Anteriormente, foi identificada a atividade esquistossomicida da piplartina, um alcalóide-amida isolado em nossos estudos de bioprospecção em plantas da família Piperaceae. Neste trabalho, foi analisada a estrutura e as propriedades de uma série de análogos da piplartina para avaliar a relação estrutura-atividade. A atividade de análogos sintéticos da piplartina foi avaliada in vitro em vermes adultos de S. mansoni. Primeiro, os análogos foram testados a 50 e 100 μg/mL. Os compostos ativos foram selecionados para a determinação dos valores de IC50. Ao todo, 36 análogos com modificações em três regiões da piplartina foram avaliados. Todas as modificações tiveram uma influência negativa na atividade biológica; no entanto, uma seletividade específica entre os gêneros foi observada. Seis análogos tiveram os valores de IC50 determinados, variando entre 72,33 a 216,86 μM. As diferenças na atividade esquistossomicida entre a piplartina e seus análogos podem ser atribuídas a alterações na forma, equilíbrio hidrofílico-lipofílico e distribuição de carga eletrostática. / Previously, the schistosomicidal activity of piplartine, an alkaloid-amide isolated in our bioprospection studies with plants from Piperaceae species, was identified. In this work, we analyzed the structure and properties of a series of piplartine derivatives to propose a structure-activity relationship model. In vitro activity was evaluated in S. mansoni adult worms exposed in vitro to piplartine synthetic analogs. First, analogs were screened at 50 and 100 μg/mL. Active compounds were selected to the determination of IC50 values. A total of 36 synthetic piplartine analogs with modifications in three regions of the piplartine molecule were evaluated. All the modifications had a negative influence in the biological activity; nevertheless, a gender specific selectivity was observed. Of all the analogs, 6 had the IC50 values determined, ranging from 72.33 a 216.86 μM. Differences in the schistosomicidal activity between piplartine and its analogs could be attributed to changes in shape, hydrophilic-lipophilic equilibrium and electrostatic charge distribution.

A piperina e a piplartina são alcalóides isolados de espécies do gênero Piper. A escolha destas moléculas para este estudo foi baseada em suas atividades biológicas, em especial pelo seu potencial antitumoral. Tendo em vista a procura de meios alternativos para o estudo do metabolismo de novos fármacos, especialmente aqueles provenientes de produtos naturais, este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil oxidativo da piperina e da piplartina através de diferentes metaloporfirinas, que biomimetizam o metabolismo do citocromo P450. Para a realização deste trabalho, a piperina e a piplartina foram expostas à oxidação em meio homogêneo, utilizando o iodosilbenzeno (PhIO) como doador de oxigênio e metaloporfirinas sintéticas de primeira e segunda geração como catalisadores da reação, que foram [Fe(TPP)]Cl, [Mn(TPP)]Cl, [Fe(TFPP)]Cl e [Mn(TFPP)]Cl. Como solvente para os meios reacionais foram utilizados 1,2-dicloroetano e acetonitrila. Os padrões e os meios reacionais contendo os produtos de oxidação foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) com ionização por elétrons (IE), e por espectrometria de massas tandem com ionização por electrospray em modo positivo. Através das análises dos espectros obtidos por CG-EM e IES-EM, foi possível observar a presença de produtos de oxidação, formados com todas as metaloporfirinas testadas, especialmente as fluoradas. Apesar de ter sido detectada pequena formação de produto oxidado na piperina, este foi praticamente insignificante. A piplartina mostrou-se um substrato mais reativo frente aos catalisadores testados. Na piperina foi verificada a presença do produto hidroxilado. Na piplartina os produtos de oxidação observados foram as substâncias desmetoxilada, monohidroxilada e dihidroxiladada, sendo os dois últimos observados apenas através da técnica de electrospray. As estruturas foram propostas baseadas nas vias de fragmentação apresentadas nos espectros de IE-EM de baixa resolução, e também através de IES-EM/EM de alta resolução em modo positivo. Os resultados deste trabalho são promissores para a obtenção de derivados oxidados de piperina e piplartina através das metaloporfirinas. / Piperine and piplartine are alkaloids isolated from species of Piper genus. The choice of these molecules for this study was based on the promising biological activities presented by these substances, especially for their antitumoral potential. Based on the research of alternative ways for studying the metabolism of new drugs, especially from natural products, the goal of this study was to investigate the oxidative profile of piperine and piplartine through different metalloporhyrins, which biomimic the metabolism of cytochrome P450. For doing this research, piperine and piplartine were exposed to oxidation in homogeneous media, using iodosilbenzene (PhIO) as oxygen donor and synthetic metalloporphyrins of first and second generations as catalysts for the reaction, that were [Fe(TPP)]Cl, [Mn(TPP)]Cl, [Fe(TFPP)]Cl and [Mn(TFPP)]Cl. The solvents used for the reaction media were 1, 2- dichloroetane and acetonitrile. The standards and reaction media containing the oxidation products were analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) with electron ionization (EI), and by mass spectrometry and mass spectrometry tandem with electrospray ionization (ESI-EM and ESI-EM/EM), in positive mode. Through the analysis of spectra obtained by GC-MS and ESI-MS, it was possible to observe the presence of the oxidation products, formed with all the metalloporphyrins tested, especially the fluoreted ones from the second generation. Despite having been detected small formation of oxidized product on piperine, this was practically insignificant. Piplartine shown to be a more reactive substrate in front of the catalysts tested. In piperine, it was possible to verify the presence of the hydroxylated product. In piplartine, the oxidized products observed were the demetoxilated, monohydroxilated and dihydroxilated, the last two being verified only through the technique of electrospray. The structures were proposed based on their fragment patterns presented on spectra of EI-MS (low resolution) an ESI-MS with high resolution in positive mode. The results of this work are promising to obtain oxidized derivatives of piperine and piplartine through synthetic metalloporphyrins.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Piper tuberculatum Jacq. (pimenta de macaco) à uma Piperaceae muito usada no Nordeste do Brasil como condimento ou remÃdio. A piplartina (PIP), uma alcamida isolada da planta, ainda à pouco estudada e isto incentivou a investigaÃÃo do seu potencial efeito comportamental e neurobioquÃmico. Os resultados mostraram que a PIP (50 e 100 mg/Kg, i.p.) aumentou o nÃmero de grooming e rearing de camundongos no campo aberto e reverteu a catalepsia induzida por haloperidol. O composto tambÃm apresentou efeito ansiolÃtico, no labirinto em cruz elevado, que foi revertido pelo flumazenil. A atividade hipnÃtica da PIP foi observada apenas no teste de potencializaÃÃo do tempo de sono com Ãter, mas nÃo no tempo de sono barbitÃrico. Apesar desses efeitos, a droga nÃo induziu dÃficit motor nos animais no teste do rota rod. A PIP (50 e 100 mg/Kg, i.p.) apresentou efeito antidepressivo ao reverter a acinesia em animais prÃ-tratados com reserpina (10 mg/Kg, i.p.) e ao reduzir o tempo de imobilidade dos camundongos submetidos ao nado forÃado. Neste teste, o efeito da PIP (20 mg/Kg, i.p.) foi potencializado com a imipramina (6 mg/Kg, i.p.), mas nÃo com a paroxetina (1 mg/Kg, i.p.). AlÃm desses efeitos a PIP (100 mg/Kg, i.p.) aumentou a concentraÃÃo de NA e DA no corpo estriado dos animais, sugerindo que a droga tenha uma aÃÃo antidepressiva e prÃ-convulsivante semelhante aos ATCâs. Este Ãltimo efeito foi observado com a reduÃÃo do tempo de morte de camundongos tratados com PTZ (80 mg/Kg, i.p.). A piplartina apresentou aÃÃo antimuscarÃnica apenas sobre os tremores induzidos por oxotremorina (0,5 mg/Kg, i.p.), nÃo sendo observados outros efeitos da alcamida sobre o sistema colinÃrgico de animais tratados com pilocarpina (350 mg/Kg, i.p.) ou submetidos ao teste da esquiva-passiva ou sobre a densidade de receptores muscarÃnicos (M1 + M2). A alcamida nÃo apresentou aÃÃo anti-oxidante frente ao DPPH, mas reduziu as concentraÃÃes de TBARS e de nitrito, gerados em homogenatos de cÃrebro submetidos ao choque tÃrmico. Por fim, a droga (1, 5 e 50 Âg/mL) nÃo alterou a viabilidade de cÃlulas mesencefÃlicas de ratos e protegeu-as da aÃÃo da 6-OHDA (10 Âg/mL). Na concentraÃÃo de 100 Âg/mL, a PIP mostrou-se tÃxica, isoladamente ou associada a 6-OHDA. Estes resultados mostram que a piplartina possui importantes efeitos sobre o comportamento, que tÃm como base a interaÃÃo da droga com alguns sistemas de neurotransmissÃo e eventos bioquÃmicos celulares. / Piper tuberculatum Jacq. (pimenta de macaco) is a Piperaceae widely used in Northeast Brazil as a spicy or remedy. The few studies found in the literature on Piplartine (PIP), an alcamide isolated from the plant, lead us to evaluate its potential behavioral and neurobiochemical effects. The results showed that PIP (50 e 100 mg/Kg, i.p.) increased the number of grooming and rearing of mice in the open field and reversed the catalepsy induced by haloperidol. The compound also showed an anxyolitic effect, on the elevated plus maze, which was reversed by flumazenil. The hypnotic activity of PIP was registered only in the presence of ether, but not in the presence of tiopental. Despite of these effects, the drug did not induce motor coordination deficit on the animals subjected to the rota rod test. PIP (50 e 100 mg/Kg, i.p.) had an antidepressant effect, by reversing the akinesia of reserpine pre-treated animals and by decreasing the immobility time of mice subjected to the forced swimming test. In this task, the effect of PIP (20 mg/Kg, i.p.) was potentiated by imipramine (6 mg/Kg, i.p.), but not by paroxetine (1 mg/Kg, i.p.). Also, PIP (100 mg/Kg, i.p.) increased the level of NA and DA in striatum of pre-treated animals, suggesting that the drug has an antidepressant and pro-convulsant TCA-like effects. The pro-convulsant effect was noted by the decrease of the death time in PTZ-treated mice. Piplartine showed an antimuscarinic action only on the tremours induced by oxotremorine (0,5 mg/Kg, i.p.) and no other effects of the alcamide were registered on the cholinergic system of the animals treated with pilocarpine (350 mg/Kg, i.p.) or subjected to the passive-avoidance task or on the density of muscarinic (M1 + M2) receptors. PIP was devoided of antioxidant action against DPPH, but the drug decreased the concentration of TBARS and nitrite, generated on brain homogenates subjected to a thermic chock. At last, piplartine (1, 5 and 50 Âg/mL) did not alter the viability of mesemcephalic rat cells and protected them from the action of 6-OHDA (10 Âg/mL). The concentration of 100 Âg/mL of PIP was toxic, when isolated or associated to 6-OHDA. All these findings indicate that piplartine has important effects on behavior, as the result of the interaction of the drug with some neurotransmitters systems and cellular biochemical events.

A piperina e a piplartina são alcalóides isolados de espécies do gênero Piper. A escolha destas moléculas para este estudo foi baseada em suas atividades biológicas, em especial pelo seu potencial antitumoral. Tendo em vista a procura de meios alternativos para o estudo do metabolismo de novos fármacos, especialmente aqueles provenientes de produtos naturais, este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil oxidativo da piperina e da piplartina através de diferentes metaloporfirinas, que biomimetizam o metabolismo do citocromo P450. Para a realização deste trabalho, a piperina e a piplartina foram expostas à oxidação em meio homogêneo, utilizando o iodosilbenzeno (PhIO) como doador de oxigênio e metaloporfirinas sintéticas de primeira e segunda geração como catalisadores da reação, que foram [Fe(TPP)]Cl, [Mn(TPP)]Cl, [Fe(TFPP)]Cl e [Mn(TFPP)]Cl. Como solvente para os meios reacionais foram utilizados 1,2-dicloroetano e acetonitrila. Os padrões e os meios reacionais contendo os produtos de oxidação foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) com ionização por elétrons (IE), e por espectrometria de massas tandem com ionização por electrospray em modo positivo. Através das análises dos espectros obtidos por CG-EM e IES-EM, foi possível observar a presença de produtos de oxidação, formados com todas as metaloporfirinas testadas, especialmente as fluoradas. Apesar de ter sido detectada pequena formação de produto oxidado na piperina, este foi praticamente insignificante. A piplartina mostrou-se um substrato mais reativo frente aos catalisadores testados. Na piperina foi verificada a presença do produto hidroxilado. Na piplartina os produtos de oxidação observados foram as substâncias desmetoxilada, monohidroxilada e dihidroxiladada, sendo os dois últimos observados apenas através da técnica de electrospray. As estruturas foram propostas baseadas nas vias de fragmentação apresentadas nos espectros de IE-EM de baixa resolução, e também através de IES-EM/EM de alta resolução em modo positivo. Os resultados deste trabalho são promissores para a obtenção de derivados oxidados de piperina e piplartina através das metaloporfirinas. / Piperine and piplartine are alkaloids isolated from species of Piper genus. The choice of these molecules for this study was based on the promising biological activities presented by these substances, especially for their antitumoral potential. Based on the research of alternative ways for studying the metabolism of new drugs, especially from natural products, the goal of this study was to investigate the oxidative profile of piperine and piplartine through different metalloporhyrins, which biomimic the metabolism of cytochrome P450. For doing this research, piperine and piplartine were exposed to oxidation in homogeneous media, using iodosilbenzene (PhIO) as oxygen donor and synthetic metalloporphyrins of first and second generations as catalysts for the reaction, that were [Fe(TPP)]Cl, [Mn(TPP)]Cl, [Fe(TFPP)]Cl and [Mn(TFPP)]Cl. The solvents used for the reaction media were 1, 2- dichloroetane and acetonitrile. The standards and reaction media containing the oxidation products were analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) with electron ionization (EI), and by mass spectrometry and mass spectrometry tandem with electrospray ionization (ESI-EM and ESI-EM/EM), in positive mode. Through the analysis of spectra obtained by GC-MS and ESI-MS, it was possible to observe the presence of the oxidation products, formed with all the metalloporphyrins tested, especially the fluoreted ones from the second generation. Despite having been detected small formation of oxidized product on piperine, this was practically insignificant. Piplartine shown to be a more reactive substrate in front of the catalysts tested. In piperine, it was possible to verify the presence of the hydroxylated product. In piplartine, the oxidized products observed were the demetoxilated, monohydroxilated and dihydroxilated, the last two being verified only through the technique of electrospray. The structures were proposed based on their fragment patterns presented on spectra of EI-MS (low resolution) an ESI-MS with high resolution in positive mode. The results of this work are promising to obtain oxidized derivatives of piperine and piplartine through synthetic metalloporphyrins.

Orientador: Ronaldo Aloise Pilli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barcelos_RosimeireCoura_D.pdf: 15482677 bytes, checksum: f8abc41bb1731100795495890fe0c509 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Esse trabalho descreve a preparação de 48 compostos inéditos inspirados nas estruturas da goniotalamina (23) e da piplartina (210), bem como a avaliação da citotoxicidade in vitro desses derivados frente a uma variedade de linhagens de células tumorais humanas. Foram sintetizados 13 análogos da goniotalamina (23), os quais exibiram interessante perfil citotóxico, especialmente os compostos 144, 146 e 148 apresentando grupos metoxila no anel aromático da goniotalamina (23). Ainda, o análogo 164 com o grupo hidroxila em meta reduziu a viabilidade celular do câncer de pâncreas em 50% em uma concentração duas vezes menor em relação a goniotalamina (23). Também foi feita a substituição do anel lactônico por uma lactama, sendo observada uma diminuição significativa da atividade citotóxica dos 9 aza-análogos sintetizados. Em seguida, foi realizado um breve estudo de relação estrutura-atividade da piplartina (210), no qual se evidenciou a importância da carbonila a,b-insaturada endocíclica para a citotoxicidade dessa classe de compostos. Descreveu-se a preparação e a avaliação citotóxica in vitro de 21 derivados N-acilados dos aza-análogos. A N-acilação do nitrogênio lactâmico resultou em compostos ainda mais potentes do que a goniotalamina (23) e a piplartina (210) contra diversas linhagens de câncer, tal como o derivado 294 contendo o grupo N-crotonoila. Além disso, essas moléculas apresentaram um perfil citotóxico promissor contra as células tumorais PANC-1, uma vez que todos os análogos N-acilados foram mais ativos do que a goniotalamina (23). A piplartina (210) e os derivados 269 e 309 foram os mais potentes, sendo que o híbrido goniotalamina-piplartina 269 apresentou o menor valor de IC50, validando a estratégia de hibridação molecular / Abstract: This work describes the preparation of 48 novel compounds inspired on the structures of goniothalamin (23) and piplartine (210) as well as the in vitro assessment of their cytotoxicity against a variety of human tumor cell lines. Thirteen analogs of goniothalamin (23) were synthesized which exhibited interesting cytotoxic profiles, especially compounds 144, 146 and 148 bearing aromatic methoxyl groups. Analog 164 presenting a meta-hydroxyl group reduced the cell viability of pancreatic cancer by 50% at a concentration twice as low as the goniothalamin (23). Subsequently, the lactonic ring was substituted by a lactam, however leading to a significant reduction of the cytotoxic activity of the corresponding 9 aza-analogs. A brief structure-activity relationships study was performed, in which the importance of a,b-unsaturated endocyclic carbonyl group for cytotoxic activity of this class of compounds was demonstrated. The preparation and in vitro cytotoxic evaluation of 21 N-acylated aza-analogs derivatives is herein described. The N-acylation of the lactam nitrogen resulted in compounds that were more potent than goniothalamin (23) and piplartine (210) against diverse strains of cancer, such as compound 294 containing the N-crotonoyl group. Moreover, these molecules showed a promising cytotoxic profile against tumor cells PANC-1, since all the N-acylated analogs were more active than goniothalamin (23). Piplartine (210) and derivatives 269 and 309 were the most potent, and the goniothalamin-piplartine hybrid 269 displayed the lowest IC50 value of all, thereby validating the strategy of molecular hybridization / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

Anteriormente, foi identificada a atividade esquistossomicida da piplartina, um alcalóide-amida isolado em nossos estudos de bioprospecção em plantas da família Piperaceae. Neste trabalho, foi analisada a estrutura e as propriedades de uma série de análogos da piplartina para avaliar a relação estrutura-atividade. A atividade de análogos sintéticos da piplartina foi avaliada in vitro em vermes adultos de S. mansoni. Primeiro, os análogos foram testados a 50 e 100 μg/mL. Os compostos ativos foram selecionados para a determinação dos valores de IC50. Ao todo, 36 análogos com modificações em três regiões da piplartina foram avaliados. Todas as modificações tiveram uma influência negativa na atividade biológica; no entanto, uma seletividade específica entre os gêneros foi observada. Seis análogos tiveram os valores de IC50 determinados, variando entre 72,33 a 216,86 μM. As diferenças na atividade esquistossomicida entre a piplartina e seus análogos podem ser atribuídas a alterações na forma, equilíbrio hidrofílico-lipofílico e distribuição de carga eletrostática. / Previously, the schistosomicidal activity of piplartine, an alkaloid-amide isolated in our bioprospection studies with plants from Piperaceae species, was identified. In this work, we analyzed the structure and properties of a series of piplartine derivatives to propose a structure-activity relationship model. In vitro activity was evaluated in S. mansoni adult worms exposed in vitro to piplartine synthetic analogs. First, analogs were screened at 50 and 100 μg/mL. Active compounds were selected to the determination of IC50 values. A total of 36 synthetic piplartine analogs with modifications in three regions of the piplartine molecule were evaluated. All the modifications had a negative influence in the biological activity; nevertheless, a gender specific selectivity was observed. Of all the analogs, 6 had the IC50 values determined, ranging from 72.33 a 216.86 μM. Differences in the schistosomicidal activity between piplartine and its analogs could be attributed to changes in shape, hydrophilic-lipophilic equilibrium and electrostatic charge distribution.

A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS. Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano. / Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism

Submitted by Caroline de Freitas Zanon (carolfzanon@yahoo.com.br) on 2018-07-19T18:02:39Z No. of bitstreams: 1 TESE VERSAO FINAL.pdf: 2398136 bytes, checksum: a2ce0aa2c7a816d48d27d6f13d6a0fec (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) As páginas pré-textuais não estão na ordem correta, a ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário). Problema 02) Nos agradecimentos consta também a FAPESP, então deve constar o nome dela também na folha de rosto e de aprovação com o número de processo e nos agradecimentos precisa constar o número do processo também, é norma do convênio, coloque também os números do processo da CNPQ. Problema 03) No repositório você colocou o nome de Caroline de Freitas Zanon e na tese está Caroline de Freitas Zanon de Carvalho, se esse é o seu nome atual por favor coloque também este nome no repositório. Sua submissão será rejeitada para que você possa fazer as correções Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2018-07-19T19:04:58Z (GMT) / Submitted by Caroline de Freitas Zanon de Carvalho (carolfzanon@yahoo.com.br) on 2018-07-21T14:52:58Z No. of bitstreams: 1 TESE VERSAO FINAL.pdf: 2394414 bytes, checksum: 6f54895bda93635e996f95a66bf389be (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-07-23T13:58:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carvalho_cfz_dr_sjrp.pdf: 2370535 bytes, checksum: d8d49b7c960d1ac32653f9d268eda5df (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-23T13:58:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carvalho_cfz_dr_sjrp.pdf: 2370535 bytes, checksum: d8d49b7c960d1ac32653f9d268eda5df (MD5) Previous issue date: 2018-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os avanços recentes nos mecanismos de inflamação e a descoberta de vários mediadores endógenos anti-inflamatórios levaram a novas investigações sobre as possibilidades terapêuticas. A demonstração, em estudos científicos, da ação anti-inflamatória da proteína anexina A1 (ANXA1) e do seu peptídeo mimético Ac2-26, têm sido fonte de sucesso para o desenvolvimento de novos fármacos. A descoberta da interação biofísica da piplartina (PL) com a região N-terminal da ANXA1 abriu um novo e instigante campo de investigação para o nosso grupo de pesquisa. Diante destas considerações, o objetivo do presente trabalho foi investigar a atuação da PL nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), ativadas pelo lipopolissacarídeo (LPS). Ainda, se a interação Ac2-26/PL influência nas ações anti-inflamatórias da PL, favorecendo ou atenuando os seus efeitos nos processos inflamatórios. Inicialmente foi utilizada a Espectroscopia de Absorbância UV-Vis e de Fluorescência para investigar as interações entre o ligante PL e Ac2-26. In vitro, as células HUVEC foram ativadas pelo LPS (10 μg/mL), nos tempos de 8, 24, 48 e 72 horas, seguido pelos tratamentos com Ac2-26 (1µM) e/ou PL (10µM), demonstrando resultados expressivos em 24 e 72 horas. Os efeitos foram avaliados nos seguintes aspectos: proliferação celular, viabilidade celular, dosagens da quimiocina MCP-1 e das citocinas IL-8 e IL-1β e expressão da proteína α-tubulina. A presença de um anel trimetoxiaromático na estrutura da PL, o que pode favorecer uma interação com a tubulina, motivou as análises de Western blotting, as quais demonstraram que a PL inibiu a síntese da proteína endógena α-tubulina, em todas as condições experimentais. Nossos resultados mostraram efeitos pró-proliferativos do peptídeo Ac2-26 e, por outro lado, antiproliferativos e pró-apoptóticos da PL. Os níveis das citocinas pró-inflamatórias confirmaram o papel anti-inflamatório do Ac2-26 nas células ativadas pelo LPS, com redução dos níveis de MCP-1 e IL-8, em 24 horas. O tratamento PL reduziu os níveis de MCP-1 nas células ativadas pelo LPS, e aumentou IL-8, inclusive no tratamento associado Ac2-26/PL. Em conjunto, os resultados com as células HUVEC indicam que a PL inibe a proliferação por meio da ativação da apoptose celular, regulada pela inibição da polimerização da α-tubulina e dos níveis elevados da citocina IL-8. A PL e o Ac2-26 mostraram ações anti-inflamatórias, e a interação Ac2-26/PL parece ser neutra em relação às propriedades anti-inflamatórias da PL. / Recent advances in inflammation mechanisms and the discovery of several endogenous anti-inflammatory mediators have led to further investigations into the therapeutic possibilities. The demonstration, in scientific studies, of the annexin A1 protein (ANXA1) anti-inflammatory action and its peptide mimetic Ac2-26, have been a source of success for the development of new drugs. The discovery of the biophysical interaction of piplartin (PL) with the N-terminal region of ANXA1 opened a new and exciting field of investigation for our research group. In view of these considerations, the objective of the present study was to investigate the role of PL in lipopolysaccharide (LPS) activated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Also, if the interaction Ac2-26/PL influences the anti-inflammatory actions of PL, favoring or attenuating its effects on inflammatory processes. Initially, UV-Vis Absorbance Spectroscopy and Fluorescence were used to investigate the interactions between the PL ligand and Ac2-26. In vitro, HUVEC cells were activated by LPS (10 μg/mL) at 8, 24, 48 and 72 hours, followed by treatments with Ac2-26 (1μM) and/or PL (10μM), demonstrating expressive results in 24 and 72 hours. The effects were evaluated in the following aspects: cell proliferation, cell viability, MCP-1 chemokine and IL-8 and IL-1β cytokines and α-tubulin protein expression. The presence of a trimethoxyaromatic ring in the PL structure, which may favor an interaction with tubulin, motivated Western blotting analyzes, which demonstrated that PL inhibited endogenous α-tubulin protein synthesis in all experimental conditions. Our results showed pro-proliferative effects of the peptide Ac2-26 and, on the other hand, antiproliferative and pro-apoptotic of PL. Proinflammatory cytokine levels confirmed the anti-inflammatory role of Ac2-26 in LPS-activated cells, reducing MCP-1 and IL-8 levels within 24 hours. PL treatment reduced MCP-1 levels in LPSactivated cells, and increased IL-8, including in the treatment associated with Ac226/PL.Taken together, the results with HUVEC cells indicate that PL inhibits proliferation through the activation of cellular apoptosis, regulated by the inhibition of α-tubulin polymerization and elevated IL-8 cytokine levels. PL and Ac2-26 showed anti-inflammatory actions, and the Ac2-26/PL interaction appears to be neutral in relation to the anti-inflammatory properties of PL. / CNPq: 142274/2014 / CNPq UNIVERSAL: 474596/2013-3

A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS. Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano. / Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism