their quiescence but also to rapidly respond to activating stimuli leading to a remodelling of endothelium. The latter is linked to disease settings such as inflammation and cancer where endothelial cell (EC) integrity is compromised and is often related to an increase in Ang2 expression. This study focused on the mechanisms enabling Ang1 to mediate both EC stability and migration and molecular and cellular determinants for ligand-specific functions of Ang2 and its isoform Ang2443. The findings revealed that Ang1 induces differential signalling depending on whether it anchors and activates Tie2 in cell-cell junctions in quiescent ECs, or in cell-matrix contacts in mobile ECs, thus leading to cellular phenotypes characteristic of resting and mobile ECs, respectively. In the second part of the thesis Ang2-Tie2 specific cell-extracellular matrix (ECM) contact sites were studied. Formation of Ang2/Tie2 EC-ECM contact sites was dependent on the collagen I and IV matrices, low Ang2 oligomerization state, α2β1-integrins, and intact microtubules. In the third part of the thesis the comparison of Ang2 mRNA splice variant Ang2443 with full length Ang2 (Ang2FL) revealed both redundant and ligand form–specific effects, expression of Ang2443443 increased the amount of monomeric ligand forms due to proteolytic processing and promoted transendothelial migration of cancer cells in vitro. On the other hand, both Ang2443 and Ang2FL were stored in endothelial Weibel-Palade bodies (WPBs), similarly induced Ang2-specific Tie2 cellular redistribution, and were mostly comparable in developmental angio- and lymphangiogenesis. / Tiivistelmä Angiopoietiinit 1 ja 2 (Ang1 ja Ang2) ovat Ang/Tie signalointireitin kasvutekijöitä. Ang1 kasvutekijää tarvitaan sydämen ja verisuoniston sikiöaikaiseen kehittymiseen, se vähentää Tie2 reseptorin kautta verisuonten läpäisevyyttä, mutta edistää myös yksittäisten endoteelisolujen liikkumista. Saman Tie2 signalointireitin toisen kasvutekijän Ang2:n ilmeneminen johtaa verisuonten läpäisevyyden kasvuun tulehduksessa, uusien verisuonten muodostumiseen syöpäkasvaimissa ja syöpäsolujen leviämiseen elimistössä. Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin niitä solutason mekanismeja, joilla Ang1 kykenee välittämään sekä endoteelisolujen tiiviyttä että liikkumista. Lisäksi tutkittiin niitä molekyyli- ja solutason mekanismeja, joilla Ang2 ja sen isomuoto Ang2443 välittävät kasvutekijäspesifisiä vaikutuksiaan. Väitöskirjassa osoitettiin että Tie2 reseptori paikantuu verisuonten endoteelisoluissa Ang1 sitoutumisen seurauksena joko solu-soluliitoksiin, tai yksittäisissä endoteelisoluissa solu-soluväliaine rajapinnalle. Tie2:n siirtyminen solu-soluliitoksiin aktivoi soluissa signalointireittejä, jotka ovat tyypillisiä normaaleille tiiviille verisuonille ja solu-soluväliaineliitoksissa liikkuville endoteelisoluille tyypillisiä piirteitä. Väitöskirjatyön toisessa osassa tutkittiin Ang2:lle ominaisia vaikutuksia ja Ang2-Tie2 kompleksin paikantumista erityisiin solu-soluväliaineliitoksiin. Tämä oli riippuvaista Ang2:n oligomerisaatiosta, kollageenisoluväliaineesta, α2β1-integriinistä ja normaalista mikrotubulusverkostosta. Väitöskirjatyön kolmannessa osassa osoitettiin että Ang2443 isomuodolla on sekä yhteisiä että isomuotospesifisiä piirteitä verrattuna kokopitkään Ang2:een (Ang2FL). Liukoinen Ang2443, mutta ei Ang2FL, esiintyi yleisesti monomeerisenä ligandimuotona proteiinin multimerisaatio-osan pilkkomisen seurauksena. Ang2443 lisäsi myös syöpäsolujen liikkumista endoteelisolujen läpi. Toisaalta sekä Ang2443 että Ang2FL varastoitiin endoteelisoluissa Weibel-Palade varastokappaleisin, ne välittivät samanlaista Tie2 reseptorin paikantumista endoteelisoluissa ja toimivat pääsääntöisesti samanlaisina kasvutekijöinä veri- ja imusuonten kehityksen aikana hiiressä.