L'amibe Dictyostelium discoideum sécrète des corps multilamellaires (CMLs) à partir de sa voie endocytique lorsqu'elle est cultivée en présence de bactéries. L'objectif de la présente étude consistait à comprendre le rôle des CMLs dans la physiologie de D. discoideum en caractérisant l'antigène de l'anticorps H36 présent sur les CMLs et celui de l'anticorps H72 qui se retrouve dans la voie endocytique. L'identification des antigènes a été réalisée par une immunoprécipitation suivie par une analyse en spectrométrie de masse. L'identité de l'antigène H36 a été déterminée et a été confirmée par des analyses en Western blot pour être la protease cprG aussi nommée CP7. Dans le cas de l'anticorps H72, l'identification n'a pas été fructueuse. Cette étude démontre que les CMLs sécrétés contiennent donc la protease cprG. Il s'agit de la deuxième description de l'association d'une protease avec des structures membranaires sécrétées par l'amibe D. discoideum.

Encore aujourd'hui, la prévention de la grippe par la vaccination ou les approches thérapeutiques ne sont que partiellement efficaces. Les caractères d’hypervariabilité et de transmission du virus influenza lui permettent d’infecter les populations du monde entier malgré une immunité préexistante acquise par infection ou vaccination. En 2009 une éclosion de grippe A(H1N1) au Mexique s’est répandue mondialement et est devenue la pandémie A(H1N1)pdm09. Il devenait alors impératif d’étudier davantage ce virus influenza, notamment les sites antigéniques du virus qui sont les éléments clefs dans l’équilibre entre l’immunité des populations et la propagation du virus influenza. Pour étudier les sites antigéniques de la grippe A(H1N1)pdm09 et identifier leurs épitopes, leurs interactions et leurs immunodominances, nous avons créé des anticorps monoclonaux neutralisants (AcMoN) à l’aide de souris immunisées avec l’hémagglutinine recombinante du virus A(H1N1)pdm09. Les AcMoN obtenus ont été utilisés pour créer des mutants d’échappement in vitro. Nous avons ensuite introduit les mutations identifiées au sein des sites antigéniques de la HA1 par génétique inverse dans un virus réassortant (RG1) possédant six gènes du virus A/PR/8/34 (PA, PB1, PB2, M, NP et NS) et deux gènes (HA et NA) du virus pandémique A/Québec/144147/09. Ces virus ont été testés in vitro (par tests IHA et neutralisation) contre des sérums de furets immunisés contre le virus A(H1N1)pdm09 et in vivo (challenge infectieux ) chez des souris immunisées avec le vaccin influenza en vigueur au moment de l’étude puis infectées avec les virus mutants. D’autre part un AcMoN (appelé PN-SIA28) dirigé contre une portion conservée de la sous-unité HA2 responsable de la fusion du virus à la paroi cellulaire a également été testé quant à sa protection 24 heures post-infection sur des souris infectées avec les virus ; pandémique A/Québec/144147/09 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1) et A/Victoria/3/75 (H3N2). Ces études ont permis d’obtenir 33 AcMoN qui ont conduit à l‘identification de 11 mutations d’intérêt immunologique, dont 6 au sein de sites antigéniques (T89R, G157E, G172E, N173D, K180E et A212E) et 5 en marge de ceux-ci (F128L, K180E, K256E, R269K, N311T et G478E). L’obtention de trois variants différents au sein du site antigénique ‘Sa’ adémontré l’immunodominance de celui-ci. Les mutations créées au sein des sites antigéniques sur des virus réassortants 6:2 ont démontré un grand potentiel de glissement antigénique. En effet, les souris immunisées avec la souche vaccinale sauvage n’ont pas été protégées suite aux infections par le virus muté aux sites antigéniques de la HA (RG1). L’AcMoN PN-SIA28 dirigé contre la région HA2 a quant à lui démontré une protection sur les souris infectées avec les virus issus des groupe phylogénétiques 1 (H1N1) et 2 (H3N2) de la HA. L’étude des sites antigéniques du virus A(H1N1) tel que menée dans ces travaux nous permet d’anticiper des mutations futures qui pourraient apparaître naturellement et causer des épidémies ne pouvant être freinées par le vaccin actuel protégeant contre la souche A/California/07/2009. De plus, la thérapie basée sur des AcMoN hétéro-sous-typiques dirigés contre des épitopes conservés ouvre une perspective thérapeutique qui complémente l’aspect préventif découlant de l’étude des sites antigéniques du virus influenza. / Presently, our ability to prevent influenza through vaccination or to remediate it therapeutically is still nowadays partially efficient. The hypervariability and the transmission aspects of influenza virus allow it to infect worldwide populations despite pre-existing immunity acquired through exposition or vaccination. In 2009, a new A(H1N1) virus in Mexico spread worldwide and became the A(H1N1)pdm09 pandemic virus. Since then, it was becoming imperative to study more deeply this influenza virus, especially its antigenic sites which are key elements in the equilibrium between population immunity and influenza virus propagation. In order to study the antigenic sites of flu A(H1N1)pdm09 and to identify their epitopes, their interactions and their immunodominances, we have generated neutralizing monoclonal antibodies (NMAbs) with mice immunized with recombinant hemagglutinin from A(H1N1)pdm09. The MAbs obtained were used for in vitro generation of escape mutants. Afterward, we introduced the identified mutations within the antigenic sites of the HA1 through reverse genetics in a reassortant virus (RG1) possessing six genes from virus A/PR/8/34 (PA, PB1, PB2, M, NP and NS) and two genes (HA and NA) from virus A/Quebec/144147/09. These viruses were tested in vitro (by HAI and neutralization) against sera of ferrets immunized with A(H1N1)pdm09 virus and in vivo (infectious challenge) in mice vaccinated with the current vaccine then infected with the mutant viruses. From another perspective, a MAb (named PN-SIA28) directed against a conserved portion of the HA2 subunit responsible for viral fusion to the host cell membrane, was tested for its protective properties 24 hour post-infection in mice infected with A/Quebec/144147/09 (H1N1) virus, A/WSN/33 (H1N1) virus and A/Victoria/3/75 (H3N2) virus. The study allowed us to obtain 33 MAbs and identify 11 mutations of immunological interest, from which 6 were inside antigenic sites (T89R, G157E, G172E, N173D, K180E and A212E), and 5 were outside them (F128L, K180E, K256E, N311T and G478E). The obtaining of three different variants for one single antigenic site ‘Sa’ demonstrates its immunodominance. The mutations created within the antigenic sites in reassortant 6:2 viruses could lead to high antigenic drift potential since mice immunized with the wild-type vaccine strain were not protected following infections with the RG1 virus having its HA antigenic sites mutated. PN-SIA28 MAb directed against the HA2 region showed protection of mice infected with viruses derived from HA phylogenetic groups 1 (H1N1) and 2 (H3N2). Our work, could allow to anticipate future antigenic drift which could appear naturally and cause epidemics not controlled by the actual vaccine directed towards A/California/07/09. Moreover, a therapy based on MAbs directed against conserved epitopes opens a therapeutic perspective that complements the preventive vaccine approach.

Thèse de doctorat : Médecine. Médecine nucléaire : Nantes : 2003. / Thèse : 2003NANT03VS. Bibliogr. f. 143-170.

Thèse doctorat : Médecine : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 172-196.

Reproduction de : Mémoire du DES : Biologie médicale : Nantes : 2008. Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [123]-148. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. 228-255. Publié aussi en version électronique.

Th. 3e cycle--Biochim.--Lille 1, 1980. N°: 872.

Les mitochondries sont des organelles intracellulaires impliquées dans de nombreuses voies biologiques. Suite à la mort ou l’activation de certains types cellulaires, elles peuvent être relarguées dans le milieu extracellulaire où, elles sont reconnues comme des signaux de danger (DAMPS), générant une réponse pro-inflammatoire par le système immunitaire inné. Les interactions entre les mitochondries et l’immunité adaptative sont encore méconnues. Neuf classes d’anticorps anti mitochondriaux (AMA M1 à M9) ont été décrits différentes pathologies telles que la syphilis, la cirrhose biliaire primitive (CBP), le lupus érythémateux disséminé (LED) ou le syndrome des anti phospholipides (APS), sans que leur association avec l’expression clinique de ces maladies n’ait jamais été étudiée. Dans la présente étude, nous avons développé des méthodes de détection des AMA et anti-ADN mitochondrial (AMtDNA) puis étudié des corrélations entre la présence de ces anticorps et les caractéristiques de la maladie exprimées par des patients lupiques. Nous avons mis en évidence une association protectrice des AMA envers les évènements thrombotiques ainsi qu’une corrélation entre les niveaux d’AMtDNA et une élévation de l’index d’activité de la maladie (SLEDAI) en lien avec un accroissement des anticorps ciblant l’ADN double-brins (DsDNA). / Mitochondria are intracellular organelles that are involved in a vast number of biological pathways. They may be released in the extracellular milieu upon cell death or the activation of several types of cells where they will be recognized as danger signals (DAMPs), eliciting a pro-inflammatory response by the innate immune system. To this day, interplays between mitochondria and the adaptive branch of the immunity are poorly defined. Nine classes of anti mitochondrial antibodies (AMA M1 to M9) were reported in diseases such as syphilis, primary biliary cirrhosis (PBS), systemic lupus erythematosus (SLE) or the anti-phospholipid syndrome (APS) but their association to the clinical manifestations of these diseases have never been studied. In the present study, we developed methods for the detection of AMA and anti-mitochondrial DNA antibodies (AMtDNA) then studied correlations between the presence of these antibodies and clinical features expressed by lupus patients. We found a protective association of AMA towards thrombotic events and that AMtDNA levels correlates with an increase of the SLE disease activity index (SLEDAI) linked to an increase of the antibodies targeting double-stranded DNA (DsDNA).

Les symptômes de la maladie cœliaque sont déclenchés par l'ingestion de céréales contenant du gluten comme le blé, l'orge, le seigle et, dans de rares cas, l'avoine. Afin d’éviter ceux-ci, les personnes touchées doivent adopter un régime sans gluten. Pour être déclaré sans-gluten, un aliment ne doit pas contenir plus de 20 mg/kg de gluten. Ainsi, ces denrées doivent être analysées afin de garantir leur innocuité. Actuellement, des tests immunochimiques basés sur la reconnaissance de séquences protéiques de gluten sont utilisés. Cependant, des problèmes de sur- et de sous-estimation de la teneur exacte en gluten surviennent en fonction de la source de gluten analysée, c’est-à-dire selon la céréale. En cas de surestimation, cela réduit l’offre alimentaire des personnes cœliaques, mais en cas de sous-estimation, de graves conséquences affectent cette population. De plus, la réglementation canadienne exige une déclaration de la source du gluten sur l'étiquetage des produits préemballés, ce qui ne peut être réalisé adéquatement avec les moyens actuels. Ce travail porte sur le développement de nouveaux anticorps visant à discriminer les sources de gluten en utilisant des peptides synthétiques comme stratégie d'immunisation. Pour ce faire, 14 peptides synthétiques sélectionnés de séquences protéiques de gluten ont chacun été bioconjugués à une protéine porteuse et l'immunisation de lapins a été réalisée. Les anticorps polyclonaux (pAbs) résultants distinguent avec succès le gluten de blé, d'orge et d'avoine. Les pAbs dirigés contre le seigle réagissent également avec le gluten de blé et de seigle. Les résultats obtenus démontrent que la discrimination des sources de gluten peut répondre à la législation canadienne, mais aussi complémenter les tests immunochimiques actuels en nivelant les problèmes de sur- et sous-estimation de la teneur en gluten et améliorer davantage la sécurité des aliments destinés aux patients cœliaques. / Symptoms of celiac disease are triggered by ingesting grains that contain gluten like wheat, barley, rye, and, in rare cases, oats. In order to avoid symptoms, those affected should adopt a gluten-free diet. To be declared gluten-free, a food must not contain more than 20 mg / kg of gluten. Thus, these foods must be analyzed in order to guarantee their safety. Currently, immunoassays based on the recognition of gluten protein sequences are used. However, problems of overestimating and underestimating of the exact gluten content arise depending on the type of gluten being analyzed (wheat, barley, rye or oat). If gluten is overestimated, this reduces the food supply of celiac patients, but if underestimated, serious consequences then affect this population. In addition, Canadian regulations require a declaration of the source of gluten on the labelling of prepackaged products, which cannot be done adequately with current means. This work focuses on the development of new antibodies aimed at discriminating between sources of gluten using synthetic peptides as immunization strategy. To proceed, 14 synthetic peptides selected from gluten protein sequences were each bioconjugated to a carrier protein and rabbit immunization was performed. The resulting polyclonal antibodies (pAbs) successfully distinguish gluten from wheat, barley and oats. Rye pAbs react evenly with wheat and rye gluten. The results obtained demonstrate that the discrimination of gluten sources can meet Canadian legislation, but also complement current immunoassays by levelling the problems of over and underestimation of gluten content and further improve the safety of food intended for celiac patients.