Reproduction de : Thèse de doctorat : Médecine. Génétique moléculaire : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Le dépliement thermique et chimique est raisonnablement compris, mais pas les effets déstabilisants de la pression. Dans une tentative de caractérisation des facteurs à la base des effets de la pression sur les protéines, nous avons étudié le dépliement sous pression d'une protéine modulaire, le domaine ankyrine du récepteur Notch (Nank1-7*), ainsi que plusieurs mutants en nombre de motifs. Nos expériences montrent un dépliement à deux états sous pression. La dépendance à la température des sauts de pression a montré qu'à faibles températures l'ensemble d'état de transition(TSE) est proche en volume de l'état replié alors que son énergie est proche de celle de l'état déplié,ce qui est significatif d'une déshydratation importante de la barrière énergétique, et a montré que l'augmentation de la température conduit à un TSE plus grand en volume que l'état replié. Ce comportement révèle une grande plasticité du TSE de Nank1-7*. L'étude des mutants (délétion demotifs) nous a montré que le ΔV n'est déterminé ni par l'hydratation des liaisons peptidiques ni par l'hydratation différentielle des acides aminés, mais par l'existence de vides internes exclus du solvant. Seule une petite fraction des cavités est déterminante pour le ΔV, celles qui ne sont pas significativement solvatées dans les coeurs hydrophobes. Finalement, nous avons déterminé que le TSE possède même des cavités plus grandes, et nous émettons l'hypothèse que l'énergétique et la dynamique contribuent aux effets de la pression sur les protéines. / Thermal and chemical unfolding of proteins are reasonably well understood, but the destabilizingeffects of pressure are not. In an attempt to characterize the factors at the basis of pressure effects,we investigated the pressure unfolding of a modular protein, the ankyrin domain of the Notch receptor(Nank17*) and several of its deletion constructs. All our experiments were consistent with a simpletwo-state folding/unfolding transition under pressure. The temperature dependence of pressure-jumpsdemonstrated that at low temperature, the transition state ensemble (TSE) lies close in volume to thefolded state despite its unfolded-like energetics, consistent with significant dehydration at the barrier,and that increasing temperature leads to a volume of the TSE larger than that of the folded state. Thisbehavior reveals a high degree of plasticity of the TSE of Nank17*. Studies of the deletion mutantsshowed us that ΔV is determined not by hydration of peptide bonds or by differential hydration ofresidues, but by the existence of internal solvent-excluded void volumes. Only a small fraction of theinternal cavities are relevant of the ΔV, those that are not significantly solvated in the hydrophobiccore. Finally, we determined that the transition state ensemble show even larger cavities, and wehypothesize both energetics and dynamics contribute to pressure effects on proteins.

Les canaux potassiques à deux domaines P (K2P) contrôlent l’excitabilité cellulaire et jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos membranaire dans la majorité des cellules animales. Depuis leur identification dans les années 90, ces canaux ont été impliqués dans de nombreuses fonctions comme la modulation de l’activité neuronale, l’activité du muscle cardiaque ou encore la physiologie rénale. Malgré l’importance de ces canaux, peu de données existent sur les processus cellulaires qui contrôlent leur fonction in vivo. Au cours de ma thèse, j’ai utilisé des approches génétiques, d’imagerie et d’électrophysiologie pour comprendre comment l’expression, la distribution et l’activité du canal K2P UNC-58 sont contrôlés chez le nématode modèle C. elegans.Pour cela, j’ai effectué un crible suppresseur du phénotype locomoteur du mutant gain de fonction unc-58(e665). J’ai ainsi obtenu 133 mutants présentant une large gamme de niveaux de suppression, suggérant l’implication de plusieurs gènes dans les processus de régulation du canal. En utilisant les technologies de reséquençage complet de génome, j’ai pu cloner six nouveaux gènes requis pour la fonction d’unc 58.J’ai ensuite caractérisé en détail le rôle d’unc-44/ankyrine dans le contrôle du trafic d’unc 58. Ce travail a conduit à 4 conclusions majeures : (1) UNC-58, malgré sa structure de canal potassique, possède en réalité une sélectivité ionique altérée favorisant le passage des ions sodium, (2) l’addition à UNC 58 de protéine fluorescente par approche CRISPR/Cas9 nous a permis pour la première fois d’observer directement la distribution du canal UNC-58 in vivo, (3) l’ankyrine est nécessaire à l’adressage du canal UNC-58 à la surface des muscles et dans les axones des neurones mécanosenseurs ALM. Cette fonction fait intervenir une poche d’interaction lipidique localisée au sein du module Zu5N-Zu5C-UPA d’UNC-44, (4) ce mécanisme est hautement sélectif puisqu’il n’est pas requis pour l’adressage de 6 autres canaux potassiques musculaires. Mon crible a également identifié une interaction génétique entre unc-70/ß-spectrine et unc-44/ankyrine. Toutefois, la nature moléculaire de cette interaction reste encore à préciser / Two-pore potassium channels (K2P) control cell excitability and play a central role in the establishment and the maintenance of the resting membrane potential of almost all animal cells. Since their identification in the late 90s, these channels have been implicated in a large number of functions ranging from neuronal and cardiac activity to kidney physiology. Despite the crucial functions of these channels, comparatively little is known about the cellular processes controlling their function in vivo. During my PhD, I used a wide range of strategies including genetics, microscopy and electrophysiology to understand how the expression, the distribution and the activity of the K2P channel UNC-58 are controlled in the model nematode C. elegans. I have first performed a genetic suppressor screen targeting the locomotion phenotype of the gain of function mutant unc-58(e665). The screen yielded 133 mutants, displaying a wide range of suppression level, suggesting that several genes may be implicated in the channel regulation process. By using whole genome sequencing technologies, I’ve been able to clone six new genes required for the function of UNC-58.Then, I’ve characterized in detail the role of unc-44/ankyrin in the trafficking of UNC 58. This project led to 4 main conclusions : (1) UNC-58, despite its potassium channel structure, has an altered ionic selectivity, allowing preferably sodium ions to pass through the channel (2) the addition of a fluorescent protein to UNC-58 by CRISPR/Cas9 approaches allowed us for the first time to directly observe the addressing of the UNC-58 channel to the muscle surface and axons of ALM mechanosensory neurons. This function involves a lipid binding pocket located within the Zu5N-Zu5C-UPA module of UNC-44, (4) this mechanism is highly selective since it is not required for the addressing of 6 other muscular channels.My screen also identified a genetic interaction between unc-70/ß-spectrin and unc-44/ankyrin. However, the exact molecular nature of this interaction remains to be elucidated

La protéine RhBG humaine est un membre de la famille des protéines Rh (Rhésus), premiers canaux à gaz caractérisés chez les mammifères et par conséquent, de la superfamille Amt/Mep/Rh des transporteurs d'ammonium. Elle facilite le transport de la forme neutre de l'ammonium (NH3) et est ancrée à la membrane plasmique basolatérale de cellules épithéliales rénales, via l'ankyrine G, protéine adaptatrice du squelette membranaire dépendant de la spectrine. Nous avons montré que la mutation du motif d'ancrage à l'ankyrine G, localisé dans l'extrémité C-terminale intracytoplasmique de RhBG, retarde l'adressage, diminue la stabilité à la surface et abolit la fonction de transport de NH3 de la protéine RhBG dans les cellules épithéliales HEK293. Nous avons également montré que la tyrosine Y429, qui appartient au signal d'adressage basolatéral YED de RhBG, est phosphorylée in vitro par les kinases Src et Syk purifiées. D'autre part, le traitement de cellules HEK293 par le pervanadate, un inhibiteur de phosphatases sur phosphotyrosine (donc un activateur indirect des tyrosine kinases) diminue fortement l'activité de transport de la protéine native mais pas celle d'un mutant Y429A (bloquant sa phosphorylation). Ce résultat montre d'une part que Y429 est le seul résidu tyrosine de RhBG impliqué dans la régulation du transport de NH3, via une phosphorylation, d'autre part que la protéine RhBG est phosphorylée ex vivo sur cette tyrosine. Des mutations Y429D et Y429E, mimant une phosphorylation constitutive, abolissent le transport de NH3 et favorisent la solubilisation du RhBG membranaire. À l'inverse, des mutants Y429A et Y429F non phosphorylés et non phosphorylables se comportent comme la protéine RhBG sauvage. En revanche, des études en microscopie confocale montrent que seules les mutations Y429A et Y429F entraînent une dépolarisation de l'expression de RhBG dans des cellules MDCK polarisées, les mutants Y429D et Y429E étant normalement localisés dans le domaine basolatéral des cellules. L'ensemble de ces résultats démontre que l'adressage, l'ancrage au squelette sous-membranaire et la fonction de transport d'ammonium de RhBG sont régulés à la fois par la phosphorylation et la liaison au squelette membranaire de son domaine C-terminal cytoplasmique et nous a conduit à proposer un modèle dans lequel la phosphorylation de la tyrosine Y429 faisant partie du motif YED, serait nécessaire à l'adressage de RhBG vers la membrane basolatérale de cellules épithéliales polarisées, alors que la déphosphorylation de cette tyrosine permettrait l'ancrage de la protéine au squelette membranaire, via l'ankyrine G, et l'activation du canal à NH3 par un changement conformationnel potentiel de l'extrémité C-terminale.

L'hyménoptère Cotesia congregata (Microgastrinae ; Braconidae) pond ses oeufs à l'intérieur de son hôte, la chenille du lépidoptère Manduca sexta (Noctuidae ; Sphingidae) et introduit des particules virales de bracovirus contenant 30 cercles d'ADN double brin. Les gènes viraux portés par ces cercles codent pour une série de protéines qui sont produites dans les tissus de la chenille parasitée. Ces protéines virales jouent un rôle indispensable à la réussite parasitaire. En effet, l'expression des gènes viraux entraîne de nombreuses altérations de la physiologie de l'hôte, notamment un contournement de l'immunité de la chenille qui permet le développement des larves du parasite. D'autre part, le développement de l'hôte est bloqué à un stade pré-pupal. Les travaux portant sur la caractérisation des génomes de bracovirus ont beaucoup progressé et plusieurs familles de gènes ont été découvertes. Une synthèse des connaissances actuelles sur l'immunité des insectes et les gènes de bracovirus potentiellement impliqués dans le contrôle de l'immunité et du développement des lépidoptères est présentée en introduction.<br />Au cours de ma thèse, le séquençage et l'analyse du génome du bracovirus de Cotesia congregata ont été réalisés (Espagne et al 2004). L'existence de plusieurs familles multigéniques a été mise en évidence, notamment la famille des protéines tyrosines phosphatases (PTP) composée de 27 gènes (Provost et al 2004), la famille des cystatines composée de 3 gènes (Espagne et al soumis) et enfin celle des protéines à motif ankyrine composée de 6 gènes (Pennacchio et al en préparation). La caractérisation détaillée de la famille des PTP a été effectuée. La technique d'électrophorèse en champs inversés (FIGE) a permis la localisation physique de ces gènes sur l'ensemble du génome viral, et leur expression a été analysée dans une série de tissus de l'hôte parasité grâce à une méthode de PCR multiplex. Enfin, des tests d'activité biochimique de PTP de bracovirus produites in vitro grâce à un système d'expression en baculovirus.<br />Les gènes des familles décrites sont exprimés dans l'hôte parasité et les protéines possèdent, en général, la fonction biochimique prédite grâce aux domaines conservés qu'elles contiennent. Ceci suggère que ces protéines virales jouent un rôle actif dans les modifications de la physiologie de l'hôte induite par le parasitisme. La caractérisation des gènes viraux exprimés dans l'hôte est une étape indispensable vers l'identification du rôle individuel de chaque protéine dans le contrôle de la physiologie des chenilles parasitées.