Neoplastic diseases hold the second place of the most common causes of death worldwide. Available treatments include various combinations of surgery, chemotherapy, radiation, hormone therapy, immune therapy and targeted therapy. The emphasis is currently laid on nanomedicine, where new nanosized complexes are developed and applied for the targeted treatment and chemotherapy. The aim is to significantly improve the anticancer effect and decrease the damage to organism. In this thesis, ruthenium nanoparticles with a size of 12–14 nm were synthesized and their surface modified with polyvinylpyrrolidone. Furthermore these were subsequently modified with polyoxyethylene(40)stearate for binding of doxorubicin. These nanoparticles were tested on breast carcinoma cells (MDA-MB-231), ovarian carcinoma cells (A2780) and neuroblastoma cells (UKF-NB-4). Apoptosis and necrosis testing showed 60—64 % increase in apoptosis when comparing ruthenium nanoparticles modified with doxorubicin to nonmodified ruthenium nanoparticles. The modification increased level of oxidative stress in tumorous cells and slightly a genotoxicity to non-tumorous cells, nevertheless the hemocompatibility was significantly improved. Testing has proven with IC50 0.98 g/ml, 3.91 g/ml and 1.95 g/ml higher sensitivity to these cells and confirmed expected anticancer activity. Compared to one of the most common chemotherapeutic agents cisplatin the modified ruthenium nanoparticles are significantly more toxic to cell lines A2780 (IC50=21 µg/ml), MDA-MB-231 (IC50=9 µg/ml) and UKF-NB-4 (IC50=4 µg/ml).

Yes / Enantiomers of a relatively rigid DNA-binding metallo-helix are shown to have comparable activity to that of cisplatin against the cell lines MCF7 (human breast adenocarcinoma) and A2780 (human ovarian carcinoma) but are ca five times more active against the cisplatin-resistant A2780cis. The cell-line HCT116 p53+/+ (human colon carcinoma) is highly sensitive giving IC50 values in the nM range, far lower than the cisplatin control. The hypothesis that the biological target of such metallohelices is DNA is probed by various techniques. Tertiary structure changes in ct-DNA (formation of loops and intramolecular coiling) on exposure to the compounds are demonstrated by atomic force microscopy and supported by circular/linear dichroism in solution. Selectivity for 50-CACATA and 50-CACTAT segments is shown by DNase I footprinting. Various three- and four-way oligonucleotide junctions are stabilised, and remarkably only the L metallo-helix enantiomer stabilizes T-shaped 3WJs during gel electrophoresis; this is despite the lack of a known helix binding site. In studies with oligonucleotide duplexes with bulges it is also shown for the first time that the metallo-helix binding strength and the number of binding sites are dependent on the size of the bulge. In contrast to all the above, flexible metallo-helices show little propensity for structured or selective DNA binding, and while for A2780 the cancer cell line cytotoxicity is retained the A2780cis strain shows significant resistance. For all compounds in the study, H2AX FACS assays on HCT116 p53+/+ showed that no significant DNA damage occurs. In contrast, cell cycle analysis shows that the DNA binders arrest cells in the G2/mitosis phase, and while all compounds cause apoptosis, the DNA binders have the greater effect. Taken together these screening and mechanistic results are consistent with the more rigid helices acting via a DNA binding mechanism while the flexible assemblies do not.

L’équilibre rédox entre les niveaux des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS, RNS) et les espèces antioxydantes cellulaires est déterminant pour le fonctionnement normal de la cellule et sa viabilité. Le déséquilibre redox ou « stress oxydant » peut altérer les voies de signalisation cellulaires et générer des dommages sur les protéines, les lipides et l’ADN des cellules. Il est ainsi associé à de nombreuses pathologies, notamment les cancers. Les cellules cancéreuses présentent une dérégulation redox importante et un stress oxydant basal intrinsèque plus élevé par rapport aux cellules normales. Elles sont donc très dépendantes des systèmes antioxydants pour leur viabilité. Ainsi, l’administration de drogues qui i) génèrent des ROS / RNS additionnelles ou ii) inhibent les systèmes antioxydant cellulaires, permet une cytotoxicité sélective contre les cellules cancéreuses. C’est la base biologique de la « thérapie anticancéreuse basée sur la modulation de l’équilibre redox». Dans ce contexte, nos travaux ont pour but de décrypter les mécanismes redox derrière l’activité anticancéreuse de la vitamine C (VitC) et de l’auranofin (AUF), seuls ou en combinaison, dans le modèle du cancer du sein. La VitC à des concentrations pharmacologiques élevées présente des propriétés pro-oxydantes. Dans cette étude, l’activité anticancéreuse de la VitC contre les lignées du cancer du sein est associée à une génération extracellulaire et intracellulaire de peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) accompagnée d'une oxydation intracellulaire du glutathion (GSH). L’approche protéomique «redoxome» a révélé que la VitC induit une altération de l'état rédox d’enzymes antioxydantes clés et d'un certain nombre de protéines contenant des cystéines, impliquées dans les métabolismes de l’ARN et l’ADN et dans les processus énergétiques. La VitC est également responsable d’un retard dans la progression du cycle cellulaire et d’une inhibition de la traduction. Finalement, des analyses bioinformatiques ont montré que les niveaux d'expression de la peroxiredoxine 1 (PRDX1) sont corrélés à la cytotoxicité différentielle de la VitC dans les cellules cancéreuses du sein. L'AUF, un antirhumatismal, est un inhibiteur des thiorédoxines réductases qui a reçu une attention croissante pour son activité anticancéreuse. Nos travaux montrent que l’AUF inhibe également le système antioxydant du GSH et que cette inhibition est primordiale pour son activité anticancéreuse. L’AUF modifie l'état redox de nombreuses protéines impliquées dans la prolifération et le cycle cellulaire, et provoque une déplétion des dNTPs et un arrêt du cycle cellulaire. De façon remarquable, nous avons démontré que la combinaison de l’AUF et de la VitC présente une cytotoxicité accrue, synergique, médiée par H₂O₂ dans les cellules MDA-MB-231 et d'autres lignées cellulaires du cancer du sein sans trop affecter les cellules normales. In vivo, l’efficacité de la combinaison AUF/VitC a été validée sur des xénogreffes de MDA-MB-231 chez les souris sans présenter une toxicité notable, tandis que l'administration de l’AUF ou de la VitC en monothérapie n’inhibe pas la croissance tumorale. Enfin, les analyses protéomiques, bioinformatiques et fonctionnelles ont identifié la prostaglandine réductase 1 (PTGR1) comme biomarqueur prédictif de la réponse des cellules cancéreuses du sein à la combinaison AUF/VitC. En résumé, ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes anticancéreux de la VitC et de l'AUF, seuls et en combinaison. En particulier, la combinaison de ces deux médicaments disponibles et non toxiques pourrait être efficace contre le cancer du sein triple négatif et potentiellement d'autres cancers présentant des propriétés redox similaires. Ainsi, une évaluation préclinique et clinique de ces traitements ouvrira la voie à des nouvelles thérapies anticancéreuses basées sur la modulation de l’équilibre redox cellulaire. / Reactive oxygen and nitrogen species (ROS, RNS) homeostasis and intracellular reductive/oxidative (redox) dynamics play a key role in regulating cell fate and are critical for normal cellular functions. Oxidative stress via the disruption of redox homeostasis can lead to aberrant cell signaling and toxic oxidative damage of DNA, lipids and proteins, and is therefore associated with human pathologies such as cancers. Cancer cells experience extensive redox deregulation and generally exhibit higher intrinsic basal oxidative stress than normal cells, as a consequence, they are more dependent on their antioxidant systems for survival. Thus, the administration of a drug generating additional ROS / RNS or inhibiting cellular antioxidant systems will exert a selective cytotoxicity towards cancer cells while sparing their normal counterparts. This is the biological basis for « redox-based anticancer therapy ». The work described here aims to investigate the redox-based anticancer activity of vitamin C (VitC) and auranofin (AUF), as single drugs or in combination, in breast cancer model. VitC at high pharmacological concentrations shows pro-oxidant properties. In this study, we showed that VitC anticancer activity against breast cancer cell lines was associated to extracellular and intracellular generation of hydrogen peroxide (H₂O₂), accompanied by the oxidation of intracellular glutathione (GSH). A “redoxome” proteomics approach revealed that VitC induces alterations of the redox state of key antioxidant enzymes and a number of cysteines-containing proteins including many proteins involved in RNA and DNA metabolisms and energetic processes. Cell cycle arrest and translation inhibition are associated with VitC-induced cytotoxicity. Finally, bioinformatics analysis and biological experiments identified that peroxiredoxin 1 (PRDX1) expression levels correlate with VitC differential cytotoxicity in breast cancer cells. AUF, an antirheumatic drug and known inhibitor of thioredoxin reductases, has been repurposed recently as a potent anticancer drug. We showed that AUF acts on both the thioredoxin and GSH systems and its impact on GSH system is essential for its anticancer activity. AUF alters the redox state of a number of nucleic acid-binding proteins involved in cell proliferation, cell division and cell cycle, triggering dNTP depletion and cell cycle arrest. Importantly, we observed that the combination of AUF and VitC reveals a synergetic and H₂O₂-mediated cytotoxicity towards MDA-MB-231 cells and other breast cancer cell lines without much impact on normal cells, thus decreasing the cytotoxic concentrations of AUF or VitC single drug. The anticancer potential of AUF/VitC combinations was validated in vivo on MDA-MB-231 xenografts in mice without notable side effects, while administration of AUF or VitC as a single agent failed to suppress tumor growth. Finally, SILAC proteomics, bioinformatics analysis, and functional experiments linked prostaglandin reductase 1 (PTGR1) expression levels with breast cancer cell response to AUF/VitC combination, thus identifying a potential predictive biomarker. Overall, these results provide new insights into the anticancer mechanisms of VitC and AUF, as single drugs and in combination. In particular, this combination of two non-toxic and commonly available drugs could be efficient against triple-negative breast cancer and potentially other cancers with similar redox properties. Further assessment in preclinical and clinical studies of these drugs and combinations could open new avenues for redox-based anticancer therapy.

Dans la majorité des cas, les mitochondries sont nécessaires à la tumorigenèse et à la réponse des cellules cancéreuses aux signaux générés par les facteurs micro-environnementaux (exemples : privation de nutriments, hypoxie) ou par les traitements anticancéreux (exemples : chimiothérapie, radiothérapie). Presque toutes les protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire et importées dans l'organelle. Des machineries d'import ont donc évolué afin de répondre aux besoins d'import protéique. Dans ce contexte, la machinerie régulée par CHCHD4/Mia40 fonctionne dans l’espace intermembranaire et contrôle l’import d’un groupe de protéines (substrats) qui joue des rôles importants dans la survie et la réponse au stress. Les substrats de CHCHD4/Mia40 sont impliqués dans un vaste panel d’activités mitochondriales qui inclut la biogenèse des complexes de la chaîne respiratoire, l’homéostasie lipidique, le stockage du calcium, ainsi que l'ultrastructure et la dynamique mitochondriale. Ce programme de thèse a été dédié à l’étude de la voie d’import CHCHD4/Mia40 dans les cellules cancéreuses et a porté un intérêt tout particulier à l'un des substrats CHCHD4/Mia40 qui façonne l'ultrastructure mitochondriale. En utilisant des techniques d’ARN interférence et de sur-expression de protéines recombinantes, dans un modèle de cancer du côlon, nous avons montré que l’expression du substrat étudié a un effet crucial sur la prolifération et la croissance tumorale. Nos données ont également impliqué cette protéine dans la réponse aux traitements anticancéreux. Dans l'ensemble, ces travaux ouvrent un nouveau champ d'investigations qui non seulement permettra de mieux comprendre la plasticité métabolique des cellules cancéreuses, mais aidera également à identifier de nouveaux biomarqueurs métaboliques. / In the vast majority of cases, mitochondria are required for tumorigenesis and also for the tumoral response to signals generated by the microenvironmental factors (e.g. nutrient deprivation, hypoxia) or to the effects of anti-cancer treatments (e.g. chemotherapy, radiotherapy). As almost all mitochondrial proteins are nuclear-encoded and imported into the organelle, specialized import machineries have evolved in order to meet the need for protein import. Among these machineries, the one that operates in the intermembrane space and is controlled by CHCHD4/Mia40, regulates the import of a group of proteins (substrates) that play important roles in survival and stress response. Substrates of CHCHD4/Mia40 are involved in a broad panel of mitochondrial activities that includes the biogenesis of respiratory chain complexes, lipid homeostasis, calcium storage, as well as ultrastructure and mitochondrial dynamics. This thesis program was dedicated to the study of the CHCHD4/Mia40 import pathway in cancer cells, with a particular interest for one of the CHCHD4/Mia40 substrates that shapes mitochondrial ultrastructure. Using RNA interference approach and recombinant protein overexpression technique, in a colon cancer model, we showed that the expression of this substrate had a crucial effect on proliferation and tumor growth. Our data also involved this protein in the response to anti-cancer treatments. All together, this work opens a new field of investigations that will not only shed new lights on the metabolic plasticity of cancer cells but also help to identify new metabolic biomarkers.

Utveckling av polymer baserade läkemedelsbärare i nanostorlek har blivit allt viktigare för att effektivisera behandling och diagnosering av olika sjukdomar, speciellt cancer. Flera läkemedel som används i kemoterapi har bristfälliga egenskaper som låg löslighet i vatten, oönskad nedbrytbara till dess inaktiva form, och distribution i stora volymer till oönskade organ p.g.a. dess icke-selektiva förmåga. Nanopartiklar är små partiklar med diameter 1-500 nm som genom passiv/aktiv transport kan passera olika biologiska barriärer och transportera läkemedel i optimala mängder till specifika celler. Denna selektiva transport bidrar till ökad terapeutiskt index och minskning av toxiska effekter i övriga delar av kroppen. Hyperförgrenade linjär-dendritiska hybrider är en subgrupp av dendritiska polymer som har stor potential att användas som byggstenar i utvecklingen av läkemedelsbärare. I detta projekt producerades ett bibliotek av hyperförgrenade linjär-dendritiska material via Fischer esterifikation reaktionen som är en snabb, billig och uppskalningsbar produktionsmetod. Vidare post funktionaliserades materialen med allyl grupper för produktion av nano geler genom UV-inducerad korslänkning och vidare funktionalisering. Samtliga producerade hyperförgrenade linjär-dendritiska material hade förmågan att bilda miceller i vatten. Materialen med bäst micelle bildningsförmåga användes för att kemiskt korslänka dem och producera nano geler. Nano gelernas inre del funktionaliserades framgångsrikt med tre olika funktionella grupper; katjoniska, anjoniska och hydrofoba via resterande fria allyler. Detta påvisar att dessa dendritiska nano geler har potential att bära olika material som hydrofobiska läkemedel eller genetiskt material. Dom producerade nano gelerna hade en hydrodynamisk volym inom intervallet 124-200 nm. Detta är fördelaktigt då dem kan transporteras till tumörområdet via ökad permeabilitet och retention, också kallad EPR effekten, utan att initiera ett immunologiskt svar eller filtreras från blodomloppet via njuren. / The development of nano- based drug carriers is of high importance in anti-cancer treatment as anticancer drugs suffers from limitations as low aqueous solubility, non-selective targeting, off-target degradation and low therapeutic concentrations at target site. Hyperbranched polymers are potential candidates as drug carrier due to its unique properties as globular shape, high number of functional groups and high degree of branching. In addition, hyperbranched polymers are synthesized via one-step polymerization reaction with high yields, low costs and good scale-up possibilities. In this project a library of hyperbranched linear-dendritic hybrid materials based of 2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid (bis-MPA) and monofunctional poly (ethylene glycol) (mPEG) was synthesized via the Fischer esterification reaction. The materials were then post functionalised with hydrophobic allyl groups. The materials self-assembled into micelles in water and candidates with best self-assembly ability were used to fabricate dendritic nanogels by UV-induced cross-linking. The formed dendritic nanogels obtained a hydrodynamic volume between 124-200 nm, which indicates that these dendritic nanogels can be used as drug carrier and accumulate at target-site via the enhanced permeability and retention (EPR) effect. The dendritic nanogels inner core was also successfully attached with cationic, hydrophobic and anionic groups respectively. This confirmed that the dendritic nanogels have the potential to encapsulate different types of cargo such as DNA or hydrophobic drugs in the inner core.