O controle biológico pode ser definido como a utilização de antagonistas naturais para a diminuição ou redução de determinado organismo indesejado. Atualmente, esta estratégia constitui uma ferramenta segura e efetiva tanto para o controle de pragas da agricultura e da pecuária, quanto para vetores de doenças que atingem a saúde pública. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae tem se destacado neste âmbito devido às suas características entomopatogênicas e acaricidas, sendo utilizado comercialmente no Brasil para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e estudado, mundialmente, como potencial biopesticida. Não se sabe quais são os fatores que definem a predileção do fungo a determinados hospedeiros, mas se acredita que fatores tais como uma maior adaptação do patógeno, a composição e a morfologia da cutícula possam influenciar. Neste trabalho foi avaliada a capacidade entomopatogênica de 8 linhagens de M. anisopliae sobre dois artrópodes: o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus e a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis. Todas as linhagens testadas de M. anisopliae foram mais efetivas contra D. peruvianus, quando comparadas à A. gemmatalis. A linhagem CG47 mostrou-se eficaz contra ambos os artrópodes testados. As linhagens C12, CG47, CG97 e Nordeste foram ativas contra A. gemmatalis, sendo C12 a mais virulenta. A secreção de proteases e quitinases durante o cultivo do fungo, em presença de cutículas de artrópodes, foi avaliada e parece ter sido influenciada pelo tipo de fonte de carbono disponível no meio de cultivo. A secreção de quitinases, ao contrário das proteases, pareceu não sofrer repressão tão acentuada, com a utilização de fontes facilmente metabolizáveis como a glicose; e, embora existam grandes diferenças entre as linhagens na capacidade de secreção de ambas as enzimas, a virulência observada nos bioensaios pareceu não estar correlacionada com a capacidade quitinolítica ou proteolítica das diferentes linhagens. Levando-se em conta que o processo de infecção de M. anisopliae em hospedeiros é multifatorial e dependente também dos artrópodes-alvo, foi feita a contagem total de hemócitos, sendo possível verificar um aumento destas células de defesa logo após o desafio com o patógeno. Neste trabalho, fica evidente o potencial de determinadas linhagens de M. anisopliae para o controle de D. peruvianus e A. gemmatalis. Também é sugerida a utilização do percevejo manchador do algodão como um novo modelo de pesquisa para os estudos que envolvem as interações patógeno-hospedeiro, mediante a análise de novos fatores de virulência desse patógeno e da resposta do hospedeiro à infecção. / Biological control can be defined as the utilization of natural enemies to reduce or to diminish some unwanted organism. Nowadays, this strategy is a safe and effective tool to control plagues from agriculture and pecuary and also for vectors of some important diseases of public health. The filamentous fungi Metarhizium anisopliae have been standed out in this field because its entomopathogenic and acaricide characteristics, being commercially used in Brazil to control the sugar cane bugs and being studied worldwide as a potential biopesticide. The factors that define the fungi specificity for some hosts are not known, although, is believed that factors as a greater adaptation of the pathogen and the cuticle composition and morphology may influence. In this work the entomopathogenic activity of 8 strains of M. anisopliae was evaluated against two arthropods: the cotton stainer Dysdercus peruvianus and the velvet bean caterpillar Anticarsia gemmatalis. All M. anisopliae strains tested were more efficient against D. peruvianus when compared to A. gemmatalis. Strain CG47 was active for both arthropods tested. Strains C12, CG47, CG97 and Nordeste were active against A. gemmatalis and C12 was the most virulen strain. Protease and chitiunase secretion during fungi growth with arthropod cuticles was tested and seem to be influenced by the kind of carbon source available in the media. Chitinase secretion, on the contrary to proteases seem not to respond so effectively to repression by the utilization of simple carbon compounds as glucose and, despite there are big differences between strains in the capacity to secret both enzymes, the virulence observed during bioassays seemed not to be correlacionated to their proteolitic or chitinolitic activity. Aware that the M. anisopliae infection process on hosts is multifactorial and also depends on arthropod response, the total hemocytes count were made and was possible to detect an increase on cellular counts after challenge with the pathogen. In this work is evident the potential of some M. anisopliae strains to control D. peruvianus and A. gemmatalis and it also suggests the utilization of the cotton stainer as a model for researches about host-pathogen interactions, studies about pathogen virulence factors as well studies to elucidate the host response to infection.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T11:26:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T11:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) Previous issue date: 2010-10-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, por ser considerada uma das principais pragas da cultura da soja, tem sido alvo de estudos visando a busca de alternativas para o seu controle. A utilização de inibidores de proteases (IPs) como alternativa para o controle de pragas tem sido amplamente estudada. Sabe-se que uma rota de defesa vegetal, talvez a mais conhecida, é denominada rota octadecanóide (ou via das lipoxigenases), a qual culmina com a produção do ácido jasmônico: um hormônio vegetal que ativa genes que expressam inibidores de proteases, tidos como agentes anti-metabólicos, pois levam os insetos a uma deficiência protéica. Os IPs atuam no intestino médio dos herbívoros, inibindo a ação das proteases sobre as proteínas provindas da alimentação, havendo, portanto, uma redução na disponibilidade de aminoácidos ao inseto, podendo resultar no atraso do crescimento e reprodução desses herbívoros e, consequentemente, na sua morte. Este trabalho teve por objetivos avaliar a capacidade da planta da soja de responder ao ataque de A. gemmatalis através da via das lipoxigenases e as respostas bioquímica, comportamental e fisiológica da lagarta da soja a concentrações crescentes do inibidor sintético de serino-proteases, berenil. Para tal, as lagartas foram alimentadas com plantas de soja da variedade IAC-PL-1, pulverizadas com berenil nas doses 0,0; 0,008; 0,01; 0,20; 0,60; e 1,0% (p/v ) e com plantas de soja das variedades IAC-18, IAC-24 e FOSCARIN-31 contendo 0,0; 0,60; e 1,0% (p/v) de berenil. Nas quatro cultivares testadas, observou-se que após o ataque da lagarta da soja ocorreu um aumento no pool de lipoxigenases nas folhas, o que levou a uma alta produção de inibidores de protease. Nas lagartas que foram alimentadas com plantas da variedade IAC-PL-1, observou-se interferência de berenil na resposta comportamental desses insetos, que tiveram preferência por plantas que não receberam pulverizações com o inibidor, o mesmo não sendo observado para as mariposas com relação à preferência para oviposição. Com relação ao desenvolvimento pós-embrionário, ocorreu uma redução significativa no ganho de peso. Foi observada também uma significativa redução na sobrevivência e no tempo de vida das larvas alimentadas com as maiores doses do inibidor. Além disso, houve inibição das atividades proteolítica e tríptica do intestino das lagartas nas quatro cultivares de soja. Os resultados obtidos indicam que a utilização de berenil é uma estratégia promissora para o controle da lagarta da soja e possivelmente de outros insetos-praga que tenham a tripsina como principal enzima digestiva. / The caterpillar, Anticarsia gemmatalis, for being considered a pest of soybean, has been the target of studies aimed at finding alternatives to its control. The use of protease inhibitors (PIs) as an alternative for pest control has been widely studied. It is known that a plant defense route, perhaps the best known is called octadecanóide route (or lipoxygenase pathway), which culminates with the production of jasmonic acid: a plant hormone that activates genes expressing protease inhibitor, taken as anti-metabolic agents, since they bring the insects to a protein deficiency. IPs work in the midgut of herbivores, inhibiting the action of proteases on proteins originated from food, therefore there is a reduction in the availability of amino acids to the insect, which can result in delayed growth and reproduction of herbivores and hence in its death. This study aimed to evaluate the ability of the soybean plant to respond to the attack of A. gemmatalis through the lipoxygenase pathway and biochemical responses, behavioral and physiological soybean caterpillar to increasing concentrations of synthetic inhibitor of serine proteases, berenil. To this end, the larvae were fed with soybean variety IAC PL-1, treated with berenil doses 0.0, 0.008, 0.01, 0.20, 0.60, and 1.0% (w/v) and the soybean variety IAC-18, IAC-24 and Foscarin-31 containing 0.0, 0.60, and 1.0% (w/v) of berenil. In the four cultivars tested, it was observed that after the attack of soybean caterpillar was an increase in the pool of lipoxygenase in the leaves leading to a high production of protease inhibitors. In the caterpillars that were fed on plants of the variety IAC PAL-1, there was interference from berenil behavioral response of these insects, which had no preference for plants that received the inhibitor sprays, but these were not observed for moths in relation to oviposition preference. Regarding the post-embryonic development, there was a significant reduction in weight gain. There was also a significant reduction in the survival and life span of larvae fed the highest doses of the inhibitor. Furthermore, there was inhibition of the proteolytic and tryptic activities of the gut of caterpillars in the four cultivars. The results indicate that the use of berenil is a promising strategy for control of soybean caterpillar and possibly other insect pests that have the main digestive enzyme trypsin. / Tese importada do Alexandria

O controle biológico pode ser definido como a utilização de antagonistas naturais para a diminuição ou redução de determinado organismo indesejado. Atualmente, esta estratégia constitui uma ferramenta segura e efetiva tanto para o controle de pragas da agricultura e da pecuária, quanto para vetores de doenças que atingem a saúde pública. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae tem se destacado neste âmbito devido às suas características entomopatogênicas e acaricidas, sendo utilizado comercialmente no Brasil para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e estudado, mundialmente, como potencial biopesticida. Não se sabe quais são os fatores que definem a predileção do fungo a determinados hospedeiros, mas se acredita que fatores tais como uma maior adaptação do patógeno, a composição e a morfologia da cutícula possam influenciar. Neste trabalho foi avaliada a capacidade entomopatogênica de 8 linhagens de M. anisopliae sobre dois artrópodes: o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus e a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis. Todas as linhagens testadas de M. anisopliae foram mais efetivas contra D. peruvianus, quando comparadas à A. gemmatalis. A linhagem CG47 mostrou-se eficaz contra ambos os artrópodes testados. As linhagens C12, CG47, CG97 e Nordeste foram ativas contra A. gemmatalis, sendo C12 a mais virulenta. A secreção de proteases e quitinases durante o cultivo do fungo, em presença de cutículas de artrópodes, foi avaliada e parece ter sido influenciada pelo tipo de fonte de carbono disponível no meio de cultivo. A secreção de quitinases, ao contrário das proteases, pareceu não sofrer repressão tão acentuada, com a utilização de fontes facilmente metabolizáveis como a glicose; e, embora existam grandes diferenças entre as linhagens na capacidade de secreção de ambas as enzimas, a virulência observada nos bioensaios pareceu não estar correlacionada com a capacidade quitinolítica ou proteolítica das diferentes linhagens. Levando-se em conta que o processo de infecção de M. anisopliae em hospedeiros é multifatorial e dependente também dos artrópodes-alvo, foi feita a contagem total de hemócitos, sendo possível verificar um aumento destas células de defesa logo após o desafio com o patógeno. Neste trabalho, fica evidente o potencial de determinadas linhagens de M. anisopliae para o controle de D. peruvianus e A. gemmatalis. Também é sugerida a utilização do percevejo manchador do algodão como um novo modelo de pesquisa para os estudos que envolvem as interações patógeno-hospedeiro, mediante a análise de novos fatores de virulência desse patógeno e da resposta do hospedeiro à infecção. / Biological control can be defined as the utilization of natural enemies to reduce or to diminish some unwanted organism. Nowadays, this strategy is a safe and effective tool to control plagues from agriculture and pecuary and also for vectors of some important diseases of public health. The filamentous fungi Metarhizium anisopliae have been standed out in this field because its entomopathogenic and acaricide characteristics, being commercially used in Brazil to control the sugar cane bugs and being studied worldwide as a potential biopesticide. The factors that define the fungi specificity for some hosts are not known, although, is believed that factors as a greater adaptation of the pathogen and the cuticle composition and morphology may influence. In this work the entomopathogenic activity of 8 strains of M. anisopliae was evaluated against two arthropods: the cotton stainer Dysdercus peruvianus and the velvet bean caterpillar Anticarsia gemmatalis. All M. anisopliae strains tested were more efficient against D. peruvianus when compared to A. gemmatalis. Strain CG47 was active for both arthropods tested. Strains C12, CG47, CG97 and Nordeste were active against A. gemmatalis and C12 was the most virulen strain. Protease and chitiunase secretion during fungi growth with arthropod cuticles was tested and seem to be influenced by the kind of carbon source available in the media. Chitinase secretion, on the contrary to proteases seem not to respond so effectively to repression by the utilization of simple carbon compounds as glucose and, despite there are big differences between strains in the capacity to secret both enzymes, the virulence observed during bioassays seemed not to be correlacionated to their proteolitic or chitinolitic activity. Aware that the M. anisopliae infection process on hosts is multifactorial and also depends on arthropod response, the total hemocytes count were made and was possible to detect an increase on cellular counts after challenge with the pathogen. In this work is evident the potential of some M. anisopliae strains to control D. peruvianus and A. gemmatalis and it also suggests the utilization of the cotton stainer as a model for researches about host-pathogen interactions, studies about pathogen virulence factors as well studies to elucidate the host response to infection.

O controle biológico pode ser definido como a utilização de antagonistas naturais para a diminuição ou redução de determinado organismo indesejado. Atualmente, esta estratégia constitui uma ferramenta segura e efetiva tanto para o controle de pragas da agricultura e da pecuária, quanto para vetores de doenças que atingem a saúde pública. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae tem se destacado neste âmbito devido às suas características entomopatogênicas e acaricidas, sendo utilizado comercialmente no Brasil para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e estudado, mundialmente, como potencial biopesticida. Não se sabe quais são os fatores que definem a predileção do fungo a determinados hospedeiros, mas se acredita que fatores tais como uma maior adaptação do patógeno, a composição e a morfologia da cutícula possam influenciar. Neste trabalho foi avaliada a capacidade entomopatogênica de 8 linhagens de M. anisopliae sobre dois artrópodes: o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus e a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis. Todas as linhagens testadas de M. anisopliae foram mais efetivas contra D. peruvianus, quando comparadas à A. gemmatalis. A linhagem CG47 mostrou-se eficaz contra ambos os artrópodes testados. As linhagens C12, CG47, CG97 e Nordeste foram ativas contra A. gemmatalis, sendo C12 a mais virulenta. A secreção de proteases e quitinases durante o cultivo do fungo, em presença de cutículas de artrópodes, foi avaliada e parece ter sido influenciada pelo tipo de fonte de carbono disponível no meio de cultivo. A secreção de quitinases, ao contrário das proteases, pareceu não sofrer repressão tão acentuada, com a utilização de fontes facilmente metabolizáveis como a glicose; e, embora existam grandes diferenças entre as linhagens na capacidade de secreção de ambas as enzimas, a virulência observada nos bioensaios pareceu não estar correlacionada com a capacidade quitinolítica ou proteolítica das diferentes linhagens. Levando-se em conta que o processo de infecção de M. anisopliae em hospedeiros é multifatorial e dependente também dos artrópodes-alvo, foi feita a contagem total de hemócitos, sendo possível verificar um aumento destas células de defesa logo após o desafio com o patógeno. Neste trabalho, fica evidente o potencial de determinadas linhagens de M. anisopliae para o controle de D. peruvianus e A. gemmatalis. Também é sugerida a utilização do percevejo manchador do algodão como um novo modelo de pesquisa para os estudos que envolvem as interações patógeno-hospedeiro, mediante a análise de novos fatores de virulência desse patógeno e da resposta do hospedeiro à infecção. / Biological control can be defined as the utilization of natural enemies to reduce or to diminish some unwanted organism. Nowadays, this strategy is a safe and effective tool to control plagues from agriculture and pecuary and also for vectors of some important diseases of public health. The filamentous fungi Metarhizium anisopliae have been standed out in this field because its entomopathogenic and acaricide characteristics, being commercially used in Brazil to control the sugar cane bugs and being studied worldwide as a potential biopesticide. The factors that define the fungi specificity for some hosts are not known, although, is believed that factors as a greater adaptation of the pathogen and the cuticle composition and morphology may influence. In this work the entomopathogenic activity of 8 strains of M. anisopliae was evaluated against two arthropods: the cotton stainer Dysdercus peruvianus and the velvet bean caterpillar Anticarsia gemmatalis. All M. anisopliae strains tested were more efficient against D. peruvianus when compared to A. gemmatalis. Strain CG47 was active for both arthropods tested. Strains C12, CG47, CG97 and Nordeste were active against A. gemmatalis and C12 was the most virulen strain. Protease and chitiunase secretion during fungi growth with arthropod cuticles was tested and seem to be influenced by the kind of carbon source available in the media. Chitinase secretion, on the contrary to proteases seem not to respond so effectively to repression by the utilization of simple carbon compounds as glucose and, despite there are big differences between strains in the capacity to secret both enzymes, the virulence observed during bioassays seemed not to be correlacionated to their proteolitic or chitinolitic activity. Aware that the M. anisopliae infection process on hosts is multifactorial and also depends on arthropod response, the total hemocytes count were made and was possible to detect an increase on cellular counts after challenge with the pathogen. In this work is evident the potential of some M. anisopliae strains to control D. peruvianus and A. gemmatalis and it also suggests the utilization of the cotton stainer as a model for researches about host-pathogen interactions, studies about pathogen virulence factors as well studies to elucidate the host response to infection.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1012402 bytes, checksum: e93e297eb37b3a24f8504893d77af531 (MD5) Previous issue date: 2007-07-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Protease inhibitors can reduce the digestive efficiency, to delay the development and to diminish the insect proteolytic activity resulting in increase of mortality through deficiency of free amino acids for maintenance of vital functions. The subject of this work were to evaluate if A. gemmatalis larvae feeding in artificial diets containing increasing concentrations of synthetic trypsin inhibitor bisbenzamidine affects negatively the insect performance, reduce the alimentary consumption, the digestibility, the assimilation efficiency of the food ingested and digested, the insect proteolytic activity and protein digestibility. To test these hypotheses were realized bioassays with individualized caterpillars and supplied daily with diets containing 0; 0,00095; 0,0019; 0,0038; 0,0076; 0,0152; 0,0304; 0,0608; 0,0912; 0,125 e 0,25% (w/w) of berenil during the entire larval phase. The digestion indices, the duration of larval phase and life cycle, the accumulated survival and the average of time survival, the pupae and adults weight, the body and wings of the adults moths were determined. Additionally, were evaluated the protein digestibility and the enzymatic activity of midgut extracts of A. gemmatalis exposed to berenil in diet, in the same concentrations above. All parameters assessed of life history were negatively affected with the increase of inhibitors in diet. Were verified an increase in the larval phase and life cycle duration, reduction in the pupae weight and body and wings length. There was reduction in the incorporated biomass and the relative growth rate. Otherwise, there were increases in ingestion, approximated digestion, and relative diet consumption rate and in the ingestion and excretion balance. The diet individual consumption increased until the 0.0076% of berenil, diminished with the increase of inhibitor concentration. The protein digestibility was directly proportional to berenil concentration while the proteolytic, amidolytic and esterolytic activities diminished with the increasing of inhibitor concentration. Therefore, albeit the berenil mixed in increasing concentrations in diet affects negatively in all life history parameters of insect, the caterpillars improve the diet intake. However, even so the total digestibility and the protein digestibility increase in higher inhibitor concentrations, the insect show lower enzymatic activity and, consequently, reduction in the efficiency in assimilation of ingested and digested food, indicating that the insect did not show adaptative mechanisms to prevent the inhibition of tripsina-like enzymes existents in your digestive tract. Thus, the berenil is a promising strategy to new studies with the subject of to synthesis mimicry peptides to apply in the field to control A. gemmatalis caterpillars in the soybean crops. / Inibidores de proteases podem reduzir a eficiência digestiva, retardar o desenvolvimento e diminuir a atividade proteolítica do inseto, resultando em aumento da mortalidade pela deficiência de aminoácidos livres para a manutenção das funções vitais. Este trabalho teve por objetivos avaliar se concentrações crescentes do inibidor sintético de serino- proteases, berenil, presente na dieta de A. gemmatalis afeta negativamente a performance do inseto, reduz o consumo alimentar, a digestibilidade e a eficiência na assimilação do alimento ingerido e digerido, reduz a atividade proteolítica e tríptica do inseto e reduz sua digestibilidade protéica. Para testar essa hipótese foram realizados bioensaios com lagartas individualizadas e alimentadas diariamente em dietas contendo 0; 0,00095; 0,0019; 0,0038; 0,0076; 0,0152; 0,0304; 0,0608; 0,0912; 0,125 e 0,25% (p/p) de berenil durante toda a fase larval. Foram determinados os índices digestórios, a duração do ciclo de vida e da fase larval, a sobrevivência acumulada e o tempo médio de vida, o peso das pupas e dos adultos, o tamanho corporal e das asas das mariposas adultas. Adicionalmente, foram avaliadas a digestibilidade protéica e a atividade enzimática de extratos do intestino médio de A. gemmatalis submetidas ao berenil na dieta, nas concentrações determinadas acima. Todos os parâmetros avaliados da história de vida do inseto foram afetados negativamente com o aumento da concentração do inibidor na dieta. Foi verificado aumento na duração da fase larval e do ciclo de vida, diminuição no peso das pupas, adultos, tamanho dos adultos e comprimento das asas. Houve redução na biomassa incorporada e na taxa relativa de crescimento. Por outro lado, houve aumento na ingestão, digestibilidade aproximada, na taxa de consumo relativa da dieta e no balanço entre ingestão e excreção das fezes. O consumo individual total da dieta aumentou até a concentração de 0,0076% do inibidor na dieta, decrescendo com o aumento da concentração de inibidor. A digestibilidade protéica foi diretamente proporcional à concentração de berenil enquanto as atividades proteolítica, amidásica e esterásica diminuíram com o aumento da concentração do inibidor. Desse modo, embora a presença de berenil em concentrações crescentes na dieta interfira negativamente em todos os parâmetros da história de vida do inseto, as lagartas respondem aumentando a ingestão da dieta. Contudo, mesmo que a digestibilidade total e a digestibilidade protéica aumentem em concentrações maiores de inibidor, o inseto apresenta menor atividade enzimática e, conseqüentemente, baixa eficiência na assimilação do alimento ingerido e digerido, indicando que o inseto não demonstra mecanismos adaptativos para impedir a inibição das enzimas tripsina-like presentes em seu sistema digestivo. Nesse sentido, o berenil surge como estratégia promissora para novos estudos visando a síntese de peptídeos miméticos para aplicação no campo como forma de controle de A. gemmatalis nos cultivos de soja.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:48:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697501 bytes, checksum: 226788e066952b4d3ef7e7b8fa9382b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697501 bytes, checksum: 226788e066952b4d3ef7e7b8fa9382b3 (MD5) Previous issue date: 2002-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A identificação e caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao ataque de insetos. Neste estudo, a atividade proteolítica em intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi investigada. O extrato enzimático foi obtido após ciclos de congelamento e descongelamento dos intestinos e posterior centrifugação do homogenato a 100,000 g, e o sobrenadante resultante (Fração I) foi utilizado como fonte de proteína solúvel. Como parte de nossos estudos, envolvendo a identificação de proteases do intestino médio de larvas de of A. gemmatalis, a presença de enzimas ligadas a membrana foi avaliada. Para este propósito, o precipitado do homogenato de intestino médio centrifugado a 100,000 g. foi ressuspendido em tampão com Triton X-100, centrifugado como anteriormente e o sobrenadante (Fração II) usado como fonte de proteases ligadas à membrana. A Fração I foi capaz de hidrolisar a caseína, e o substratos sintéticos L -BApNA e TAME. Usando L - BApNA como substrato, a atividade da Fração I foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos capazes de inibir a atividade da Fração I, com maior inibição observada com TLCK e benzamidina. De acordo com este resultados, conclui-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease trpsina-like. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para a Fração I. O pH ótimo foi de 8.5 e à temperatura ótima foi a 35 o C, sobre L -BApNA. O pH ótimo e temperatura foi de 8.0 e 30 o C, sobre TAME. O efeito de cálcio na atividade da Fração I foi investigado usando L -BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.32mM e 52.5μM, respectivamente. A Fração II foi capaz de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos, L -BApNA e TAME. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L -BApNA como substrato. EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina foram capazes de inibir a atividade da Fração II, com TLCK e benzamidina exibindo forte inibição. Estes resultados mostram que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui proteases tripsin-like ligadas a membrana. Esta atividade tripsina-like foi melhor caracterizada. O pH ótimo para a Fração II usando L -BApNA e TAME foi 8.5 e 8.0, respectivamente. A atividade ótima exibida foi a 50 o C para ambos substratos, L-BApNA e TAME. Na concentração de 20 mM de cálcio, a Fração II mostrou um aumento na atividade sobre o L -BApNA. Os valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.23mM e 95.4 μM, respectivamente. / The identification and characterization of proteases from insects midgut are important in developing cultivars resistant to insect attack. In this study, proteolytic activities in the larval midgut of A. gemmatalis were investigated. Enzymatic extracts were obtained after frozen-and-thawed several times and centrifugation of the midgtus homogenate at 100,000 g, and the resulting supernatant (Fraction I) used as source of soluble proteins. As part of our studies involving the identification of proteases from midgut larvae of A. gemmatalis, the presence of the membrane-bound enzymes was evaluated. For this purpose, the pellet from midgut homogenates centrifuged at 100,000 g. was resuspended in buffer with Triton X-100, centrifuged as before and the supernatant (Fraction II), used as a source of membrane-bound proteases. Fraction I was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Using L-BApNA as substrate, Fraction I activity was investigated in the presence of several protease inhibitors. Thus, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidine and aprotinin, were all able to inhibit Fraction I activity, with greater inhibition observed with TLCK and benzamidine. According with these results, we conclude that the midgut larvae of A. gemmatalis have a trypsin-like serine protease. In order to further characterize the trypsin-like activities, the optimal activity for Fraction I was determined. The optimal pH was 8.5 and the optimal temperature was 35 o C, toward L-BApNA. Optimum pH and temperature were 8.0 and 30 o C, toward TAME. The effect of calcium on Fraction I activity was investigated using L-BApNA as substrate. The maximum activity was obtained at 20 mM calcium concentration. K Mapp values for L- BApNA and TAME were 0.32mM and 52.5μM, respectively. Fraction II was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Also, the effect of several proteases inhibitors were evaluated, using L-BApNA as substrate. EDTA, PMSF, TLCK, Benzamidine and Aprotinin were able to inhibit Fraction II activity, with TLCK and benzamidine exhibiting stronger inhibition. These results showed that the midgut larvae of A. gemmatalis have a membrane-bound trypsin-like protease. These trypsin-like activities were further characterized. Optimum of pH for Fraction II activity using L-BApNA and TAME were 8.5 and 8.0, respectively. Optimal activity was exhibited at 50 o C toward L- BApNA and TAME. At 20 mM calcium concentration, Fraction II showed the highest activity toward L-BApNA. K Mapp values for L-BApNA and TAME were 0.23mM and 95.4 μM, respectively. / Dissertação importada do Alexandria

Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Maria das Graças Machado Freire / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_CarlosHenriqueZanini_M.pdf: 3256360 bytes, checksum: 92dcd99d5853476244d7668b4ceb774b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-02-11T10:42:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 686211 bytes, checksum: 61adb69eee4945633365788501e8762f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-11T10:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 686211 bytes, checksum: 61adb69eee4945633365788501e8762f (MD5) Previous issue date: 2015-02-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Anticarsia gemmatalis é uma espécie da ordem Lepidoptera caracterizada pela capacidade de expressão diferencial de seu genótipo como parte de estratégias de adaptação às mudanças ambientais. O fenômeno é denominado plasticidade fenotípica e é considerado uma das principais razões do seu sucesso evolutivo. Os fenótipos ou “fases” descritas para as larvas de Anticarsia gemmatalis são: solitária, gregária e intermediária. Estas fases se diferenciam não só em parâmetros morfológicos, mas também em fisiológicos, ecológicos e comportamentais. No que respeita ao comportamento, diversos estudos confirmam que este é um componente básico da plasticidade fenotípica e uns dos primeiros em expressar-se quando ocorre uma mudança de fase. Para lepidópteros, embora se conheçam algumas pistas, os fatores que induzem e mantem o processo de mudança de fase não foram completamente elucidados. Diante disso os objetivos do nosso trabalho foram: descrever os repertórios comportamentais das fases solitária e gregária de Anticarsia gemmatalis e, testar se determinados estímulos mecânicos ou/e químicos induzem a mudança de fase nesta espécie. Para a descrição do repertório comportamental foram utilizadas 50 larvas em fase solitária e 50 em fase gregária. Em uma arena experimental cada uma das larvas foi observada durante 780s, registrando assim diferentes componentes do comportamento. Para a indução da mudança de fase foram selecionadas larvas em fase solitária e divididas em grupos nos quais foram aplicados estímulos. Para aplicar o estimulo mecânico foram selecionadas 120 larvas solitárias e divididas em quatro grupos de 30. Foram feitas uma serie de toques com nylon na cabeça, no terceiro segmento abdominal ou no último segmento abdominal, segundo o grupo. O grupo controle permaneceu sem estimulo. Para aplicar o estimulo químico foram selecionadas 160 larvas e divididas em quatro grupos de 40. Foram usados extratos de hidrocarbonetos cuticulares de: larvas em fase solitária de Anticarsia gemmatalis, larvas em fase gregária de Anticarsia gemmatalis e larvas de Spodoptera frugiperda, segundo o grupo. Para o grupo controle foi utilizado o solvente orgânico usado na extração dos hidrocarbonetos. As larvas selecionadas foram expostas aos hidrocarbonetos cuticulares colocando-as para caminhar sobre um papel filtro que continha os extratos durante 12 horas. Para o primeiro objetivo, os resultados indicaram que existe sim uma diferença entre o comportamento das larvas em fase solitária e fase gregária. As larvas em fase solitária se caracterizaram por apresentar comportamento mais sedentário e por realizar um maior número de movimentos com a cabeça; pelo contrário as larvas em fase gregária se caracterizaram por serem mais ativas na arena e por realizar um maior número de eventos de caminhada. Com respeito ao segundo objetivo, os resultados indicaram que nenhum dos tratamentos foi diferente significativamente (p<0.05), o seja nenhum dos estímulos aplicados induziu a mudança de fenótipo nesta espécie. Acreditamos que as diferenças nos padrões comportamentais poderiam estar refletindo processos adaptativos inerentes ao estilo de vida de cada fase e também, que estas diferenças podem ter um impacto sobre a biologia, ecologia e estratégias de distribuição de Anticarsia gemmatalis. / Anticarsia gemmatalis is a species of Lepidoptera characterized by the capacity to express differentially its genotype as part of adaptation strategies to environmental changes. This phenomenon is called phenotypic plasticity and is considered one of the main reasons for the evolutionary success. Phenotypes or "phases" described for larvae of Anticarsia gemmatalis are: solitary, gregarious and intermediary. These phases differ not only in morphological parameters but also in physiological, ecological and behavioural parameters. As regards the behaviour, many studies have confirmed that this is a basic component of phenotypic plasticity and the first to be expressed when there is a phase change. For Lepidoptera, although some clues are known, the factors that induce and maintain the phase change process have not been fully elucidated. Thus, the objectives of our study were to describe the behavioural repertoires of solitary and gregarious phases of Anticarsia gemmatalis and test if specific mechanical and/or chemical stimuli induce the phase change in this species. For the description of the behavioural repertoire were used 50 solitary and 50 gregarious phase larvae. In an experimental arena, each larva was observed for 780s in order to register the different components of its behaviour. For the induction of phase change, solitary phase larvae were selected and divided into groups in which stimuli were applied. To apply the mechanical stimulus 120 solitary larvae were selected and divided into 4 groups of 30 which were stimulated with a nylon thread on the head, on the third abdominal segment or on the last abdominal segment, according to the group. The control group remained without stimulation. To apply chemical stimulus 160 larvae were selected and divided into four groups of 40. For the three stimulus groups cuticular hydrocarbon extracts of Anticarsia gemmatalis solitary phase larvae, Anticarsia gemmatalis gregarious phase larvae and Spodoptera frugiperda larvae were used, according to the group. For the control group we applied the organic solvent used in the extraction of cuticular hydrocarbons. The selected larvae were exposed to cuticular hydrocarbons by allowing them to walk on a filter paper containing the extracts for 12 hours. For the first objective, the results indicated that there is a difference between the behaviours of Anticarsia gemmatalis solitary and gregarious phases. The solitary phase larvae are characterized by having a more sedentary behaviour and perform a larger number of head movements; meanwhile, gregarious phase larvae are characterized by being more active in the arena and by perform a greater number of walking events. Regarding the second objective, the results indicated that none of the treatments differed significantly (p <0.05), so none of the applied stimuli induced a phase change in this species. We believe that differences in behavioural patterns could be reflecting adaptive processes inherent to lifestyles of the phases and that these differences can have an impact on the biology, ecology and distribution strategies of Anticarsia gemmatalis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-25T16:40:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1084743 bytes, checksum: 1f4401e739fab43ab255d4a9e73125c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-25T16:40:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1084743 bytes, checksum: 1f4401e739fab43ab255d4a9e73125c1 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Animais e microrganismos causadores de doenças estão em constante confronto. Enquanto patógenos evoluem de forma a superar barreiras dos hospedeiros, as defesas imunes do hospedeiro são aprimoradas para impedir o estabelecimento de doenças. Não só indivíduos, mas populações podem ser afetadas pela ação de patógenos. Assim, organismos possuem mecanismos que evitam o processo infeccioso através da percepção de sinais ambientais. O aumento da densidade de co-específicos é um destes sinais e indivíduos capazes de percebê-los poderiam aumentar plasticamente o investimento em defesas imunes; hipótese conhecida como “Profilaxia Densidade- Dependente” (PDD). Outra forma de proteção em nível de população é a transferência de defesas imunes para a prole, especialmente via herança epigenética. Defesas imunes tem um alto custo metabólico e a combinação de ambas as estratégias, PDD e transferência vertical, poderia otimizar a prevenção de doenças em organismos que estão sujeitos a surtos populacionais e possivelmente apresentam sobreposição de gerações, como insetos-praga. Anticarsia gemmatalis é conhecida por ter hábito solitário, porém apresenta plasticidade fenotípica dependente da densidade como algumas espécies de insetos gregários. Por isso, A. gemmatalis foi escolhida como modelo para testar se há transferência transgeracional de PDD. Para isso, avaliamos a atividade antimicrobiana (provavelmente uma lisozima), através da zona de inibição em placas contendo a bactéria Micrococcus lysodeikticus, em ovos de mariposas de diferentes fenótipos (i.e. lagartas foram criadas solitárias ou gregárias e expressaram o fenótipo verde ou preto, respectivamente). Casais foram acasalados em gaiolas nas quatro combinações possíveis entre fêmeas e machos exibindo os fenótipos “verde” ou “preto”. Dessa forma, seria possível identificar qual dos parceiros estaria contribuindo mais para a transferência de defesas à prole. Além disso, foram avaliados o número de ovos por fêmea como forma de investigar possíveis trade-offs entre a defesa imune e reprodução. Não houve diferenças significativas na atividade antimicrobiana nem no número de ovos de mariposas expressando o fenótipo verde ou preto na fase larval. Os resultados indicam que, pelo menos para essa defesa imunológica, não há transferência transgeracional de PDD à prole de A. gemmatalis. Como essa espécie é migratória, talvez a prole não experimente as mesmas condições ambientais dos pais, não precisando assim transferir defesas imunológicas à prole mediante estímulos sofridos pelos pais. Propomos investigar a transferência de DDP em outros ínstares larvais da prole, através da avaliação de diferentes parâmetros imunes, para melhor subsidiar nossa conclusão. / Animals and disease-causing microorganisms are in a constant fight. While pathogens evolve ways to breach the host defences, hosts enhance defences to prevent the establishment of diseases. Not only individuals themselves, but populations may be affected by pathogens. Thus, organisms have mechanisms to avoid infectious processes through perception of environmental clues. The increase in population density of conspecifics may be such a clue, and individuals able to perceiving it could increase plastically the investment in immune defences; hypothesis known as ‘Density- dependent prophylaxis’ (DDP). Furthermore, organisms may invest plastically in defences of offspring via epigenetic. It is known that immune defences pose a high cost to hosts, and the use of the two strategies – DDP and transgenerational transfer – could optimize the prevention of disease in organisms subject to population fluctuation and likely overlap of generations, such as insect pests. Anticarsia gemmatalis is known to be a lone-living insect, but presents density-dependent plasticity in phenotype as such group-living insects. Thus, A. gemmatalis was chosen as model to test if there is transgenerational transfer of DDP. It was assessed the antimicrobial activity (lysozyme- like activity), through inhibition zone in plates with the bacterium Micrococcus lysodeikticus, in eggs of moths from different phenotypes (i.e. caterpillars were raised alone or in groups and expressed green or black phenotype, respectively). Moths were paired in cages in four possible combinations between females and males expressing “green” or “black” phenotypes. Thus, it was possible to identify the contribution of each partner in the provision of immune defence to offspring. Furthermore, it was assessed the number of eggs per female as a way to find out likely trade offs between immunity and reproduction. There were no significant differences in antimicrobial activity neither in the number of eggs from moths of green or black phenotype. These results indicate that, at least for the immune defence assessed here, there is no transgenerational transfer of DDP to offspring. As this is a migratory species, maybe the offspring do not experience the same environmental conditions of the parents; hence they do not transfer immune defences to offspring by stimuli experienced by parents. It is proposed to investigate the transfer of DDP in other larval instars of offspring, through the assessing of different immune parameters, to better support our conclusion. / O autor não apresentou título em português.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Soybeans yield is affected by many aspects and insect pests are important for its high reproductive potential and its yield reduction capacity. The main insect pest strategy of control is the chemical control with the use of insecticide associated with adjuvant. The study aimed to evaluate the effect of adjuvants associated with insecticide on the control of defoliating caterpillars and seed sucking bugs on soybeans. Two field experiments were carried out with the application of the treatments in distinct moments to each biologic target. The results of Anticarsia gemmatalis (small and large caterpillars and the total of caterpillars) demonstrated that the association of the Diflubenzurom insecticide with the adjuvants Assist® and Naturo il® presented superior agronomic efficiency despite not having statistical difference. The results of Piezodorus guildinii and Nezara viridula (large nymphs and adults and the total of stink bugs) control showed that with the use of adjuvant did not presented statistical difference, however, the agronomic efficiency of the Tiamethoxam and Lambda-cialotrina was superior with the addition of Assist® and Naturo il®. Based on the results was concluded that the adding of Assist® and Naturo il® to the Diflubenzurom insecticide improves the control of A. gemmatalis (small and large caterpillars and the total of caterpillars) on soybeans. The Adjuvants Assist® and Naturo il® improves the efficiency of Tiamethoxam and Lambda-cialotrina on the control of P. guildinii (nymphs above the 3o instar and adults) and N. viridula (nymphs above 3o instar and adults). / A produtividade da soja é afetada por diversos fatores, e os insetos-praga são importantes pelo seu alto potencial reprodutivo e a sua capacidade de reduzir a produtividade. A principal estratégia de controle dos insetos-pragas é o controle químico com o uso de inseticidas, associados a adjuvantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de adjuvantes associados com inseticidas no controle de lagartas desfolhadoras e percevejos sugadores de grãos, na cultura da soja. Foram realizados dois experimentos em campo, com aplicação dos tratamentos em momentos distintos para cada alvo biológico. Os resultados de Anticarsia gemmatalis (lagartas pequenas e grandes e o total de lagartas), demonstraram que a associação dos adjuvantes ao inseticida Diflubenzurom embora não tenham mostrado diferença estatística, a eficiência agronômica foi superior com a adição de Assist® e Naturo il®. Os resultados do controle de Piezodorus guildinii e Nezara viridula (ninfas grandes e adultos e o total de percevejos) mostraram que com a utilização de adjuvantes não houve diferença estatística, entretanto, a eficiência agronômica do inseticida Tiametoxam e Lambda−cialotrina foi superior pela adição de Assist® e Naturo il®. Com base nos resultados conclui-se que a adição de Assist® e Naturo il® ao inseticida Diflubenzurom, melhora o controle de A. gemmatalis (lagartas pequenas, grandes e no total de lagartas) em soja. Os adjuvantes Assist® e Naturo il® melhoram a eficiência de Tiametoxam e Lambda−cialotrina no controle de P. guildinii (Ninfas acima de 3° instar e adultos) e N. viridula (ninfas de 3° instar e adultos).