Os ensaios celulares têm ganhado relevância na gênese planejada de fármacos, devido a sua utilização nas diversas etapas envolvidas neste processo. Estes ensaios envolvem a caracterização da atividade farmacológica, propriedades farmacocinéticas e atividade tóxica para compreender a atividade biológica das moléculas de interesse. Neste trabalho, os ensaios celulares foram usados para identificar a atividade anticancerígena e a atividade tóxica de moléculas, uma vez que a morte celular é o parâmetro avaliado em ambos os casos. No presente estudo foram avaliados 34 compostos, sendo dezessete moléculas do grupo NEQUIMED, determinando-se sua atividade citotóxica na célula neoplásica de fígado (HepG2) e na célula de fibroblasto (V79-4). A determinação da atividade citotóxica dos compostos bioativos foi realizada por o método colorimétrico de triagem envolvendo o MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), que é metabolizado pela mitocôndria da célula viva, com confirmação da atividade biológica realizada por citometria de fluxo para a linhagem de fibroblasto. As triagens iniciais foram estabelecidas para determinar a atividade biológica, sendo que as moléculas Neq256, Neq385 e Neq388 apresentaram atividade citotóxica frente à célula HepG2 (caracterizando assim a atividade anticancerígena), enquanto que Neq385 apresentou seletividade em relação a atividade nas células de fibroblasto. Dentre as moléculas de referência, YM-155 apresentou os melhores resultados de atividade citotóxica com IC50 (HepG2) de 0,094 µmol L-1 e IC50 (V79-4) > 100 µmol L-1, sendo muito seletiva para a linhagem cancerígena. Os resultados demonstraram que as moléculas Neq265, Neq385 e Neq388 são promissoras e serão usadas para o planejamento de modificações estruturais que visa obter moléculas com maior potência e seletividade frente às células cancerígenas. Outra vertente do trabalho envolve o planejamento de inibidores da survivina, que apresentam grande potencial para a descoberta e desenvolvimento de estratégias quimioterápicas seletivas. / Cell-based assays are gaining relevance in the drug discovery and development area, being in use almost throughout the whole process. These assays are applied to characterize the pharmacological, pharmacokinetic and toxic activities of new molecules. In this work, cell-based assays were performed to identify anticancer and toxic activities of novel compounds, once the cell death process is the parameter that was evaluated in both cases. In this work, 34 compounds were evaluated (17 of them from the NEQUIMED database) in which the cytotoxic activity in liver cancer cells (HepG2) and hamster fibroblast cells (V79-4) were determined by means of the MTT colorimetric screening. The biological activity in fibroblast cells was further confirmed by using flow cytometry. Out of the whole set, molecules Neq256, Neq385 e Neq388 were cytotoxic to HepG2 (having anticancer activity). Neq385 was selective towards the liver hepatocellular carcinoma when compared with the fibroblasts. Among the reference compounds, YM-155 was the most selective and potent anticancer molecule: IC50 (HepG2) 0.094 µmol L-1 and IC50 (V79-4) > 100 µmol L-1. Taken together, these results provide promissing new molecules (Neq265, Neq385 e Neq388) for further optimization of the potency and selectivity using drug design. Another important outcome for further exploration is the design of survivin inhibitors bearing a huge potential for novel selective chemotherapeutic approaches.

Os ensaios celulares têm ganhado relevância na gênese planejada de fármacos, devido a sua utilização nas diversas etapas envolvidas neste processo. Estes ensaios envolvem a caracterização da atividade farmacológica, propriedades farmacocinéticas e atividade tóxica para compreender a atividade biológica das moléculas de interesse. Neste trabalho, os ensaios celulares foram usados para identificar a atividade anticancerígena e a atividade tóxica de moléculas, uma vez que a morte celular é o parâmetro avaliado em ambos os casos. No presente estudo foram avaliados 34 compostos, sendo dezessete moléculas do grupo NEQUIMED, determinando-se sua atividade citotóxica na célula neoplásica de fígado (HepG2) e na célula de fibroblasto (V79-4). A determinação da atividade citotóxica dos compostos bioativos foi realizada por o método colorimétrico de triagem envolvendo o MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), que é metabolizado pela mitocôndria da célula viva, com confirmação da atividade biológica realizada por citometria de fluxo para a linhagem de fibroblasto. As triagens iniciais foram estabelecidas para determinar a atividade biológica, sendo que as moléculas Neq256, Neq385 e Neq388 apresentaram atividade citotóxica frente à célula HepG2 (caracterizando assim a atividade anticancerígena), enquanto que Neq385 apresentou seletividade em relação a atividade nas células de fibroblasto. Dentre as moléculas de referência, YM-155 apresentou os melhores resultados de atividade citotóxica com IC50 (HepG2) de 0,094 µmol L-1 e IC50 (V79-4) > 100 µmol L-1, sendo muito seletiva para a linhagem cancerígena. Os resultados demonstraram que as moléculas Neq265, Neq385 e Neq388 são promissoras e serão usadas para o planejamento de modificações estruturais que visa obter moléculas com maior potência e seletividade frente às células cancerígenas. Outra vertente do trabalho envolve o planejamento de inibidores da survivina, que apresentam grande potencial para a descoberta e desenvolvimento de estratégias quimioterápicas seletivas. / Cell-based assays are gaining relevance in the drug discovery and development area, being in use almost throughout the whole process. These assays are applied to characterize the pharmacological, pharmacokinetic and toxic activities of new molecules. In this work, cell-based assays were performed to identify anticancer and toxic activities of novel compounds, once the cell death process is the parameter that was evaluated in both cases. In this work, 34 compounds were evaluated (17 of them from the NEQUIMED database) in which the cytotoxic activity in liver cancer cells (HepG2) and hamster fibroblast cells (V79-4) were determined by means of the MTT colorimetric screening. The biological activity in fibroblast cells was further confirmed by using flow cytometry. Out of the whole set, molecules Neq256, Neq385 e Neq388 were cytotoxic to HepG2 (having anticancer activity). Neq385 was selective towards the liver hepatocellular carcinoma when compared with the fibroblasts. Among the reference compounds, YM-155 was the most selective and potent anticancer molecule: IC50 (HepG2) 0.094 µmol L-1 and IC50 (V79-4) > 100 µmol L-1. Taken together, these results provide promissing new molecules (Neq265, Neq385 e Neq388) for further optimization of the potency and selectivity using drug design. Another important outcome for further exploration is the design of survivin inhibitors bearing a huge potential for novel selective chemotherapeutic approaches.

A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS. Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano. / Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism

A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS. Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano. / Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism

A atividade de cisteíno proteases (CP) tem sido relacionada a diferentes patologias, como no caso da leishmaniose, doença de Chagas de alguns tipos de câncer. Devido a homologia entre as cisteíno proteases presentes em altos níveis nesses sistemas celulares, foi investigada aqui a importância dessas enzimas para o desenvolvimento e estabelecimento dessas doenças a partir da atividade biológica in vitro de novos inibidores reversíveis de cisteíno proteases. De maneira geral, as substâncias apresentaram relevante atividade inibitória de cisteíno proteases expressas pelos diferentes sistemas celulares, com máximo de inibição de 42% para o Neq0554 em relação à atividade de CP expressas por Leishmania spp. e 76% em relação a atividade de CP expressas por células de câncer de pâncreas. Diferentes níveis de atividade biológica foram observados entre os sistemas celulares, porém todos apresentaram supressão em relação aos parâmetros citostáticos após a inibição da atividade de CP. Quando testados em Leishmania spp. o crescimento celular foi suprimido em pelo menos 67%, com máximo de inibição de 95% para o Neq0551 a 10 μM. Da mesma maneira, em células de câncer de pâncreas, alterações no ciclo celular e supressão dos processos de migração e formação de colônias foram os resultados mais evidentes, comretenção de 50% da capacidade de formação de colônias das células Mia-Paca2 pelo Neq0554 a 10 μM. Já em relação aos protozoários da capa Y de Trypanosoma cruzi os inibidores testados apresentaram interessante seletividade contra os parasitos, em relação à célula hospedeira LLC-MK2, além de promoverem a supressão de cerca de 80% do processo de invasão celular in vitro quando a célula hospedeira foi previamente tratada com 10 μM do inibidor Neq0662 por 2 h antes do processo de infecção. Por fim, a encapsulação do Neq0554 em apoferritina promoveu um incremento na atividade anticancerígena para células de câncer de pâncreas, com IC50 de 79 μM contra > 200 μM em relação às células de fibroblasto, aumentando sua seletividade. De maneira geral, os resultados corroboram a hipótese de a inibição de cisteíno proteases nos sistemas celulares é eficiente para promover efeitos citostáticos, podendo ser utilizada com controle e supressão do desenvolvimento das patologias. Além disso, a atividade de CP nas células de protozoários e câncer de pâncreas apresentou perfil semelhante de ação, no qual inibidores de CP não promoveram a morte em nível significativo das células, mas ressaltaram os efeitos citostáticos em relação ao crescimento celular. / Cysteine proteases (CP) activity has been related to different pathologies, such as leishmaniasis, Chagas disease and some types of cancer. Due to the homology between cysteine proteases expressed by these cellular systems, it was investigated here the importance of these enzymes for the development and establishment of these diseases based on the in vitro biological activity of novel reversible cysteine protease inhibitors. In general, the inhibitor showed a significant inhibitory activity of cysteine proteases expressed by the different cellular systems, with a maximum inhibition of 42% for Neq0554 concerning the CP activity expressed by Leishmania spp. and 76% to CP activity expressed by pancreatic cancer cells. Different profiles of biological activity were observed between the cellular systems, but all substances had significant CP activity suppression, in cytostatic levels after the inhibition of CPA. When the inhibitors were tested against Leishmania spp., the cell growth was suppressed by at least 67%, with maximum inhibition of 95% for Neq0551 at 10 μM. Similarly in pancreatic cancer cells, changes in the cell cycle profile were the most evident results, as well as the suppression of migration and colony formation ability, with 50% retention of the colony development of Mia-Paca2 cells by Neq0554 at 10 μM. In contrast, to protozoa from Trypanosoma cruzi Y strain, the inhibitors tested showed an interesting selectivity against the parasites concerning the host cell LLC-MK2, also promoting the in vitro cell invasion suppression in about 80% when the host cell was pre-treated with Neq0662 10 μM for 2 h. Finally, the encapsulation of Neq0554 promoted an increase in its anticancer activity against pancreatic cancer cells, with IC50 of 79 μM alongside > 200 μM to fibroblast cells, besides increasing its selectivity. In general, the results corroborate the hypothesis that the inhibition of cysteine proteases in the cellular systems is efficient to promote cytostatic effects, being an interesting tool to be used as control and development suppression of some pathologies. Also, CP activity in protozoa cells and pancreatic cancer showed a similar profile of action, in which cysteine protease inhibitors did not promote death at a significant level for the cells, but emphasized cytostatic effects about cell growth.

The interaction of drugs with DNA is a significant feature in pharmacology and plays a vital role in the designing of more efficient and specifically targeted drugs.The concept of hybridization of two bioactive molecules often leads to increased activity due to synergistic effects of anticancer drugs have been studied.Two important pharmacophores: Acridine and thiophene were widely studied as antitumor, antiparasitic and antibacterial agents. We hypothesize that a conjugate comprised two pharmacophores with different mechanisms of antiproliferative action can result in enhanced DNA damage. Electrochemical Studies in aprotic and protic media, electrochemical DNA biosensor at Glassy carbon electrode, electrochemical New Hairpin DNA biosensor at the Gold electrode (SL-DNA/GE), Molecular Modeling and Spectroscopic UV-Vis, were used to determine the damage caused to DNA by six Acridine-thiophene conjugates. In this work, we report the synthesis of six synthetic DNA intercalators based on the acridine linked with thiophene conjugates (7CNAC01, 6CNAC01, 7ESTAC01, 6ESTAC01, ACS6CN, and ASC5CN). We identified the electrochemical behavior of these active redox drugs is strongly influenced by the nature of solvent (DMF and pH=7.2 phosphate buffer media).We recorded redox properties of 7CNAC01, 6CNAC01, 7ESTAC01, and 6ESTAC01 involve adsorption controlled quasi- reversible process and were investigated using differential pulse voltammetry (DPV) at a glassy carbon and Gold electrode. An effective and new electrochemical biosensor based on hairpin DNA (SL-DNA/GE) immobilized and functionalized on the surface of the gold electrode (GE) to detect oxidative Guanine damage was developed. As a result, two kinds of biosensor were tested with reduced acridinethiophene conjugates showing better sensitivity the SL-DNA/GE sensor for the detection of DNA damage using the electrochemical signal of Oxidation of Guanine bases. Also, Molecular docking results showed predominantly hydrophobic interaction, and either high binding constant was recorded for Molecular docking and UV-Vis absorption spectroscopy showing an isosbestic point presence with dsDNA, for 7ESTAC01, 6ESTAC01, ACS6CN, ACS5CN. Our findings indicate that three reduced acridine-thiophene compounds (7CNAC01, 6CNAC01, and ACS5CN) cause direct dsDNA damage and all our six reduced hybrid compounds are causing damage to singled stranded ssDNA. Finally, we proposed for the first time a direct correlation between binding constant (Kb) and half-wave potential (E1/2) for four acridine-thiophene derivates (7ESTAC01, 6ESTAC01, ACS6CN, and ASC5CN). Our results showed a promise sensitive electrochemical SL-DNA/GE sensor for the detection of DNA damage using the electrochemical signal of Oxidation of Guanine bases, to detect DNA-cancer drug interaction. / A interação de drogas com DNA é uma característica significativa na farmacologia e desempenha um papel vital na concepção de drogas mais eficientes e especificamente direcionadas. O conceito de hibridização de duas moléculas bioativas leva ao aumento da atividade devido aos efeitos sinérgicos de drogas híbridas anticâncer com o uso dos farmacóforos importantes: Acridina e Tiofeno. Estes dois sítios ativos foram amplamente estudados como agentes antitumorais, antiparasitários e antibacterianos. Suspeitamos que um conjugado, composto por dois farmacóforos com diferentes mecanismos de ação antiproliferativa, pode resultar em danos ao DNA. Estudos eletroquímicos em meios prótico e aprótico, biossensor de DNA eletroquímico em eletrodo de carbono vítreo, Hairpin DNA em eletrodo de ouro (SL-DNA/GE), modelagem molecular e Espectroscopia UV-Vis foram usados para determinar os danos causados ao DNA por seis conjugados de Acridina-Tiofeno. Neste trabalho, relatamos o estudo de seis intercaladores de DNA com base na acridina ligada a conjugados de tiofeno (7CNAC01, 6CNAC01, 7ESTAC01, 6ESTAC01, ACS6CN e ASC5CN). As propriedades redox da 7CNAC01, 6CNAC01, 7ESTAC01 e 6ESTAC01 envolvem processo quase-reversível com corrente controlada por difusão. As propriedades redox desses compostos foram investigadas usando voltametrias cíclica e de pulso diferencial (VPD) em eletrodo de carbono vítreo e eletrodo de ouro. Foi desenvolvido um novo e eficiente biossensor eletroquímico baseado no Hairpin DNA (SL-DNA/GE) imobilizado e funcionalizado na superfície do eletrodo de ouro para detectar danos oxidativos da guanina através da interação com 7ESTAC01. Os biosensores SL-DNA e dsDNA foram testados com conjugados de acridina-tiofeno reduzidos, apresentando melhor sensibilidade o sensor SLDNA na detecção de danos ao DNA. Além disso, os resultados de modelagem molecular mostraram predominantemente interação hidrofóbica e uma alta constante de ligação. Já os resultados de espectroscopia de absorção no UV-Vis mostraram a presença de ponto isosbéstico com dsDNA, para os conjugados 7ESTAC01, 6ESTAC01, ACS6CN, ACS5CN. Nossos resultados indicaram que três compostos de acridina-tiofeno reduzidos (7CNAC01, 6CNAC01 e ACS5CN) causaram danos direto ao dsDNA, e os seis compostos híbridos reduzidos, causaram danos ao DNA de cadeia simples. Finalmente, propusemos pela primeira vez uma correlação direta entre constante de ligação (Kb) e potencial de meia onda (E1 / 2) para quatro derivados de acridina-tiofeno (7ESTAC01, 6ESTAC01, ACS6CN e ASC5CN). Além disso, o biosensor eletroquímico de SL-DNA/GE mostrou-se bastante sensível para a detecção dos danos causados ao DNA, através da interação entre o DNA e os compostos estudados.