Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-19. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:03Z : No. of bitstreams: 1 000850429.pdf: 596545 bytes, checksum: 6e5f34f97334f6e8b44f850f7ebd38bb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivou-se estudar comparativamente os efeitos da administração seriada de 100μg de deslorelina por via intramuscular frente ao implante de liberação continuada de deslorelina (4,7mg), sobre a supressão temporária do crescimento folicular ovariano em ovelhas Bergamácia, visando a aplicação em biotecnologias do controle da ovulação. Após um período de adaptação e monitoramento da ciclicidade, as ovelhas tiveram o estro sincronizado pelo emprego de dispositivo intravaginal Eazi-Breed CIDR®, (0,33g de progesterona) de segundo uso, por 12 dias e administração única, pela via intramuscular, de 350UI de eCG concomitantemente à retirada do dispositivo. Foram coletadas amostras de sangue para confirmação da ovulação e ciclicidade através da quantificação de progesterona no plasma sendo considerados animais com atividade lútea aqueles que apresentaram valores igual ou superior a 1ng/mL. Decorridos seis dias da ovulação, as fêmeas foram então divididas em quatro grupos: G0 (Controle): animais sem tratamento; G1 (DES 48h); animais submetidos a aplicações intramusculares de 100μg de deslorelina a cada 48 horas durante sete dias; G2 (DES 72h): animais submetidos a aplicações intramusculares de 100μg de deslorelina a cada 72 horas durante sete dias; e G3 (Implante): animais com implante subcutâneo contendo 4,7mg de deslorelina que permaneceu por sete dias. Durante o período de tratamento específico de cada um dos grupos (sete dias), os animais tiveram os ovários monitorados ultrassonograficamente uma vez ao dia para a constatação da supressão do crescimento folicular, sendo os folículos presentes nos ovários classificados em pequenos, com diâmetro de 2 a 2,9mm, médios, com diâmetro de 3 a 4,4mm e grandes, com diâmetro ≥4,5mm. O monitoramento ultrassonográfico ovariano foi mantido após o término dos tratamentos, até que 100% das ovelhas retomasse a atividade de crescimento folicular. A população... / The objective is to comparatively study the 100μg deslorelin serial administration effects front implantation of sustained release deslorelin (4.7 mg) on the temporary suppression of ovarian follicular growth in Bergamacia ewe aiming the application in biotechnology for the control of ovulation. After an adaptation period and monitoring of cyclicity, they had estrus synchronized with the second use intravaginal device Eazi-Breed CIDR® (0.33g progesterone) for 12 days and a single intramuscular injection, of eCG 350UI concurrently with the removal of the device. Blood samples were collected for confirmation of ovulation and cyclicality by measuring plasma progesterone being considered with luteal activity those animals with values equal or higher than 1 ng / mL. Elapsed six days of ovulation females was then be randomly divided into four groups: G0 (Control): untreated animals; G1 (DES 48h); animals subjected to intramuscular injections of 100μg deslorelin every 48 hours for seven days; G2 (DES 72h) animals subjected to intramuscular injections of 100μg deslorelin every 72 hours for seven days; and G3 (implant): animals with subcutaneous implant containing 4.7 mg deslorelin that remained for seven days. During the specific treatment period of each group (seven days), the animals ovaries was monitored by ultrasound to establish the suppression of follicular growth. And the follicles present in the ovaries classified into small, with a diameter of 2 to 2.9 mm, medium, with a diameter of 3 to 4.4 mm and large diameter ≥4.5mm. Ovarian ultrasound monitoring was maintained after completion of treatment, until 100% of the sheep retake the follicular activity. The follicular population was compared in the groups and between the groups during the treatment period. The G0 (Control) did not differ (p> 0.05) between the follicles classes wherein the post-synchronization elapsed time did not allow to characterize the typical pattern in ...

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Eunice Oba / Banca: André Luís Rios Rodrigues / Resumo: Objetivou-se estudar comparativamente os efeitos da administração seriada de 100μg de deslorelina por via intramuscular frente ao implante de liberação continuada de deslorelina (4,7mg), sobre a supressão temporária do crescimento folicular ovariano em ovelhas Bergamácia, visando a aplicação em biotecnologias do controle da ovulação. Após um período de adaptação e monitoramento da ciclicidade, as ovelhas tiveram o estro sincronizado pelo emprego de dispositivo intravaginal Eazi-Breed CIDR®, (0,33g de progesterona) de segundo uso, por 12 dias e administração única, pela via intramuscular, de 350UI de eCG concomitantemente à retirada do dispositivo. Foram coletadas amostras de sangue para confirmação da ovulação e ciclicidade através da quantificação de progesterona no plasma sendo considerados animais com atividade lútea aqueles que apresentaram valores igual ou superior a 1ng/mL. Decorridos seis dias da ovulação, as fêmeas foram então divididas em quatro grupos: G0 (Controle): animais sem tratamento; G1 (DES 48h); animais submetidos a aplicações intramusculares de 100μg de deslorelina a cada 48 horas durante sete dias; G2 (DES 72h): animais submetidos a aplicações intramusculares de 100μg de deslorelina a cada 72 horas durante sete dias; e G3 (Implante): animais com implante subcutâneo contendo 4,7mg de deslorelina que permaneceu por sete dias. Durante o período de tratamento específico de cada um dos grupos (sete dias), os animais tiveram os ovários monitorados ultrassonograficamente uma vez ao dia para a constatação da supressão do crescimento folicular, sendo os folículos presentes nos ovários classificados em pequenos, com diâmetro de 2 a 2,9mm, médios, com diâmetro de 3 a 4,4mm e grandes, com diâmetro ≥4,5mm. O monitoramento ultrassonográfico ovariano foi mantido após o término dos tratamentos, até que 100% das ovelhas retomasse a atividade de crescimento folicular. A população... / Abstract: The objective is to comparatively study the 100μg deslorelin serial administration effects front implantation of sustained release deslorelin (4.7 mg) on the temporary suppression of ovarian follicular growth in Bergamacia ewe aiming the application in biotechnology for the control of ovulation. After an adaptation period and monitoring of cyclicity, they had estrus synchronized with the second use intravaginal device Eazi-Breed CIDR® (0.33g progesterone) for 12 days and a single intramuscular injection, of eCG 350UI concurrently with the removal of the device. Blood samples were collected for confirmation of ovulation and cyclicality by measuring plasma progesterone being considered with luteal activity those animals with values equal or higher than 1 ng / mL. Elapsed six days of ovulation females was then be randomly divided into four groups: G0 (Control): untreated animals; G1 (DES 48h); animals subjected to intramuscular injections of 100μg deslorelin every 48 hours for seven days; G2 (DES 72h) animals subjected to intramuscular injections of 100μg deslorelin every 72 hours for seven days; and G3 (implant): animals with subcutaneous implant containing 4.7 mg deslorelin that remained for seven days. During the specific treatment period of each group (seven days), the animals ovaries was monitored by ultrasound to establish the suppression of follicular growth. And the follicles present in the ovaries classified into small, with a diameter of 2 to 2.9 mm, medium, with a diameter of 3 to 4.4 mm and large diameter ≥4.5mm. Ovarian ultrasound monitoring was maintained after completion of treatment, until 100% of the sheep retake the follicular activity. The follicular population was compared in the groups and between the groups during the treatment period. The G0 (Control) did not differ (p> 0.05) between the follicles classes wherein the post-synchronization elapsed time did not allow to characterize the typical pattern in ... / Mestre

Thesis (M.E.)--University of Waikato, 2008. / Title from PDF cover (viewed September 18, 2008) Includes bibliographical references (p. 66-70)

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Coorientador: Katia Roberta A. Belaz / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Mateus José Sudano / Resumo: A congelação e refrigeração são biotecnologias muito utilizadas na reprodução equina, entretanto um significativo número de garanhões possuem baixa qualidade seminal após a criopreservação. Diversos autores descreveram a importância da composição e lipídica das membranas espermáticas sobre a resistência à criopreservação. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar a relação do perfil lipídico das membranas espermáticas com a raça e a resistência espermática à congelação e refrigeração. No experimento 1 foram verificadas as diferenças do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas de garanhões das raças Mangalarga Marchador e Quarto de Milhaa e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos Mangalarga Marchador. No experimento 2 foram avaliados os fosfolipídios das membranas espermáticas entre garanhões com espermatozoides sensíveis ou resistentes à danos decorrentes da congelação e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 nos animais sensíveis à congelação. No experimento 3 comparou-se os fosfolipídios das membranas espermáticas dos garanhões com a resistencia à refrigeração e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 772,5 e 774,6 nos animais resistentes à refrigeração. No experimento 4 observou-se não serem os mesmo lipídios que conferem resistência espermática à congelação e à refrigeração. Como os resultados do presente estudo, pode-se concluir que existe diferença no perfil lipídico das membranas espermáticas entre animais Quarto de Milha e Mangalarga Marchado, entre animais sensíveis e resistentes à congelação, entre animais sensíveis e resistentes à refrigeração. Além disso não há relação do perfil lipídicos que confere resistência espermática à congelação e à refrigeração / Abstract: The freezing and refrigeration are biotechnology very used in equine reprodution, although a significant number of stallion have low seminal quality after cryopreservation. Many authors described the importance of lipid composition of spermatic membrane in crypreservation resistance.The aim of this study is to analisy the lipid profile with MALDI-MS of plasmatic membrane of stallion sperm, checking its relation with breed and with spermatic resistance to freezing and refrigeration. Four experiments were done. The experiment 1 verified the diference of phospholipid spermatic membrane in stallions of Mangalarga Marchador and Quarter horse breeds, which was observed bigger relative abundance of ions m/z 728,6; 741,5 e 744,5 in Mangalarga Marchador. The experiment 2 evaluated the spermatic phospholipid membrane between stallions with weak and resistant to the damage of freezing and was observed bigger relative abundance of ions m/z 703,5; 728,6; 782,5; 808,5 and 836, 6 in the animals weaks to freezing. The experiment 3 compared the phospholipids of stallions spermatic membranes with sperm weaks or resistant to the damage of refrigeration and was observed bigger relative abundance of ions m/z 772,5 e 774,6 in animals resistants to refrigeration. The experiment 4 showed that not the same lipids offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.The results of this study demonstrate tha there is a diference in lipid profile of spermatic membrane between Quarter Horse and Mangalarga Marchador breeds, between animals weak and resistant to freezing and between animals weak and resistant to refrigeration. Besides there is no relation of lipid profile that offer spermatic resistance to freezing and refrigeration / Mestre

This thesis examines whether animal biotechnology is compatible with the norms of animal welfare, environment, and public health. For this purpose, it explores two lines of ethical controversy — intrinsic argument and extrinsic argument. The intrinsic argument against biotechnology maintains that it is “objectionable in itself”. On the other hand, according to extrinsic argument animal biotechnology is ethically wrong because it has got negative consequences upon human beings, animals, and environment.  However, it is also true that biotechnology (whether animal or agricultural) is one of the means of our living today. We cannot deny or oppose its usefulness all on a sudden. We need to be careful as well as critical in this regard. Therefore, it is an imperative that we select tools for making better assessment of biotechnology. In order to examine the ethical acceptability of animal biotechnology, we need to assess the impact of this technology and its potential effects upon the four interest factors: (i) consumers, (ii) farmers and financiers, (iii) treated organisms, and (iv) environment. In this regard, I have opted for Mepham’s ethical matrix, which is a practical approach for addressing broader policy issues. I think that ethical matrix is such a theory that it can incorporate the demand of science and the multidimensional complexity of it that exists today. Mepham’s ethical matrix can lead one towards rational ethical analysis and weighing and integrating potentially conflicting values in the decision-making process. At the end of this study, I have focused on the application of Mepham’s ethical matrix upon some contexts of animal biotechnology, such as bST, transgenic animal, and xenotransplantation. Finally, through the analysis, I came to the conclusion that none of the ethical tools or theories can materially represent the problems to facilitate the ethical debate about animal biotechnology.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:40Z : No. of bitstreams: 1 000852682_20160620.pdf: 79700 bytes, checksum: 3cf603415213794e29627e720a92e128 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-06-20T12:14:14Z: 000852682_20160620.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-20T12:14:51Z : No. of bitstreams: 1 000852682.pdf: 1984663 bytes, checksum: 5c39404e9531f1892485e096eb8f1752 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A congelação e refrigeração são biotecnologias muito utilizadas na reprodução equina, entretanto um significativo número de garanhões possuem baixa qualidade seminal após a criopreservação. Diversos autores descreveram a importância da composição e lipídica das membranas espermáticas sobre a resistência à criopreservação. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar a relação do perfil lipídico das membranas espermáticas com a raça e a resistência espermática à congelação e refrigeração. No experimento 1 foram verificadas as diferenças do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas de garanhões das raças Mangalarga Marchador e Quarto de Milhaa e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos Mangalarga Marchador. No experimento 2 foram avaliados os fosfolipídios das membranas espermáticas entre garanhões com espermatozoides sensíveis ou resistentes à danos decorrentes da congelação e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 nos animais sensíveis à congelação. No experimento 3 comparou-se os fosfolipídios das membranas espermáticas dos garanhões com a resistencia à refrigeração e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 772,5 e 774,6 nos animais resistentes à refrigeração. No experimento 4 observou-se não serem os mesmo lipídios que conferem resistência espermática à congelação e à refrigeração. Como os resultados do presente estudo, pode-se concluir que existe diferença no perfil lipídico das membranas espermáticas entre animais Quarto de Milha e Mangalarga Marchado, entre animais sensíveis e resistentes à congelação, entre animais sensíveis e resistentes à refrigeração. Além disso não há relação do perfil lipídicos que confere resistência espermática à congelação e à refrigeração / The freezing and refrigeration are biotechnology very used in equine reprodution, although a significant number of stallion have low seminal quality after cryopreservation. Many authors described the importance of lipid composition of spermatic membrane in crypreservation resistance.The aim of this study is to analisy the lipid profile with MALDI-MS of plasmatic membrane of stallion sperm, checking its relation with breed and with spermatic resistance to freezing and refrigeration. Four experiments were done. The experiment 1 verified the diference of phospholipid spermatic membrane in stallions of Mangalarga Marchador and Quarter horse breeds, which was observed bigger relative abundance of ions m/z 728,6; 741,5 e 744,5 in Mangalarga Marchador. The experiment 2 evaluated the spermatic phospholipid membrane between stallions with weak and resistant to the damage of freezing and was observed bigger relative abundance of ions m/z 703,5; 728,6; 782,5; 808,5 and 836, 6 in the animals weaks to freezing. The experiment 3 compared the phospholipids of stallions spermatic membranes with sperm weaks or resistant to the damage of refrigeration and was observed bigger relative abundance of ions m/z 772,5 e 774,6 in animals resistants to refrigeration. The experiment 4 showed that not the same lipids offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.The results of this study demonstrate tha there is a diference in lipid profile of spermatic membrane between Quarter Horse and Mangalarga Marchador breeds, between animals weak and resistant to freezing and between animals weak and resistant to refrigeration. Besides there is no relation of lipid profile that offer spermatic resistance to freezing and refrigeration / FAPESP: 2012/24843-4

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-19Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000828398_20151120.pdf: 49172 bytes, checksum: 37877bd4281c51b89052cc8b1594b906 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-11-27T16:10:05Z: 000828398_20151120.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-11-27T16:10:44Z : No. of bitstreams: 1 000828398.pdf: 549205 bytes, checksum: c1d0695fe73602a07a20eab8411b29e4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / BEPE-Itália / Esta pesquisa visou avaliar o perfil de expressão de determinados genes e o potencial de desenvolvimento in vitro de complexos cumulus-oócitos (COCs) de ovinos temporariamente bloqueados no estadio de vesícula germinativa (GV) com uso da roscovitina. Neste contexto, diferentes composições de meio (com e sem soro fetal bovino e gonadotrofinas), tempos (0, 6, 12 e 20 horas) e métodos de cultivo (com e sem cobertura de óleo mineral) foram testados com intuito de garantir a máxima eficiência de inibição meiótica promovida pela roscovitina a 75μM. A avaliação do grau de expansão das células do cumulus, em estereomicroscópio, e do estadio da maturação nuclear, por meio da coloração com Hoescht 33342, revelou que a presença ou ausência de LH, FSH e soro fetal bovino não interferiu no potencial de ação da roscovitina. No entanto, máxima eficiência inibitória foi observada em meio suplementado apenas com soro fetal bovino. Foi constatado ainda que, na ausência de óleo mineral, quantidade significativamente maior de oócitos tratados com roscovitina foi mantida em GV o que reforça a hipótese de lipossolubilidade do referido inibidor. Embora o potencial de inibição meiótica da roscovitina tenha se mantido nos diferentes tempos de cultivo, a exposição prolongada dos COCs ao inibidor afetou de maneira irreversível a expansão do cumulus. Em todas as situações, a inibição meiótica foi completamente reversível após cultivo por 18 horas em meio de maturação livre de inibidor. Sendo assim, para análise da expressão gênica e desenvolvimento embrionário in vitro, foi preconizado o tratamento com roscovitina a 75μM por 6 horas na presença de soro e sem óleo mineral. Nestas condições assim como após a reversibilidade por 18 h, a quantidade relativa da maioria dos genes investigados nas células do cumulus e nos oócitos foi similar ao observado nos COCs não inibidos (controle). Do mesmo modo, não foi ... / This study aimed to evaluate the expression profile of certain genes and the potential of in vitro development of sheep cumulus-oocytes complexes (COCs) temporarily arrested at germinal vesicle (GV) stage using roscovitine. In this context, different medium compositions (with and without fetal bovine serum and gonadotropins), times (0, 6, 12 and 20 hours) and methods of culture (with and without mineral oil overlay) were tested in order to ensure maximum efficiency of meiotic inhibition promoted by 75μM roscovitine. The evaluation of cumulus expansion degree, under stereomicroscope, and nuclear maturation stage, by staining with Hoechst 33342, revealed that the presence or absence of LH, FSH and fetal bovine serum did not influence the action potential of roscovitine. However, maximum efficiency of meiotic inhibition was observed in medium supplemented with fetal bovine serum. It was also found that, in the absence of mineral oil overlay, significantly higher quantity of oocytes treated with roscovitine was kept at GV, which reinforces the hypothesis of liposolubility of this inhibitor. Although the potential of meiotic inhibition of roscovitine had remained at different culture times, the prolonged exposure of COCs to inhibitor irreversibly affect the cumulus expansion. In all cases, the meiotic arrest was completely reversible after culture for a further 18 h in inhibitor-free medium. Therefore, for analysis of gene expression and in vitro embryo development, it was chosen the treatment with 75μM roscovitine for 6 h under serum-supplemented medium and without mineral oil overlay. Under these conditions as well as after the reversibility for 18 h, the relative amount of most investigated genes in cumulus cells and oocytes was similar to that observed in the uninhibited COCs (control). Similarly, no difference was found between roscovitine treatment and control with respect to blastocyst rate and quality of embryos obtained. Therefore, ... / FAPESP: 2011/14041-5 / BEPE-Itália: 2013/05564-0

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:34Z : No. of bitstreams: 1 000843878_20151231.pdf: 905384 bytes, checksum: 9b6eaf7fcedae316cec999a302400d52 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:30Z: 000843878_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:26Z : No. of bitstreams: 1 000843878.pdf: 3505593 bytes, checksum: 74afed02afd55eb520396764b8c59504 (MD5) / A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos... / The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringer's lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes ...

Made available in DSpace on 2018-07-27T18:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-15. Added 1 bitstream(s) on 2018-07-27T18:30:20Z : No. of bitstreams: 1 000866903.pdf: 3382135 bytes, checksum: 11a5cbaf65eb2a51c8ece933b2603115 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Apesar da citometria ser um método eficiente para sexagem espermática, nos cães pode ser considerada de difícil aplicação, em vista do alto custo da aplicação da técnica e da baixa recuperação espermática após a separação. Por esta razão, o presente trabalho visou avaliar a viabilidade espermática, a taxa de recuperação e a porcentagem de espermatozoides de cães contendo o cromossomo X ou Y após a centrifugação em três gradientes descontínuos de densidade e estudou três técnicas de extração de DNA espermático para determinar a % de células X ou Y pela PCR quantitativa (qPCR). Foram avaliadas 30 amostras de sêmen canino (10 cães) utilizando os protocolos de centrifugação em gradiente descontínuo de densidade (Percoll® - 30 a 90% associado ao Nycodenz® e Ficoll). Os espermatozoides foram avaliados pré e pós-centrifugação quanto à motilidade (CASA - Computer-Aided Semen Analyzer), concentração inicial e concentração recuperada, morfologia espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, e função mitocondrial. Após a separação, as células foram submetidas a três protocolos de extração de DNA, um não comercial (fenol:clorofórmio, M1) isolado ou associado a um kit preparatório (M2) e dois comerciais com mini-colunas de extração (M3 e M4) e, posteriormente, à qPCR com os primers contra os genes SRY (AF_107021.1) e Fator IX (NM_001003323.2). O protocolo M1 recuperou maior concentração de DNA e com maior qualidade permitindo a execução da qPCR. Dentre os gradientes de densidade, o Ficoll manteve maior qualidade espermática após a centrifugação, embora o enriquecimento de X ou Y não tenha sido observado em nenhum dos métodos estudados. A extração de DNA utilizando o fenol:clorofórmio foi o método que extraiu maior quantidade e de maior qualidade para a aplicação na qPCR / Despite cytometry to be an effective method for sperm sexing, in dogs can be considered of difficult application, given the high cost of the technical implementation and low sperm recovery after separation. Therefore, this study aimed to evaluate the sperm viability, recovery rate and the percentage of sperm dogs containing the X or Y after centrifugation three discontinuous density gradients. Furthermore, aimed to study three DNA extraction techniques for sperm cells to determine the percentage of bearing cells of the X or Y chromosome for quantitative real-time PCR (qPCR). Thirty samples (10 dogs) of canine semen were evaluated using centrifugation discontinuous density gradient protocols (Percoll® - 30 to 90% associated to Nycodenz® and Ficoll). The sperm were evaluated before and after centrifugation for motility (CASA - Computer Aided Semen Analyzer), initial concentration and recovered concentration, sperm morphology, integrity of plasma and acrosomal membranes, and mitochondrial function. After separation, the cells were subjected to three DNA extraction protocols, a non-commercial using phenol:chloroform (M1) alone or combined with a preparatory kit (M2) and two commercial with extraction mini-columns (M3 and M4). Next, the DNA samples were subjected to qPCR using two primers (SRY - AF_107021.1 and Factor IX - NM_001003323.2). M1 protocol recovered greater concentration of DNA with higher quality and allowing the execution of qPCR. Among the density gradients, Ficoll maintained higher sperm quality after centrifugation, although the X or Y enrichment was not observed in any of the studied methods

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: Cristiele da Silva Ribeiro / Banca: George Shigueki Yasui / Resumo: A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos... / Abstract: The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringer's lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes ... / Mestre